专利名称：一种新型幽门螺旋杆菌多表位疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，具体涉及到一种新型幽门螺旋杆菌多表位疫苗及其制备方法和应用。
背景技术：
幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是慢性胃炎、消化性溃疡和十二指肠溃疡的重要致病因子，与胃癌密切相关，世界卫生组织(WHO)已将Hp列为I类致癌因子。幽门螺旋杆菌的感染率很高，世界人群Hp感染率超过50%，我国人群Hp感染率为58. 07%, 呈现家庭聚集性，形势更加严峻。目前治疗Hp感染的方法，主要基于“三联”药物疗法，其主要成分为质子泵抑制剂、抗生素和铋剂。“三联”药物疗法存在诸多弊端(1)抗生素广泛使用，导致Hp耐药菌株日益增多，药物疗效每况日下，临床上同时使用2种或3种抗生素仍难以将其彻底根治。(2)治疗药物存在毒副作用。(3)药物治疗难以避免“反复治疗，反复感染”的尴尬局面。(4)药物价格昂贵，治疗周期长，病人依从性较差。因此，“三联”药物疗法不宜在Hp感染人群中大规模推广使用。实验研究表明，免疫接种可预防甚至治疗Hp感染，使人群获得持久性的免疫力。研制有效的预防性和治疗性Hp疫苗是控制Hp感染性疾病的一种切实有效的方法，逐渐成为国内外学者竞相研究的一个热点。抗原表位是刺激机体产生免疫应答的基本功能单位，包括B细胞抗原表位、Th细胞抗原表位、CTL细胞抗原表位和一些不利于免疫保护作用的抗原表位。表位疫苗基于抗原表位而制备，具有独特的疫苗设计思路，是研制预防和治疗感染性疾病、恶性肿瘤和自身免疫性疾病等疫苗的新方向。表位疫苗与全菌疫苗、基因工程亚单位疫苗和DNA疫苗相比， 具有以下优点(1)表位疫苗一般稳定、无毒，具有更高的安全性。( 抗原表位肽的分子结构小而简单，不会引起免疫抑制或者自身免疫性疾病。(3)表位疫苗可对抗原表位进行精确定位，具有更高的免疫针对性和特异性。(4)表位疫苗具有十分灵活的设计性，可组合不同 Th、B细胞抗原表位，制成针对多种病原体的疫苗。(5)表位疫苗选用高保守性的抗原表位肽，可有效防止病原体快速基因突变所形成的免疫逃避机制。在Hp疫苗研究领域，表位疫苗与其他疫苗相比，同样具有很大优势，既可激发更高特异性的抗Hp抗体，又可防止疫苗免疫引起的一些自身免疫性疾病，具有更高的免疫针对性和安全性。幽门螺旋杆菌含有丰富的尿素酶⑴rease)，约占全菌体蛋白的5% 10%，在Hp 内部和表面广泛表达。一般细菌难以在胃部的高酸环境中存活，但尿素酶能水解尿素产生氨来中和胃酸，并可对胃黏膜造成病理性损伤。因此，尿素酶是Hp重要的定植因子和致病因子。尿素酶由A和B两个亚单位⑴reA和toeB)组成，其中尿素酶B亚基是尿素酶活性亚单位，在各Hp菌株中具有很好的保守性，被公认为是Hp疫苗的理想候选抗原。最新实验研究表明，尿素酶A亚基同样具有较强的抗原性，针对尿素酶A亚基的Hp疫苗同样能够取得良好的保护作用。因此，尿素酶A、B双亚基都是Hp疫苗设计的理想抗原。从理论上讲， 研制一种针对尿素酶A、B双亚基的Hp表位疫苗，比只针对尿素酶单亚基的Hp表位疫苗，具有更好免疫预防和治疗效果。另外，实验研究也证明天然Hp尿素酶激发的抗尿素酶抗体，不能有效抑制尿素酶活性。究其原因，Hp尿素酶抗原表位可分为两类，一类表位激发机体产生的抗尿素酶抗体，可明显抑制尿素酶活性，为中和抗体；而另一类表位激发机体产生的抗尿素酶抗体，却有助于Hp的胃部定植和病理性进程。