专利名称：一种检测猪博卡病毒的pcr方法
技术领域：
本发明属于动物病毒学与动物传染病学技术领域。具体涉及一种对猪博卡病毒进行检测的PCR方法。
背景技术：
博卡病毒(Bocavirus)是细小病毒科、细小病毒亚科、博卡病毒属的成员。人博卡病毒最早于2005年在患有下呼吸道疾病的瑞典儿童体内被鉴定(Allander等Cloning of a human parvovirus by molecular screening of respiratory tract samples. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005，102: 12891-12896)。其基因组大小为 5. 2kb 左右，为单股线状DNA。目前已有许多国家报道了人博卡病毒的流行(Allander，Human bocavirus. J. Clin. Virol, 2008， 41:29—33)。2009年，瑞典科学家利用随机多重置换扩增方法在患有断奶仔猪多系统衰竭综合征的猪淋巴结中扩增出了一段长1879 bp的核苷酸序列，该段序列与已知病毒序列比较，发现其完整的NPl基因及部分VP1/VP2基因与人类博卡病毒相近，故将该病毒归类为细小病毒科、细小病毒亚科、博卡病毒属的猪博卡病毒(Porcine bocavirus, PBoV) (Blomstrom^ Detect ion of a novel porcine boca-like virus in the background of porcine circovirus type 2 induced postweaning multisystemic wasting syndrome. Virus Res. 2009, 146:125-129)。目前，猪博卡病毒在患病猪中被发现，而在健康猪体内的检出率较低，在患有断奶仔猪多系统衰竭综合征的患病猪中其检出率高达88%(Blomstrom等Studies of porcine circovirus type 2, porcine boca-like virus and torque teno virus indicate the presence of multiple viral infections in postweaning multisystemic wasting syndrome pigs. Virus Res. 2010, 152: 59-64)。而且，猪博卡病毒常与猪圆环病毒2型 (PCV2)、猪输血传播病毒(TTV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等发生混合感染，这表明该病毒对断奶仔猪多系统衰竭综合征的发生起着某种作用。2009年，在我国猪群中也发现了猪博卡病毒，其感染率高达38%，表明猪博卡病毒在我国猪群中广泛存在(Zhai等High prevalence of a novel porcine bocavirus in weanling piglets with respiratory tract symptoms in China. Arch Virol. 2010，155:1313-1317)。通过对其全长基因组的测序，发现我国所流行的猪博卡病毒与瑞典的毒株同源性较高。到目前为止，对猪博卡病毒在除瑞典和中国以外的世界其它地方的存在与流行情况一无所知。现如今，对猪博卡病毒还没有获得一致认可的敏感且特异的检测方法。因此，基于以上的研究和当前的需求，申请人根据猪博卡病毒的全基因组序列 (GenBank登录号HQ223038)，设计并合成了一对检测猪博卡病毒的引物，建立了检测猪博卡病毒的PCR方法，并发现了该病毒确实存在于我国猪群当中。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种操作简单、特异性强、敏感性高、成本低的检测猪博卡病毒的 PCR方法。技术方案
参考GenBank登录的猪博卡病毒基因组序列(GenBank登录号HQ223038)，设计检测猪博卡病毒PCR方法的引物，其上、下游引物序列分别为SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2
上游引物MPBoV-F 5，- GGGCGAGAACATTGAAGAGGTTGA _3，，在基因组中的位置为 3136-3159 bp ；
下游引物MPBoV-R 5，- CCCCATGGTGTTCTTATTCCGTTC _3，，在基因组中的位置为 3385-3408 bp。检测猪博卡病毒的PCR方法，包括以下步骤
