专利名称：：一种抗副溶血弧菌耐热溶血毒素单克隆抗体及其制备方法
技术领域：
：本发明属于细菌监测和免疫学分析
技术领域：
，具体涉及ー种鼠来源杂交瘤细胞系和由该细胞系分泌的抗副溶血弧菌耐热溶血毒素单克隆抗体及其制备方法。
背景技术：
：耐热溶血毒素(thermostabledirecthemolysin,TDH)是副溶血弧菌(vibroparahaemoIyticus,VP)产生的ー种溶血毒素。是VP分泌的通行ニ聚体蛋白，不含糖或者脂质。TDH分子质量约46000，TDH为孔形成型毒素，对多种培养细胞与细胞毒性作用，具有潜在的心脏毒性作用，研究最多的是其溶血作用。TDH能使人、小白鼠、兔等红细胞(redbloodcell,RBC)溶血，但对马和羊的RBC不发生溶血。副溶血弧菌是ー种嗜盐性细菌，书弧菌科、弧菌属。存在于近海岸的海水和鱼类、贝类中，是ー种重要的食源性致病菌，食用虾、蟹、贝类等水产品所致副溶血弧菌食物中毒，起病急骤，常有腹痛、腹泻、呕吐、失水、畏寒及发热。腹痛多呈陈发性绞痛，常位于上腹部脐周或者盲部。腹泻每日320余次不等，大便性状多祥，多数为黄水样或黄糊便。越2%16%呈典型的血水或者洗肉水样便，部分病人的粪便可以为脓血样或者粘液血样。由于吐泻，患者常与是谁现象，重度失水者可伴声哑和肌痉挛，个别病人血压下降面色苍白或者发绀以至意识不清。近年来副溶血弧菌引起食物中毒的发生规模以及人群暴露规模呈明显上升趋势，已成为我国首要的食源性致病菌。对该菌致病机制的初歩研究发现其致病力主要有侵袭カ溶血毒素和尿素酶。流行病学调查表明其致病性与其溶血能力呈平行关系。主要是耐热溶血毒素耐热溶血毒素相关溶血毒素(TDH-relatedhemolysin,TRH)、不耐热溶血毒素(thermolabilehemolysin,TLH);临床上分离出的副溶血弧菌中95%都会产生直接耐热溶血毒素(TDH)，因而TDH被认为是该菌的ー种主要的毒理因子。目前应用在副溶血弧菌的检测方法有很多，其中也有针对副溶血弧菌的TDH检测方法，目前，副溶血弧菌的检测手段主要有分离培养技木、聚合链式反应技术(PolymeraseChainReaction,PCR)、免疫学方法等。常规的分离培养操作繁琐、周期较长，检测率较低；PCR方法虽然具有特异、敏感等特点，但其程序复杂，需要精密仪器与设备，不利于推广应用；在免疫学应用方面，应用在副溶血弧菌的方法主要有多克隆抗体检测、斑点ELISA等检测副溶血弧菌(窦勇，2006;臧红梅，2006)，都是以副溶血弧菌的菌体为抗原免疫动物得到抗血清，从而得到检测副溶血弧菌效果。这种方法也有它的局限性，具体体现在多克隆抗体受不同菌株、免疫剂量、实验动物、免疫时间、免疫血清储存时间等多种因素的影响，很难提供标准化的相关试剂，而单克隆抗体特异性强、均质性好、效果高、稳定廉价，比起多克隆抗体技术等免疫方法有明显的优越性。
发明内容本发明所要解决的技术问题之ー在于提供一种鼠来源杂交瘤细胞系，以制备抗副溶血弧菌耐热溶血毒素单克隆抗体。本发明所要解决的技术问题之ニ在于利用上述鼠来源杂交瘤细胞系来制备的由该细胞系分泌的抗副溶血弧菌耐热溶血毒素单克隆抗体。本发明所要解决的技术问题之三在于上述抗副溶血弧菌耐热溶血毒素单克隆抗体的制备方法。作为本发明第一方面的一种杂交瘤细胞系，该杂交瘤细胞系已于2011年01月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏号为CGMCCNo.4542，该杂交瘤细胞系的名称为T6D4，分类命名产抗溶血弧菌耐热直接溶血毒素TDH单克隆抗体细胞株，由源于被纯化的副溶血弧菌免疫过的BalB/c小鼠的B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的融合而成。作为本发明第二方面的一种鼠抗副溶血弧菌耐热溶血毒素的单克隆抗体，由所述杂交瘤细胞系分泌而得，该单克隆抗体可与副溶血弧菌耐热溶血毒素TDH发生免疫反应，经鉴定，蛋白亚型为IgG2a。