专利名称：兔出血症病毒荧光定量rt-pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及一种兔出血症病毒的分子检测方法，具体地说，涉及一种兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测方法，其属于生物技术领域。
背景技术：
[ij IfiL^E (Rabbit hemorrhagic disease, RHD) ^ [ii(Rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV)引起的一种高度接触烈性传染病，传播快，发病急，发病率和致死率都很高，以呼吸系统出血、肝坏死、实质脏器水肿、淤血及出血性变化为特征， 是兔的一种毁灭性传染病，目前所有已测的兔的品种都表现出易感性。自然条件下，RHDV主要侵害成年兔，2月龄以下的仔兔自然感染时一般不发病。该病对养兔业造成巨大的经济损失，也严重威胁濒临灭绝的野兔品种。由此，RHDV引起了国内外学者高度重视，从形态学、 生物化学和分子生物学等各个方面系统的研究该病毒。RHDV在国际病毒分类委员会(ICTV) 2000年最新的第七次报告中被列入新成立的杯状病毒科(Caliciviridae)兔病毒属(Lagovirus)。RHDV为单股正链RNA病毒，其基因组由7437个核苷酸组成，分子量为2.4X 106-2.6X 106，5’端没有帽状结构，而是共价结合与感染相关的Vpg(virion protein, genome linked)蛋白，3’末端具有一个短的PolyA 尾。第l-9nt为5’非编码区，最后59nt为3’非编码区，含有两个开放阅读框架(ORF)，第 10-7044nt为ORFl编码的一个含有2344个氨基酸的多聚蛋白，该多聚蛋白经蛋白水解酶加工成主要衣壳蛋白VP60以及包括RNA聚合酶和蛋白酶在内的三个非结构蛋白。根据分析， 该病毒的RNA基因组结构与同科的猫嵌杯样病毒不一样，仅含有两个开放阅读框。RHDV的免疫原性蛋白、衣壳蛋白VP60，在诱导抗病毒感染的免疫反应中起重要作用，是病毒免疫保护性抗原。VP60基因全长1740bp，在病毒诱导机体的免疫反应中起主要作用，其核苷酸极端保守。RHDV是一种急性、高度致死性RNA病毒，在兔体内停留时间短，没有足够的时间让病毒发生有利于进化的变异，因此几十年中RHDV仍然能保持高序列同源性。目前，已有将分子生物学应用到RHDV诊断中的研究，其主要包括玻片凝集试验 (SHA)检测RHDV、酶联免疫吸附法(ELISA)检测RHDV、RT-PCR检测RHDV等，但上述这些方法存在敏感性低、可重复性差、结果判定易受多种因素影响、处理耗时多等问题。焚光定量 PCR (fluorescence quantitative polymerase chain reaction),又禾尔实时定量(real-time quantitative) PCR。这种技术是在PCR技术基础上发展起来的高度灵敏的核酸定量技术。它是一种在PCR体系中引入了荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使PCR扩增和终产物检测全处在封闭的条件下进行，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析方法，具有实时监测、无污染、快速、灵敏、精确、特异等特点，极大的克服了传统PCR技术普遍存在的假阳性及不能定量等问题，其最主要的优势是能对待测样本起始PCR反应模板进行准确定量，扩大了 PCR的应用范围，使得PCR技术更广泛的应用于临床，在监测患者病情、预后、指导用药等方面。目前已广泛应用于分子生物学研究和医学
3研究等领域。TaqMan探针技术是由美国Perkin Elmer (PE)公司研发的一种实时PCR技术，它在一条20bp左右的寡核苷酸探针的5’端标记荧光报告基团(Itep0rter，R)，3’端标记荧光淬灭基团(QuenCher，Q)，其序列与两引物包含序列内的一段DNA模板完全互补。当这条探针保持完整时，Q和R基团由于距离很近(7-lOnm)，Q基团将淬灭R基团发出的荧光信号，即报告基团发出的荧光能被淬灭基团所吸收。PCR反应后，随着链的延伸，Taq酶沿着DNA模板移动到荧光标记探针结合位置，发挥其5’ -3’外切核酸酶活性，将荧光探针切断，Q基团由于距离较远而失去对报告荧光的淬灭作用，R基团的荧光信号得以释放而被检测仪所捕获。如果在PCR过程中，探针序列与模板序列不能互补，探针仍然是游离的，未杂交的探针仍然保持完整，荧光信号也就不能被检测到，从而保证了扩增的特异性。常用的荧光报告基团有 FAM、JOE、HEX、Texas-Red 等，淬灭基团有 TAMRA、Eclipse 等。