因此，选择可激发中和抗体的尿素酶抗原表位来构建表位疫苗，可避免交叉反应产生的免疫病理性伤害，激发有效抑制尿素酶活性的抗体，有助于Hp感染性疾病的有效治疗。本发明的思路如下根据机体对幽门螺旋杆菌的免疫保护性机制，合理选择尿素酶A、B双亚基的B、Th细胞优势抗原表位，通过生物信息学对抗原表位的连接顺序、间隔序列和多重拷贝数，加以分析和确定，设计出一个科学合理、结构新颖的幽门螺旋杆菌多表位疫苗CTB-UE。利用Wfestern Blot、ELISA等多种免疫学方法检测Hp多表位疫苗CTB-UE的免疫原性和免疫特异性，研究表明Hp多表位疫苗CTB-UE能够激发BALB/c小鼠产生针对尿素酶A、B双亚基的T细胞免疫应答和有效抑制Hp尿素酶活性的高滴度表位特异性抗体，具有很好的免疫原性和免疫特异性。
发明内容
本发明的第一个方面是提供了一种针对尿素酶A、B双亚基两者的Hp多表位疫苗。本发明的第二个方面是提供了 Hp多表位疫苗的制备方法。本发明的第三个方面是公布了 Hp多表位疫苗的用途。本发明的第一个方面是提供了一种针对尿素酶A、B双亚基的Hp多表位疫苗 CTB-UE。该Hp多表位疫苗主要由尿素酶多表位肽UE和霍乱毒素B亚基构成，尿素酶多表位肽UE的氨基酸序列如(序列1)所示，Hp多表位疫苗CTB-UE的整体氨基酸序列如(序列 2)所示。本发明的新型Hp多表位疫苗CTB-UE具有以下优点(1)尿素酶B亚基是尿素酶活性亚单位，被公认为是Hp疫苗的理想候选抗原；最新实验研究表明，尿素酶A亚基同样具有较强的抗原性，针对尿素酶A亚基的Hp疫苗同样能够取得良好的保护作用。Hp多表位疫苗CTB-UE将尿素酶A、B双亚基的抗原表位结合起来，可诱发针对尿素酶A、B双亚基两者的 T细胞免疫应答和特异性抗体体液免疫应答。( 天然Hp尿素酶激发的抗尿素酶抗体，不能有效抑制尿素酶活性，本发明的Hp多表位疫苗CTB-UE由可激发中和抗体的尿素酶抗原表位构建而成，可避免交叉反应产生的免疫病理性伤害，激发有效抑制尿素酶活性的抗体。 (3)尿素酶抗原表位肽的分子量很小，免疫原性很低，本发明的Hp多表位疫苗CTB-UE采取 “偶联分子内免疫佐剂”和“抗原表位多重拷贝，，两种设计思路来增强尿素酶抗原表位肽的免疫原性，很好地解决了表位疫苗免疫原性普遍较低的缺陷，可诱发高滴度的表位特异性抗体。本发明的第二个方面是提供了 Hp多表位疫苗的制备方法，其技术路线详述如下(1)新型Hp多表位疫苗抗原分子的结构设计根据机体对幽门螺旋杆菌的免疫保护性机制，合理选择尿素酶A、B双亚基的B、Th 细胞优势抗原表位，通过生物信息学对抗原表位的连接顺序、间隔序列和多重拷贝数，加以分析和确定，设计出一个科学合理、结构新颖的幽门螺旋杆菌多表位疫苗CTB-UE。(2)重组表达质粒pETCUE (含有融合基因CTB-UE)的构建首先构建一个含有霍乱毒素B亚基(CTB)基因的重组表达载体pETC ；然后通过基因合成技术合成一个尿素酶多表位肽UE (含有多个尿素酶细胞抗原表位)的核苷酸序列，并将其插入重组表达载体PETC中，构建重组表达载体pETCUE。(3)融合蛋白CTB-UE的原核表达及纯化将重组表达载体pETCUE转化进大肠杆菌BL21(DE3)中，构建重组基因工程菌株BL21 (DE3) /pETCUE。利用IPTG诱导表达，并通过Ni-NTP镍离子亲和层析和DEAE SepharoseFF阴离子交换层析能够获得高纯度融合蛋白CTB-UE，即为Hp多表位疫苗。本发明的第三个方面是提供了 Hp多表位疫苗的用途。Hp多表位疫苗CTB-UE可用于预防和治疗幽门螺旋杆菌感染相关性疾病。