作为本发明第三方面的一种鼠抗副溶血弧菌耐热溶血毒素的单克隆抗体的制备方法，是首先通过提取与纯化副溶血弧菌TDH，接着免疫BalB/c小鼠，而后利用B淋巴细胞杂交瘤技术获得一株能够稳定分泌TDH单克隆抗体的杂交瘤细胞系T6D4，其用于致病性副溶血弧菌的快速检测。该抗体为ー株稳定鼠源性杂交瘤细胞系所分泌的IgG2a:能够对TDH发生特异性反应。所述ー种鼠抗副溶血弧菌耐热溶血毒素的单克隆抗体的制备方法，具体步骤如下(I)免疫抗原TDH的制备利用多次层析方法，对以葡萄糖、Na2HPO3及胰蛋白胨和NaCl为主要组分的细菌培养液中的TDH进行提取与纯化，作为本发明的免疫抗原；(2)小鼠免疫和血清效价测定选择68周龄雌性BalB/c小鼠，利用步骤⑴得到的抗原进行免疫，利用间接ELISA方法測定小鼠血清中的抗体效价；(3)细胞融合与培养培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，与免疫小鼠的脾细胞进行混合，在聚こニ醇(PEG)介导下进行细胞融合，在含有HAT的15%FCS选择培养基中进行37°C，5%CO2培养；(4)杂交瘤细胞的筛选与克隆化用间接ELISA方法对培养细胞上清液筛选阳性杂交瘤细胞，用有限稀释法进行克隆化，得到杂交瘤细胞系；其中，有限稀释法的具体步骤为对要克隆的细胞进行计数，用细胞培养液进行稀释，稀释到细胞密度为10个/mL，然后加入到96孔板中进行培养，每孔O.lmL。(5)杂交瘤腹水的制备将第(4)步克隆的阳性杂交瘤细胞注入灭菌石蜡处理过的小鼠腹腔，获得小鼠腹水；(6)单克隆抗体特性的鉴定①抗体亲和カ的测定非竞争性ELISA测定单克隆抗体(mAb)的亲和常数，测定细胞上清液中的抗体密度，利用杂交瘤细胞培养上清液测其亲和常数；②单克隆抗体免疫球蛋白亚类的鉴定按照鼠源单克隆抗体亚类鉴定试剂盒(SigmaChemicalCo.)说明书进行；③单克隆抗体的特异性分析用弧菌科其他属不同菌株及非致病性副溶血弧菌(无耐热溶菌毒素TDH，含不耐热溶血毒素TLH)菌液包被酶标板，其余步骤按间接ELISA测定有无交叉反应；④杂交瘤细胞的稳定性测定将单克隆抗体细胞按照常规法冻存与复苏(司徒镇强等，《细胞培养》)，稳定传代，取细胞上清间接ELISA方法进行效价測定。本发明具有如下有益效果和实质性特点I、技术新颖，安全可靠；2、本发明可获得副溶血弧菌耐热溶血毒素特异性单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞，相比以往的多克隆抗体技术，此单克隆抗体根据免疫学原理检测副溶血弧菌时，只会和分泌TDH的致病性副溶血弧菌进行抗体与抗原的反应，对环境中的大部分非致病性副溶血弧菌没有免疫反应，特意识别性更强，且可稳定培养扩增，用其可容易开发定量检测致病性副溶血弧菌耐热溶血毒素的ELISA试剂盒，从而让建立对副溶血弧菌的快速准确检测的免疫学方法成为可能。3、本发明所制作的抗体对研究副溶血弧菌耐热弧菌溶血毒素的致病机理的研究提供帮助，为控制和治疗副溶血弧菌的感染提供科学依据。生物材料样品保藏信息如下，分类命名产抗溶血弧菌耐热直接溶血毒素TDH单克隆抗体细胞株保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号保藏日期2011年I月13日图ITDH溶血活性的测定结果示意图。图2IgG浓度标准曲线示意图。图3T6D4单抗的亲和カ测定结果示意图。图4T6D4单克隆抗体蛋白亚型鉴定结果示意图。图5抗体亚类检测试剂盒结果比对图。具体实施例方式应理解本发明所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行的描述，并非对本发明构思和范围进行限定，在不脱离本发明设计思想的前提下，本领域中工程技术人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入本发明的保护范围，本发明请求保护的技术内容，已经全部记载在权利要求书中。