发明内容
本发明的目的在于提供用于兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测的引物和TaqMan 探针。本发明的另一目的在于提供用于兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测的试剂盒。本发明的目的还在于提供兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测方法。为了实现本发明的目的，本发明的用于兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测的引物，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1和2所示；本发明的用于兔出血症病毒荧光定量RT-PCR 检测的TaqMan探针(荧光探针VP60p)，其核苷酸序列如SEQ IDNo. 3所示，本发明所述的TaqMan探针，其5’端的荧光基团为FAM，3’端的荧光猝灭基团为 TAMRA0本发明根据GenBank (GenBank注册号FJ794180) RHDV VP60衣壳蛋白基因序列设计筛选出PCR引物，并确认了各引物的特异性。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。该引物对的扩增片段长度为96bp。本发明还提供含有如权利要求1所述的引物和TaqMan探针的兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒。所述试剂盒还包括扩增缓冲液、DNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂和dNIPs。本发明还提供兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测方法，其采用一步法RT-PCR方法进行检测，包括如下步骤1)提取待测样品的RNA ；2)以步骤1)提取的RNA作为模板，用上述核苷酸序列如SEQ IDNo. 1和2所示的引物和TaqMan探针VP60p，采用一步法RT-PCR方法进行荧光定量PCR检测，根据荧光定量扩增曲线判定样品检测结果。其中，步骤1)中所述样品为兔的肝组织、血液、分泌物或排泄物，所述样品还可以是用福尔马林固定或石蜡包埋的兔的肝组织。步骤2)中的RT-PCR反应体系为 每25 μ L反应液中含有2 X Quant 一步法荧光定量RT-PCR试剂盒12. 5 μ L、2. 5U/ μ L Hotmaster DNA 聚合酶 1 μ L、4U/μ L Quant 反转录酶 0. ；35 μ L、10 μ mol/L 的上下游引物各 0. 5 μ L、10 μ mol/L 的探针 0· 5 μ L、RNA模板 1 μ L,不含 RNA酶的水(RNase-free ddH20) 补足至25 μ L0RT-PCR 反应条件为50°C、30min，92°C、3min，92°C、10s，56°C、20s，68°C、20s，40
个循环。为了便于分析检测结果，可在RT-PCR扩增步骤中使用阳性标准品和阴性对照，所述阴性对照是以DEPC处理的水代替RNA模板；所述阳性标准品按如下步骤得到1)提取RHDV病毒RNA，用核苷酸序列如SEQ ID No. 4和5所示的引物，进行一步法RT-PCR扩增，得到目的片段；然后将该目的片段克隆到pGEM-T fesy载体上，转入感受态细胞大肠杆菌DH5 α，提取白斑阳性质粒；2)对提取的质粒进行Mc I酶切，使质粒DNA线性化，然后在T7RNA聚合酶作用下体外转录RNA，作为阳性标准品。上述PCR引物是根据GenBank(GenBank注册号FJ794180)RHDVVP60衣壳蛋白基因序列设计筛选、经上海英骏生物技术有限公司合成得到的，使用BLAST检索，确认各引物的特异性。该引物对的扩增出的目的片段长度为MObp，位于RHDV的VP60基因内部，该序列为保守序列，240bp的片段与预期大小一致，且包含上述用核苷酸序列如SEQ ID No. 1和2 所示的引物扩增出的96bp的片段。