专利名称：一种突变型jnk1序列及其质粒的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，是关于一种能被ATP类似物INM-PPl特异性抑制的突变型JNKl的序列及其质粒的应用。
背景技术：
C-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)是促有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族的主要成员之一。JNK信号通路可以被多种应激(如细胞因子、紫外照射、热休克、渗透压等)所激活，进而参与到细胞增殖与分化、凋亡与生存等生理过程中。此外，JNK信号通路在免疫细胞(主要是T细胞)的分化过程中起到了重要的作用。JNK基因有3个亚型，即JNKl，JNK2和JNK3，可以经过选择性剪切形成10种剪接体。其中JNKl和JNK2在组织中广泛表达，而JNK3仅在脑、心脏和睾丸中表达。JNK主要被上游的MAP激酶MKK4和MKK7所激活，被激活的JNK会磷酸化其底物 c-Jun，进而激活c-Jun从而增强其转录活性。越来越多的研究表明，JNK与许多疾病有着密切的关系，JNK信号通路功能可能与慢性炎症、神经退行性变、糖尿病和肿瘤等多种疾病有关。因此，JNK信号通路作为临床相关疾病的治疗靶点而受到人们的关注。随着JNK信号通路研究的深入，人们开始关注其特异性抑制剂的开发。但是，许多的商业化的JNK信号通路特异性的抑制剂在特异性上一直存在一定的缺陷。例如，最被广泛应用的JNK信号通路抑制剂是SP600125，它是JNK1、2、3的ATP竞争性抑制剂。SP600125能够特异性地抑制JNK而对另外两个MAK激酶(ERK和p38)没有影响，因此，它被广泛应用于JNK信号同路的研究中。但是不幸的是，人们渐渐发现，SP600125在抑制JNK的同时，会抑制许多其他的蛋白激酶，并且使得细胞被异常激活。此外，特异性抑制剂只能同时抑制JNK家族3种异构体的活性，目前，还没有抑制剂能够选择性地分别抑制JNK1、2和3。抑制剂的特异性不强也为进一步研究JNK功能、其底物的筛选以及JNK信号通路相关疾病药物的开发带来了许多技术难度。
发明内容
本发明的目的在于建立一种突变型的JNKl序列，其序列参见附件《突变型JNKl核酸及氨基酸序列》或光盘。所述的mutant-JNKl是在野生型的JNKl的序列基础上将其第108位的甲硫氨酸(Met，ATG)突变为甘氨酸(Gly，GGG)，第168位的亮氨酸(Leu，CTT)突变为丙氨酸(Ala，GCG)，通过突变，可以放大JNKl的ATP结合位点，从而使其能够被ATP类似物竞争性地结合其ATP结合位点，从而抑制其活性。本发明的另一目的在于提供mutant-JNKl的表达质粒(以下简称mutant-JNKl)及其应用。
图I为突变型JNKl序列的突变位点
图2为mutant-JNKl质粒可以正常表达与MEFs细胞中图3为mutant-JNKl质粒具有野生型JNKl的活性图4为INM-PPl可以抑制mutant-JNKl的活性但野生型的JNKl不受其影响图5为INM-PPl在25分钟时开始起抑制作用并且该抑制作用能持续36小时以上
具体实施例方式以下通过具体实施例对本发明作进一步说明，以下实例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的范围。实施例I :突变型JNKl序列的突变及其质粒的构建先通过下列引物将野生型JNKl克隆出来，并使其带上Bam HI和Xho I的酶切位
占-
^ \\\ 5， CCCGGATCCATGAGTGACAGTAAAAGCGAT 3，5’ CCCCTCGAGTTACTGCTGCATCTGTGCTGA 3’然后通过BamHI和XhoI双酶切，再用T4连接酶将突变的JNKl连接到pcDNA 3. I载体上。最后通过下列引物，利用点突变试剂盒的说明书，进行两个位点的突变M108G :5’GTGTACTTGGTAGGGGAACTAATGGAT 3’5’ ATCCATTAGTTCCCCTACCAAGTACAC 3’L168A :5’ACCCTCAAGATCGCGGACTTTGGCCTG 3’5， CAGGCCAAAGTCCGCGATCTTGAGGGT 3，完整mutant-JNKl序列请参照附件《突变型JNKl核酸及氨基酸序列》或光盘。实施例2 mutant-JNKl质粒的转染MEFs (小鼠胚胎成纤维细胞系)接种在DMEM完全培养基(含10 %，100U/ml青霉素、0. lmg/ml链霉素)中，于37°C，5% C02孵箱培养，每隔I 2天传代I次，实验选用对数生长期细胞。实验分3组control组,野生型JNKl组，mutant-JNKl组。按ExGen 500操作说明进行，ExGen 500与质粒的比例为I :4ii g。实施例3 ffestern Blot检测转染效果转染48小时后，各组细胞去除培养基上清，加入细胞裂解液后，用细胞刮将细胞收集到I. 