(1)猪博卡病毒DNA的提取取472.5 μ 1血清，或取100 mg的动物组织，加入1 ml PBS缓冲液进行充分研磨，-20°C反复冻融3次，8000 rpm离心10分钟，取上清液472. 5 μ 1， 加入10% SDS 25 μ 1,20 mg/ml蛋白酶K 2. 5 μ 1，混合均勻后置于37°C消化过夜或50°C 水浴4小时，加入等量酚氯仿异戊醇(25: : 1)抽提2次，取上清加2倍体积预冷的无水乙醇于_20°C放置1小时，12000 rpm离心10分钟。弃去上清，沉淀于干燥箱干燥后用20 μ 1超纯水溶解，即为检测用DNA模板。提取的DNA模板于_70°C保存备用；
(2)将上、下游引物与PCR混合液加入PCR反应管中，混合后加入待检样品DNA；
(3)将PCR管置于PCR扩增仪中进行循环；
(4)取PCR产物于1%琼脂糖凝胶上电泳；
结果判定有扩增产物约为270 bp条带，为阳性；无扩增产物约为270 bp条带，判为阴性。步骤(2)所述的PCR混合物包括采用25 μ 1的PCR反应体系，在0. 2 ml PCR反应管中分别加入 10XPCR 缓冲液 2. 5 μ l,dNTP (2. 5 mM)l. 0 μ IjMgCl2 (25 mM)l. 5 μ 1， 上、下游引物各0.5 μ1,5υ/μ1 Taq DNA聚合酶0. 5 41，0嫩模板1 μ ，用灭菌超纯水加至总体积，混勻。步骤(3)的扩增条件为94°C，5分钟，进行预变性；然后94°C，1分钟， 53°C，1分钟，72°C，1分钟，共循环35次；最后72°C延伸10分钟。本发明检测猪博卡病毒的PCR方法，阳性对照品为含有VP1/2基因的标准阳性质粒(PMD-BVP12)，由本专利所涉及PCR扩增的约270 bp产物连接到克隆载体pMD18_T(大连宝生物工程有限公司)制备而成，经测定其浓度为2. 35X IO12 copies/μ 1。有益效果
本发明根据GenBank中发表的有关猪博卡病毒的序列(GenBank登录号HQ223038 )，经过序列比对分析，选取VP1/2基因中保守的片段设计并合成一对特异性引物，对猪博卡病毒进行PCR扩增，得到约270 bp的特异性条带。本研究建立的猪博卡病毒检测PCR方法对其他常见动物病原体(猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病毒、猪Hokovirus、猪输血传播病毒、乙型脑炎病毒、猪Cnvirus)均无反应；敏感性试验表明，最小检出量为IO3 copies。猪博卡病毒感染猪的血清、粪便、肺脏、扁桃体、淋巴结等DNA提取物用本发明建立的PCR方法检测，均扩增出大小约270 bp的DNA片段，适用于临床检测。
图1 检测猪博卡病毒的PCR方法特异性试验电泳结果图，其中泳道1为猪博卡病毒；泳道2-9分别为猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病毒、 猪Hokovirus、猪输血传播病毒、乙型脑炎病毒、猪Cnvirus ；M表示DNA Marker (DL2000)。图2 检测猪博卡病毒的PCR方法敏感性试验电泳结果图，其中泳道1为未稀释的含VP1/2基因的标准阳性质粒；泳道2-13为连续10倍稀释的模板；M表示DNA Marker (DL2000)。
具体实施例方式实施例1
临床采集的猪血清和肝脏，进行猪博卡病毒的检测，具体步骤如下 (1 )DNA的提取取472. 5 μ 1血清，或取100 mg的动物组织，加入1 ml PBS缓冲液进行充分研磨，_20°C反复冻融3次，8000 rpm离心10分钟，取上清液472. 5 μ 1，加入10% SDS 25 μ 1,20 11^/1111蛋白酶1(2.5 μ 1，混合均勻后置于37°C消化过夜或50°C水浴4小时，加入等量酚氯仿异戊醇(25: : 1)抽提2次，取上清加2倍体积预冷的无水乙醇于-20°C 放置1小时，12000 rpm离心10分钟。弃去上清，沉淀于干燥箱干燥后用20 μ 1超纯水溶解，即为检测用DNA模板。提取的DNA模板于-70°C保存备用；
(2)采用25 μ 1的PCR反应体系，在0. 2 ml PCR反应管中分别加入10XPCR缓冲液 2.5 μ l,dNTP (2. 5 mM)l. 0 μ IjMgCl2 (25 mM)l. 5 μ 1，上、下游引物各 0· 5 μ l,5U/y 1 Taq DNA聚合酶0.5 yl，DNA模板1 μ 1，用灭菌超纯水加至总体积，混勻。(3) PCR扩增条件为94°C，5分钟，进行预变性；然后94°C，1分钟，53°C，1分钟， 72°C，1分钟，共循环35次；最后72°C延伸10分钟。(4)取10 μ 1上述的PCR产物于1%琼脂糖凝胶上电泳，结果血清和肝脏组织扩增产物均约为270 bp，结果大小相符，判为猪博卡病毒阳性。实施例2