此外，将切胶回收的目的片段与pGEM-T fesy载体连接， 转入感受态细胞DH5 α，进行蓝白斑筛选，挑取白斑摇菌后送公司测序，经测序表明VP60重组质粒序列正确，为阳性重组质粒，可用于后续试验。本发明中检测结果的判定标准为对样品进行荧光定量RT-PCR检测时，出现扩增曲线，即表明样品感染了兔出血症病毒；没有扩增曲线的扩增，则说明没有感染该病毒。本发明的优点在于1、采用一步法RT-PCR检测技术，在一管内连续完成反转录和定量PCR扩增，完全闭管扩增和检测，提高临床诊断依据的可靠性，减少多重操作污染的可能性，易于操作，减少加样过程中的体积损耗，保证结果的可信性，反转录得到的所有cDNA样品都用来扩增， 灵敏度更高。2、在荧光PCR仪上进行扩增和检测，无需电泳或是其他PCR后处理，有效的防范了 PCR扩增产物的污染，避免假阳性结果，避免了溴化乙锭或同位素对人体及环境的危害。只需2小时即可完成PCR过程，有利于提高报告数据的速度，无人为判断，仪器自动收集和分析数据。3、本发明的RHDV TaqMan荧光定量RT-PCR方法对VP60具有高特异性；且操作简单、快速，稳定性、重复性良好，结果一目了然；实现了实时检测，能够直观的了解整个PCR 过程的动态变化。4、本发明的荧光定量RT-PCR检测方法除能从病毒含量最高的肝组织中检测到 RHDV，还能从感染RHDV致死兔的其它组织中扩增出特异性片段，可用于检测RHDV在兔体内各组织中的动态分布。该方法还可以用于检测活兔的血液、分泌物、排泄物，以及福尔马林固定或石蜡包埋样品等是否含有病RHDV ；国外有报道苍蝇、跳蚤、蚊子等可能起着机械传播RHDV的作用，故该方法还可检测苍蝇、跳蚤、蚊子等媒介体内是否含有RHDV。本发明建立的检测RHDV的荧光定量RT-PCR方法为兔出血症的早期确诊和分子流行病学调查奠定基石出。
图1为本发明目的片段MObp序列PCR扩增电泳结果；其中，M:标记、1 目的产物； 2 阴性对照。图2为本发明目的片段347bp序列PCR扩增电泳结果；其中，M 标记、1 目的产物； 2 阴性对照。图3为本发明不同质粒拷贝数的荧光检测结果。图4为本发明的荧光定量RT-PCR标准曲线。图5为本发明的兔肝组织样品的荧光定量RT-PCR检测结果。图6为本发明的对活兔血液样品的荧光定量RT-PCR检测结果。图7为不同引物用量时的荧光定量RT-PCR检测结果图8为本发明的荧光定量RT-PCR特异性检测结果。
具体实施例方式以下通过具体实施例来进一步说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1阳性标准品的制备1) RHDV病毒提取RNA，用核苷酸序列如SEQ ID No. 4和5所示的引物，进行一步法 RT-PCR扩增，得到MObp目的片段(如图1所示)；PCR反应体系为每25 yL反应液中含有10XRT-PCR缓冲液2. 5 μ L、超纯dNTP混合物(各 IOmM) 1 μ L、5 X RT-PCR 增强剂 5 μ L、40U/ μ L RNA 酶抑制剂 0. 25 μ L、2. 5U/ μ L Hotmaster DNA聚合酶1. 25 μ L、Quant反转录酶0. 25 μ LU0mmol/L的上下游引物各0. 5 μ L、RNA模板 1 μ U RNase-freeddH20 补至 25 μ L ；PCR 反应条件为50°C、30min，94°C、2min，94°C、lmin，51. 7°C、lmin，65°C、lmin， 扩增35个循环，65°C、IOmin ；2)然后将该目的片段克隆到PGEM-T Easy载体(购自Promega公司)上，转入宿主细胞大肠杆菌DH5 α (购自北京全式金生物技术有限公司)，阳性克隆经PCR鉴定后测序， 测序结果表明为目标序列。将鉴定正确的基因片段抽提质粒DNA ；3)对提取的质粒进行Mc I酶切，使质粒DNA线性化，然后在T7RNA聚合酶作用下体外转录RNA ；Sac I序列为5，-GAGCTC-3，，反应体系为RE IOX缓冲液2 μ L、乙酰化的BSA 0. 2 μ L、质粒 DNA 2. 3 μ LUOU/μ L Sac I 0· 5 μ L、ddH20 补加至 20 μ L ；反应条件为37°C