图1 新型Hp多表位疫苗的分子结构设计特点。图2 重组表达载体pETCUE的双酶切鉴定。泳道1 :DNAMarker III ；泳道 2 :pETCUE/Nco I+Xho I图3 重组表达载体pETCUE质粒图谱。Nco I和Xho I之间为插入的融合基因CTB-UE图4 =Hp多表位肽融合蛋白CTB-UE的原核表达。泳道1 蛋白质Marker ；泳道2、3 CTB-UE包涵体蛋白；泳道4_6 CTB-UE可溶蛋白；泳道7-9 =CTB-UA包涵体蛋白(一个对照蛋白)；泳道10 :BL21(DE3)/pET22b全菌蛋白。图5 =Hp多表位肽融合蛋白CTB-UE的Ni-NTA亲和层析纯化。泳道1 蛋白质Marker ；泳道2_4 杂蛋白；泳道5_8 纯化的CTB-UE蛋白样品；泳道9 杂蛋白；泳道10 纯化前的CTB-UE蛋白样品；图6 =Hp多表位肽融合蛋白CTB-UE的kpharose FF阴离子交换层析纯化。泳道1 蛋白质Marker ；泳道2、3 纯化的CTB-UE蛋白样品；泳道4_6 杂蛋白和部分流失的目的蛋白；泳道7-8:杂蛋白；泳道9、10:纯化前的CTB-UE蛋白样品；图7 =Hp多表位疫苗CTB-UE诱发抗尿素酶抗体的检测。Hp多表位疫苗CTB-UE和重组尿素酶B亚基(rtoeB)都能诱发较高滴度抗尿素酶抗体。 图8 :Hp多表位疫苗CTB-UE诱发抗UreA抗体的检测。Hp多表位疫苗CTB-UE能诱发较高滴度的抗尿素酶A亚基抗体。图9 =Hp多表位疫苗CTB-UE诱发抗toeB抗体的检测。Hp多表位疫苗CTB-UE和重组尿素酶B亚基(rtoeB)都能诱发较高滴度的抗尿素酶B亚基抗体。图10 =Hp多表位疫苗CTB-UE诱发toeA183_2(13表位特异性抗体的检测。Hp多表位疫苗CTB-UE能够产生较高滴度的toeA183_2(13表位特异性抗体。图11 :Hp多表位疫苗CTB-UE诱发toeB327_334表位特异性抗体的检测。Hp多表位疫苗CTB-UE能够产生较高滴度的toeB327_334表位特异性抗体。图12 =Hp多表位疫苗CTB-UE致敏小鼠脾脏淋巴细胞对抗原刺激的增殖反应。图13 =Hp多表位疫苗CTB-UE免疫特异性的免疫印迹(Western Blot)鉴定。
图14 =Hp多表位疫苗CTB-UE与神经节苷脂GMl的结合活性检测。 图15 =Hp多表位疫苗CTB-UE多克隆抗体抑制尿素酶活性的检测。
鼠抗CTB-UE多克隆抗体可显著抑制Hp尿素酶活性。
具体实施例方式材料1. IPTG溶液称取1. 2g IPTG置于50ml离心管中，加入40ml无菌水，充分混勻溶解后，定容至50ml。用0. 22 μ m滤器过滤除菌，小份分装，_20°C保存。2.氨苄青霉素(Amp)贮液(100mg/mL)称取IOOmg氨苄青霉素(Amp)溶于ImL 无菌水，制得浓度为lOOmg/mL的贮存液，通过0. 22 μ m细菌滤器过滤除菌，溶液分装保存于-20°C冰箱中。3.培养基(1)LB液体培养基称取IOg胰蛋白胨、如酵母提取物和5g NaCl，加蒸馏水至1000ml，调整pH至7. 4，高压蒸气灭菌。