按实施例1方法，以猪博卡病毒阳性病料作为阳性对照，分别对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病毒、猪Hokovirus、猪输血传播病毒、乙型脑炎病毒、猪Cnvirus进行检测，结果均未能扩增出任何条带，而猪博卡病毒阳性病料扩增出约 273bp的条带，见图1。其序列为SEQ ID NO. 3
GGGCGAGAACATTGAAGAGGTTGAAGTGGATACAGGTGCGGGAAGTGGGCGGTCAGGCGGTGGCGGAGGAGG TGGAGGAGGAGGAGGCTCTACAAATGGAGGAATTGGAATGGCAACAGGAGGTTGGGTTGGAGGAACATACTTTGGAA AAAACAAAATAGTAACAAACATAACACGTCAATGGTACGTGCCGATATATAACGGCCACAAATACACAAAACAGACA GAAACAGATAATACTAACTTTTGGAACGGAATAAGAACACCATGGGG。实施例3 敏感性试验
含有VP1/2基因的标准阳性质粒(pMD-BVP12)，由本专利所涉及PCR扩增出的273 bp产物连接到克隆载体PMD18-T (大连宝生物工程有限公司)制备而成，经测定其浓度为 2. 35 X IO12 copies/μ 1。 将阳性质粒pMD_BVP12 (IO12 copies)用配置的TE (PH8. 0) 10倍递增稀释作为模板，每个稀释度各取2 μ 1作为模板，按实施例1方法进行检测，观察阳性条带，以出现阳性预期条带所用模板量的最高稀释度计算其敏感性，结果表明最小检出量为IO3 copies，见图2。
权利要求
1.检测猪博卡病毒的引物其上、下游引物序列分别为SEQID NO. 1和SEQ ID NO.2。
2.权利要求1所述引物用于检测猪博卡病毒的PCR方法，包括以下步骤(1)猪博卡病毒DNA的提取取472.5 μ 1血清，或取100 mg的动物组织加入1 ml PBS 缓冲液进行充分研磨，-20°C反复冻融3次，8000 rpm离心10分钟，取上清液472. 5 μ 1，加入10% SDS 25 μ 1,20 mg/ml蛋白酶K 2. 5 μ 1，混合均勻后置于37°C消化过夜或50°C水浴 4小时，加入等量的体积比为25:24:1的酚氯仿异戊醇抽提2次，取上清，加2倍体积预冷的无水乙醇于_20°C放置1小时，12000 rpm离心10分钟，弃去上清，沉淀于干燥箱干燥后用20 μ 1超纯水溶解，即为检测用DNA模板；(2)将上、下游引物与PCR混合液加入PCR反应管中，混合后加入待检样品DNA；(3)将PCR管置于PCR扩增仪中进行循环；(4)取PCR产物于质量比为1%的琼脂糖凝胶上电泳；(5)结果判定有扩增产物约为270bp条带，为阳性，即猪博卡病毒存在；无扩增产物约为270 bp条带，判为阴性，即猪博卡病毒不存在；其中步骤(2)所述的PCR混合液包括采用25 μ 1的PCR反应体系，在0. 2 ml PCR反应管中分别加入 10XPCR缓冲液2. 5 μ 1，2. 5 mM的 dNTP 1.0 μ 1，25 mM的MgCl2 1. 5 μ 1， 上、下游引物各0.5 μ1,5υ/μ1 Taq DNA聚合酶0. 5 41，0嫩模板1 μ ，用灭菌超纯水加至总体积，混勻；步骤(3)的扩增条件为94°C，5分钟，进行预变性；然后94°C，1分钟，53°C，1分钟， 72°C，1分钟共循环35次；最后72°C延伸10分钟。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于阳性对照品为含有VP1/2基因的标准阳性质粒,浓度为 2. 35 X IO12 copies/μ 1。
4.根据权利要求书2或3所述的方法，其特征在于所述的扩增产物为273bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO. 3。
全文摘要
本发明涉及一种检测猪博卡病毒的PCR检测方法，属于生物技术领域。具体采用25μl的PCR反应体系，在0.2mlPCR反应管内分别加入缓冲液，上、下游引物，DNA聚合酶以及提取的DNA模板，用灭菌超纯水加至总体积，将试剂混合均匀后，至于PCR扩增仪中，进行变性、退火、延伸，共循环35次；PCR反应结束后，取10μl产物在琼脂糖凝胶上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外投射仪下观察PCR产物，并与标准分子量相对照，阳性样品可出现约为270bp的片段。本发明所提供的检测方法敏感性高、特异性好、操作简便、迅速，并且对检测材料质量要求低，便于临床上的应用。
文档编号C12N15/11GK102174662SQ20111006336
公开日2011年9月7日 申请日期2011年3月16日 优先权日2011年3月16日
发明者何孔旺, 倪艳秀, 张雪寒, 李彬, 毛立, 温立斌 申请人:江苏省农业科学院