温度下孵育Ih。T7 启动子序列为 5，-TAATACGACTCACTATA-3，；反应体系为Transcription Optimized 5X Buffer (5 倍优化转录缓冲液)4 μ L ；DTT2 μ L、Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor (RNasin 重组核糖核酸酶抑制剂)0. 5 μ L ；rATP、rGTP、rUTP 和 rCTP混合物4 μ L ；线性化DNA 8 μ L ； 19U/ μ L T7RNA聚合酶1 μ L ；DEPC水补加至20 μ L ；反应条件为37°C温度下孵育lh，然后加入RQl 0. 5 μ L，37°C温度下孵育15min ；4)经RNA Marker检测上述体外转录RNA长度为347bp (如图2所示)，用紫外分光光度计测得上述体外转录RNA浓度为908. Ing/yL，计算出拷贝数；稀释其拷贝数为 1. OX IO12拷贝/y L，然后根据拷贝数将质粒10倍倍比稀释成含IO6-IO1拷贝/y L，作为阳性标准品。RNA纯度=A26tZA28tl (1.8-2.0之间，小于1. 8提示有残余蛋白质，大于2. 0提示有 RNA降解)。实施例2标准曲线绘制根据GenBank (GenBank注册号FJ794180) RHDV VP60衣壳蛋白基因序列设计筛选出PCR引物，并确认了各引物的特异性，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 1和2。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。该引物对的扩增片段长度为96bp。以实施例1得到的阳性标准品作为模板，用核苷酸序列如SEQ IDNo. 1和2所示的引物和荧光探针VP60p，采用一步法RT-PCR方法进行检测。检测结果如图3所示。上述 RT-PCR中反应体系为每 25 μ L 反应液中含有2 X Quant One Step Probe qRT—PCR Master Mix (Quant 一步法荧光定量RT-PCR试剂盒(探针法))12. 5μ L、2. 5U/ μ LHotmaster DNA聚合酶1 μ L、 4U/ μ L Quant反转录酶0. 35 μ LUOy mol/L的上下游引物各0. 5 μ L、10 μ mol/L的探针各 0. 5 μ L、RNA模板1 μ L，不含RNA酶的水补足至25L。RT-PCR 反应条件为50°C、30min，92°C、3min，92°C、10s，56°C、20s，68°C、20s，扩
增40个循环。上述RT-PCR中反应模板浓度依次为IO6 IO1拷贝/ μ L，反应的灵敏度为IO1拷贝/ μ L，在IO6 IO1拷贝/ μ L浓度范围内有极好的线性关系。结果如图4所示。实施例3对兔肝组织样品的检测
1、提取兔肝组织样品的RNA取RHDV分离株(购自江苏农业科学院)100倍稀释液0. 2mL,肌肉注射3月龄未免疫兔。3日后部分兔出现死亡，取10只死亡兔的肝脏组织，分别使用RNApr印pure动物组织总RNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)提取兔肝组织样品。(1)将200mg肝组织加300 μ L裂解液RL，彻底研磨成勻浆，加入590 μ L RNase-free ddH20 禾Π 10 μ L 蛋白酶 K，混勻后 56°C处理 IOmin。(2)将所得液体12000rpm离心5min，取上清。(3)上清液缓慢加入200μ L无水乙醇，混勻，得到溶液和沉淀一起放入吸附柱中， 12000rpm离心lmin，弃去废液，将吸附柱放回收集管中。(4)向吸附柱中加入350 μ L去蛋白液RW1，12000rpm离心lmin，弃废液，将吸附柱
放回收集管中。(5)吸附柱中加入80 μ L的DNase I工作液，室温放置15min。(6)吸附柱中加入350 μ L去蛋白液RWl，12000rpm离心lmin，弃废液，将吸附柱放
回收集管中。(7)向吸附柱中加入500 μ L漂洗液RW，室温静置2min，12000rpm离心lmin，弃废