实施例I、鼠来源杂交瘤细胞系的建立(I)免疫抗原TDH的制备利用多次层析方法，对以葡萄糖、Na2HPO3及胰蛋白胨和NaCl为主要组分的细菌培养液中的TDH进行提取与纯化，作为本发明的免疫抗原；(2)小鼠免疫和血清效价测定选择68周龄雌性小鼠(BalB/c小鼠)，利用步骤⑴得到的抗原进行免疫，利用间接ELISA方法測定小鼠血清中的抗体效价；(3)细胞融合与培养培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，与免疫小鼠的脾细胞进行混合，在聚こニ醇(PEG)介导下进行细胞融合，在含有HAT的15%FCS选择培养基中进行37°C，5%CO2培养；(4)杂交瘤细胞的筛选与克隆化用间接ELISA方法对培养细胞上清液筛选阳性杂交瘤细胞，用有限稀释法行克隆化，得到杂交瘤细胞系；(5)杂交瘤细胞的稳定性测定将单克隆抗体细胞按照常规方法冻存与复苏(司徒镇强等，《细胞培养》)稳定传代，取细胞上清间接ELISA方法进行效价測定。实施例2、抗副溶血弧菌耐热溶血毒素(TDH)单克隆抗体的制备(I)免疫抗原TDH的制备①TDH粗蛋白的制作将致病性副溶血弧菌标准菌株ATCC33846(美国标准菌种收藏所保藏)接种于培养液中，每升培养液含5g葡萄糖、5gNa2HP03，10g胰蛋白胨以及30gNaCl，pH6.5_6.8;在37°C，180转/分，摇床培养15h后，经过离心去除菌体，每升上清液加入351g硫酸铵，盐析，离心，把沉淀溶解于PH7.O的O.01mol/L的磷酸缓冲液中，透析过夜，最后即得TDH的粗蛋白；②粗蛋白的纯化ADEAE-纤维素层析将先前已取得粗蛋白通过DEAE-纤维素层析住(2.6X60)进行纯化。加样要层析的样品首先用磷酸盐缓冲液(4°C)平衡过夜；而后将柱的上端打开，用吸管将纤维素柱上面的缓冲液吸出，不要吸净，留ー薄层液面，以免空气进入，加入样品，注意不要打乱纤维素表层；拧开下端的螺旋夹，让样品进入交换剂中，当样品将完全进入交换剂中，加入O.2mol/L的NaCl溶液到到达层析柱上沿，拧紧盖子；洗脱与收集先用500mlO.2mol/LNaCl的缓冲液进行洗脱，然后用IOOOml的从O.2到I.Omol/LNaCl的同样缓冲液进行梯度洗脱；分管收集并对每管应用考马斯亮蓝法測定其蛋白质浓度，及溶血活性的测试，得到具有溶血活性的洗脱液，測量其体积并以每IOOml加入40g硫酸铵的进行盐析；最后的沉淀物用少量的O.Olmol的磷酸盐缓冲液溶解并在同种缓冲液中透析；BDEAE-葡萄糖A-50层析小体积的粗蛋白用同样通过E-SephadexA-50层析膜(L6X60)进行进ー步纯化加样方法与DEAE-纤维素层析法相同；洗脱与收集洗脱液依次为500ml的O.2mol/LNaCl的磷酸盐缓冲液，800ml的O.2mol/LNaCl到I.OmoI/LNaCl的磷酸也缓冲液梯度洗脱；收集具有溶血活性的洗脱液，用PEG-20000把包含TDH的洗脱液浓缩到I.0-2.Oml之间。C葡聚糖G-75层析将通过两次层析所得的纯度较高的蛋白经过葡聚糖G-75层析柱(1.6X40)进行进ー步纯化；其平衡液与洗脱液都为O.01mol/L的tris-HCl缓冲液(ρΗ7·O);收集洗脱液透析去盐最后冷冻干燥去掉水分至粉末状；即为纯化的TDH，准确称量其质量；D溶血活性的测定用兔红细胞悬液測定副溶血弧菌TDH的溶血活性。在96V行孔板中，当底部没有红色沉淀物时即产生了溶血效应，反之，当底部有红色沉淀即为无溶血反应或者溶血反应不强。如图I所示，1、2号孔为纯化后的TDH的溶血反应结果，表明纯化后的TDH具有较强的溶血活性，其余为空白対照。(2)小鼠免疫和血清效价测定将制备好的TDH溶解到ρΗ7.40.01mol\L的PBS中作为免疫原免疫6_8周龄的雌性BalB/c小鼠，具体免疫细节见表I;表I动物免疫技术细节权利要求1.一种杂交瘤细胞系，其特征在于，该杂交瘤细胞系已于2011年Ol月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.4542，该杂交瘤细胞系的名称为T6D4,通过源于被纯化的副溶血弧菌耐热溶血毒素-TDH免疫过的BalB/c小鼠的B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合而成。