5ml的EP管中，4°C摇晃裂解20分钟，然后12000rcf离心15分钟，取上清为蛋白裂解液于_70°C冻存，备用。蛋白裂解液使用前，先用BCA法测蛋白浓度，读取0D562值，按照标准曲线计算出蛋白浓度，调节蛋白浓度使每个样品的上样总蛋白量为100 yg。样品加蛋白上样缓冲液100°C煮5 IOmin后，用10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后，80V恒压转印80min到0. 45 ii m的PVDF膜上。转印结束后，把含有样品的PVDF膜用TBS配制的5%脱脂奶粉室温封闭2小时。然后按说明书使用量加入I : 1000稀释兔抗鼠X-press单克隆抗体，4°C孵育一抗过夜；TBS洗3次，每次10分钟；加入I : 1000稀释的HRP-羊抗兔二抗，37°C反应2小时。TBS洗3次，每次10分钟。最后用化学发光成像仪显影并保存图像。结果表明，mutant-JNKl质粒能够很好地表达与MEFs细胞系(图2)。实施例4 :激酶活性实验检测mutant-JNKl的生物学活性按实例2的方法将mutant-JNKl质粒转染到MEFs细胞系中，转染至36小时用只I %血清的培养基饥饿处理细胞12小时，然后用TNF- a刺激15分钟，再按实例3的步骤收集细胞裂解液。将30 ill 50%的Protein A beads、300 裂解缓冲液、30 y g细胞裂解液、蛋白酶抑制剂以及相应抗体混合，在杂交炉上摇晃过夜；快速离心30秒，用裂解缓冲液洗两次，弃上清；快速离心30秒，用Hepes缓冲液洗两次,弃上清；最后快速离心30秒后，将上清弃干净；加入激酶反应体系30 ill :5 ill 6 X JNK缓冲液、5 ii I ATP混合物(通常是0. 3u I 1禮的正常六1 加上0.5111(￥-32 )六1 (1011(^/111)，最后用水补足5111)、11^的GST-c-Jun混合，用水补足30 U I ；30度孵育I小时；加10 yl的4X SDS上样缓冲液，100度孵育5分钟，离心后将40 Ul样品加到13%的聚丙烯酰胺凝胶中电泳；电泳结束后将胶烘干后用磷板曝光，扫描后存下图像。结果表明，mutant-JNKl质粒在正常情况下具有野生型JNKl的活性，在TNF-a的刺激下能被激活，从而活化其底物(图3)。实施例5 INM-PPl可以抑制mutant-JNKl的激酶活性但野生型JNKl不受影响按照实例4的步骤转染并饥饿处理细胞，在TNF- a处理前用INM-PPl预处理细胞I小时，然后用TNF-a刺激。然后按照实例4的步骤检测激酶活性。结果表明INM-PPl可以很好地抑制mutant-JNKl的激酶活性，但是野生型JNKl并不受INM-PPl的影响(图4)。 实施例6 INM-PPl从25分钟时开始抑制mutant-JNKl的激酶活性并且该抑制作用能持续36小时以上按照实例4的步骤转染并饥饿处理细胞，在TNF- a处理前用INM-PPl按不同时间点预处理细胞，然后按照实例4的步骤检测激酶活性。结果表明INM-PPl从25分钟时开始便可以抑制mutant-JNKl的激酶活性并且该抑制作用能持续36小时以上(图5)。
权利要求
1.利用突变技术改造的JNK序列，其特征为通过对其第108位的甲硫氨酸(Met)和第168位的亮氨酸(Leu)的突变，扩大其ATP结合位点，从而使其能够被ATP类似物抑制。
2.根据权利要求书I所述的突变序列，构建的突变型JNK质粒，其特征为利用该质粒载体在MEFs中表达突变型的JNK，该JNK拥有野生型JNK的激酶活性且在INM-PPl存在的情况下，其激酶活性能被特异性抑制。
3.将突变型JNK质粒表达于所有细胞的方法，其特征在于方法是基于权利要求书I和/或权利要求书2所述的。
4.利用突变型JNK质粒进行筛选JNK底物、JNK特异性抑制剂以及JNK通路相关药物的方法，其特征在于方法是基于权利要求书I和/或权利要求书2所述的。
5.利用突变型JNK质粒进行细胞周期中JNK功能的研究方法，其特征在于方法是基于权利要求书I和/或权利要求书2所述的。
全文摘要
本发明属于分子生物学领域，公开了一种突变型JNK1序列及其质粒的构建和应用。本发明通过化学基因策略，对JNK1基因第108位的甲硫氨酸(Met)和第168位的亮氨酸(Leu)进行突变，分别用甘氨酸(Gly)和丙氨酸(Ala)代替。突变后的JNK1的ATP结合位点被放大，从而能够结合ATP类似物。该质粒在正常情况下，具有野生型JNK1的生物学功能，但是在ATP类似物1NM-PP1存在的情况下，1NM-PP1可以通过竞争性地结合ATP结合位点而抑制JNK1的激酶活性。该质粒可以在JNK1的底物、JNK1的特异性抑制剂以及JNK通路相关疾病候选药物的筛选中发挥重要作用。同时也能为在细胞周期中精确研究JNK1的功能提供有力的工具。
文档编号C12N9/12GK102676466SQ201110064319
公开日2012年9月19日 申请日期2011年3月17日 优先权日2011年3月17日
发明者侯亚义, 谢浩, 赵光锋 申请人:南京大学