液，将吸附柱放回收集管中，并重复此步骤一次。(8) 12000rpm离心2min，弃废液，吸附柱室温放置5min，转入新的RNase-free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加40 μ L的RNase-free ddH20,室温放置2min，12000rpm离心2min，得到RNA溶液。2、以上述RNA作为模板，以DEPC处理的水代替RNA模板作为阴性对照，采用一步法RT-PCR方法进行检测，反应体系及反应条件与实施例2相同，根据荧光定量扩增曲线判定样品检测结果。结果如图5所示。来自10只死亡兔的肝组织样品的RNA都呈现出扩增曲线，检出率为100%，说明该荧光定量RT-PCR方法可以准确检测兔出血症病毒。实施例4对活兔血液样品的检测1、提取兔血液样品的RNA取RHDV分离株100倍稀释液0. 2mL，肌肉注射3月龄未免疫兔。3日后部分兔出现死亡，对未死亡的12只兔采血，使用RNApr印pure血液总RNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)分别对12份兔血液提取血液样品。(1)将200 μ L血液样品加1000 μ L的1 X红细胞裂解液，冰上孵育20min，在孵育过程中，涡旋振荡混勻2次。(2)将所得液体4°C 2IOOrpm离心lOmin，留沉淀。(3)向白细胞沉淀中，加入IX红细胞裂解液，重悬细胞。(4)所得液体4°C 2IOOrpm离心lOmin，留沉淀。(5)向白细胞沉淀中，加入500 μ L裂解液RL，混勻。(6)将溶液转移至过滤柱中，12000rpm离心2min，弃去过滤柱，收集滤液。(7)向滤液中加入500 μ L的70%乙醇，混勻，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱中，12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。(8)向吸附柱中加入35(^1^去蛋白液，12000印111离心11^11，倒掉收集管中的废液， 将吸附柱放回收集管中。(9)向吸附柱中央加入80 μ L的DNase I，室温放置15min。(10)向吸附柱中央加入350yL去蛋白液，12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。(11)向吸附柱中加入500 μ L漂洗液，室温静置2min，12000rpm离心lmin，倒掉收
集管中的废液，将吸附柱放回收集管中，重复此步骤一次。(12) 12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱置于室温放置5min，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。(13)将吸附柱转入一个新的RNase-free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴力口 40 μ L 的 RNase-free ddH20,室温放置 2min, 12000rpm 离心 2min,得到 RNA 溶液。2、以上述RNA作为模板，以DEPC处理的水代替RNA模板作为阴性对照，采用一步法RT-PCR方法进行检测，反应体系及反应条件与实施例2相同，根据荧光定量扩增曲线判定样品检测结果。结果如图6所示。血液样品的RNA都呈现出扩增曲线，检出率为100%，说明该荧光定量RT-PCR方法可以准确检测兔出血症病毒。 试验例IRT-PCR中引物用量的优化 引物的浓度是影响PCR反应的关键因素，若浓度太低，会使反应不完全；若引物太多，则发生错配及产生非特异产物的可能性会大大增加，还会使背景荧光值增加。非特异性产物和引物二聚体也多与靶序列竞争DNA聚合酶、dNTP底物，从而使靶序列的扩增量降低。 本试验例按下述方法对引物终浓度(引物用量)进行优化。按实施例1方法制得浓度为908. Ing/ μ 1的体外转录RNA，计算得到 4.6X1012copy，然后倍比稀释。取IO4Copy的体外转录RNA为模板，用核苷酸序列如SEQ IDNo. 1和2所示的引物和荧光探针VP60p，采用一步法-荧光定量RT-PCR方法进行检测。上述RT-PCR中反应体系为将核苷酸序列如SEQ ID No. 1和2所示的引物 (ΙΟμπιοΙ/L)按体积比1 1混合，依次向反应体系中加入0.5“1^、1“1^、1.5“1^、2口1^、 4μ L ；其余试剂及用量与实施例2中的反应体系相同，用实施例2的反应条件进行一步 RT-PCR检测，结果如图7所示。根据最大荧光信号强度和最小Ct值综合考虑，确定最佳引物用量为Ι.Ομ 1，即引物的终浓度分别为0. 