2.一种鼠抗副溶血弧菌耐热溶血毒素的单克隆抗体，其特征在于，由权利要求I所述杂交瘤细胞系分泌而得，该单克隆抗体为一种能与副溶血弧菌耐热溶血毒素发生免疫反应的单克隆抗体，其制备过程如下(1)免疫抗原TDH的制备利用多次层析方法，对以葡萄糖、Na2HPO3及胰蛋白胨和NaCl为主要组分的细菌培养液中的TDH进行提取与纯化，得到所述的免疫抗原TDH；(2)免疫小鼠的脾细胞的制备选择68周龄雌性小鼠(BalB/c小鼠)利用步骤(I)得到的免疫抗原TDH进行免疫，分离得到免疫小鼠的脾细胞；(3)细胞融合与培养培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，与步骤(2)免疫小鼠的脾细胞进行混合，在聚乙二醇介导下进行细胞融合，在含有HAT的15%FCS选择培养基中进行37°C，5%CO2培养，分离培养细胞上清液；(4)杂交瘤细胞的筛选与克隆化用间接ELISA方法对步骤(3)的培养细胞上清液筛选阳性杂交瘤细胞，用有限稀释法进行克隆化，得到杂交瘤细胞系；(5)杂交瘤腹水的制备将第(4)步克隆的阳性杂交瘤细胞系注入灭菌石蜡处理过的小鼠腹腔，获得小鼠腹水；(6)单克隆抗体的纯化对步骤(5)得到的小鼠腹水，去上清，并用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，得到抗副溶血弧菌耐热溶血毒素单克隆抗体。3.如权利要求2所述的鼠抗副溶血弧菌耐热溶血毒素的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体蛋白亚型为IgG2a。4.一种鼠抗副溶血弧菌耐热溶血毒素的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤(1)免疫抗原TDH的制备利用多次层析方法，对以葡萄糖、Na2HPO3及胰蛋白胨和NaCl为主要组分的细菌培养液中的TDH进行提取与纯化，得到所述的免疫抗原TDH；(2)免疫小鼠的脾细胞的制备选择68周龄雌性小鼠(BalB/c小鼠)利用步骤(I)得到的免疫抗原TDH进行免疫，分离得到免疫小鼠的脾细胞；(3)细胞融合与培养培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，与步骤(2)免疫小鼠的脾细胞进行混合，在聚乙二醇介导下进行细胞融合，在含有HAT的15%FCS选择培养基中进行37°C，5%CO2培养，分离培养细胞上清液；(4)杂交瘤细胞的筛选与克隆化用间接ELISA方法对步骤(3)的培养细胞上清液筛选阳性杂交瘤细胞，用有限稀释法进行克隆化，得到杂交瘤细胞系；(5)杂交瘤腹水的制备将第(4)步克隆的阳性杂交瘤细胞系注入灭菌石蜡处理过的小鼠腹腔，获得小鼠腹水；(6)单克隆抗体的纯化对步骤(5)得到的小鼠腹水，去上清，并用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，得到抗副溶血弧菌耐热溶血毒素单克隆抗体。5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述单克隆抗体蛋白亚型为IgG2a。全文摘要本发明提供了一种鼠来源杂交瘤细胞系和由该杂交瘤细胞系分泌的抗副溶血弧菌耐热溶血毒素的单克隆抗体及其制备方法。所说的鼠抗副溶血弧菌耐热溶血毒素的单克隆抗体是通过提取与纯化副溶血弧菌耐热溶血毒素TDH后免疫Ba1B/c小鼠，然后利用B淋巴细胞杂交瘤技术获得一株杂交瘤细胞系T6D4稳定分泌的，其用于致病性副溶血弧菌的快速检测。该抗体为一株稳定鼠源性杂交瘤细胞系所分泌的IgG2a能够对TDH发生特异性反应。文档编号C12R1/91GK102676459SQ20111005657公开日2012年9月19日申请日期2011年3月9日优先权日2011年3月9日发明者张建,徐莉,晁若瑜,杨靖亚,赵勇,陆晓帆申请人:上海海洋大学,中国人民解放军防化指挥工程学院