4 μ mol/L。试验例2特异性考核分别用4种菌液作为模板，在实施例2相同的条件下进行一步法RT-PCR检测，每次扩增设阴阳性对照，鉴定探针法荧光定量方法的特异性，结果如图8所示。这4份菌液分别为兔水疱性口炎病毒细胞毒、轮状病毒细胞毒、仙台病毒、RHDV0 (兔水疱性口炎病毒细胞毒、轮状病毒细胞毒、仙台病毒均购自江苏省农科院)结果表明RHDV有扩增，呈阳性，而兔水疱性口炎病毒细胞毒、轮状病毒细胞毒、 仙台病毒没有扩增，均呈阴性，表明特异性很好，可以用于兔出血症病毒的检测。虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方案及试验例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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权利要求
1.用于兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测的引物，其核苷酸序列如SEQID No. 1和2 所示。
2.用于兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测的TaqMan探针，其核苷酸序列如SEQID No. 3所示。
3.如权利要求2所述的TaqMan探针，其特征在于，所述TaqMan探针的5’端的荧光基团为FAM，3’端的荧光猝灭基团为TAMRA。
4.含有如权利要求1所述的引物以及权利要求2或3所述TaqMan探针的兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括扩增缓冲液、DNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂和dNIPs。
6.一种兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤1)提取待测样品的RNA；2)以步骤1)提取的RNA作为模板，用权利要求1所述引物和TaqMan探针，采用一步法 RT-PCR方法进行荧光定量PCR检测，根据荧光定量扩增曲线判定样品检测结果。
7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤1)中所述样品为兔的肝组织、血液、分泌物或排泄物。
8.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述样品为用福尔马林固定或石蜡包埋的兔的肝组织。
9.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤2)中的RT-PCR反应体系为每25 μ L反应液中含有2 X Quant 一步法荧光定量RT-PCR试剂盒12. 5 μ L、2. 5U/ μ L Hotmaster DNA聚合酶1 μ L、4U/μ L Quant反转录酶0. 35 μ L、10 μ mol/L的上下游引物各 0. 5 μ L、10 μ mol/L的探针0· 5 μ L、RNA模板1 μ L，不含RNA酶的水补足至25 μ L。
10.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤2)中的RT-PCR反应条件为 50°C、30min，92°C、3min，92°C、10s，56°C、20s，68°C、20s，40 个循环。
全文摘要
本发明提供了用于兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测的引物和TaqMan探针。本发明还提供了含有上述引物和探针的试剂盒，以及使用上述引物和探针采用一步法RT-PCR检测兔出血症病毒的方法。本发明采用一步法RT-PCR检测技术，在一管内连续完成反转录和定量PCR扩增，完全闭管扩增和检测，减少了多重操作污染的可能性，易于操作，减少加样过程中的体积损耗，保证结果的可信性，反转录得到的所有cDNA样品都用来扩增，灵敏度更高。
文档编号C12Q1/70GK102154512SQ201110062529
公开日2011年8月17日 申请日期2011年3月15日 优先权日2011年3月15日
发明者孙卫东, 林祥梅, 武昱孜, 苏国清, 贾广乐 申请人:中国检验检疫科学研究院