(2) LB固体培养基1. 5g琼脂粉/IOOml LB 培养液，高压灭菌后，倾倒平板。4. DNA 电泳缓冲液(50x TAE)称取 242g Tris,37. 2g Na2EDTA ·2Η20 和 57. Iml 冰乙酸，加水至1000ml，使用时稀释50倍。5. SDS-PAGE 电泳缓冲液(5X)称取 Tris 粉末 15. lg、甘氨酸 94g、SDS 5. Og ；加入约800ml的去离子水，搅拌溶解；加去离子水定容至1L，室温保存；注意加水时应让水延着壁缓缓流下，以避免由于SDS的原因产生很多泡沫。6.考马斯亮蓝蛋白染色试剂(1)考马斯亮蓝G-250染液(蛋白质定量用)考马斯亮蓝G-250IOOmg溶解在50ml 95%乙醇中，然后加入86%磷酸100ml，用蒸馏水稀释至 IOOOml。(2)考马斯亮蓝R-250染液0. 29g考马斯亮蓝R-250溶解在250ml脱色液中。(3) 固定液500ml乙醇、IOOml冰醋酸用蒸馏水稀释至1000ml。(4)脱色液250ml乙醇、80ml 冰醋酸用蒸馏水稀释至1000ml。( 保存液25ml 87%甘油溶于225ml脱色液中。7. RNase A 溶液(10mg/ml) IOmg RNase A 溶解于 987 μ 1/K中，力口入 10 μ 1 IM Tris-HCl (ρΗ7. 5)禾口 3 μ 1 5Μ NaCl，沸水浴15min后，缓慢冷却至室温，分成小份存于-20°C8. Lysozyme 溶液(10mg/ml) :10mg Lysozyme 溶于 Iml IOmM Tris-HCl (ρΗ8· 0)。9.实验动物(1) SD大鼠清洁级，雄性，体重100 200g左右，购自扬州大学比较医学中心，许可证号SCXK(苏)2007-0001。(2)BALB/c小鼠为SPF级，雄性，8 10周龄，购自扬州大学比较医学中心，许可证号SCXK (苏)2007-0001。10. Western blot 试剂(1)电转缓冲液2. 9g 甘氨酸，5. 8g Tirs, 0. 37g SDS, 200ml甲醇，加双蒸水稀释至1L。(2) 10X丽春红贮液2g丽春红，30g三氯乙酸，30g磺基水杨酸，加水至 IL ； (3) 5x PBS 缓冲液2. 9g Na2HPO4 · 12H20,0. 24g KH2PO4,8g NaCl，0. 2g KCl 溶于200ml ddH20中，用NaOH调PH值到7. 4。(4)PBST缓冲液=PBS缓冲液中加入0. 05% Tween-20。(5)封闭液10%脱脂奶粉溶于PBST缓冲液，用前现配。(6)底物液反应液增强型DAB显色试剂盒(天根)。11. ELISA 试剂(1)包被液1. 6g Na2CO3, 2. 9g NaHCO3,0. 2g NaN3,加双蒸水至 1L，调 pH 值至 9. 6。(2)洗涤液分别称取 0. 2g KH2PO4, 2. 9g Na2HPO4 · 12H20，8. Og NaCl， 0. 2gKCl，0. 5ml Tween-20，加入 ddH20 定容至 1000ml (PBST)。(3)封闭液称取 3. Og BSA 溶解于100ml洗涤缓冲液中，过滤除菌后4°C保存。(4)底物液可溶性单组份TMB底物溶液。(5)终止液量取蒸馏水178. :3ml，逐滴加入浓硫酸21. 7ml (IMH2SO4)。12.淋巴细胞增殖实验主要试剂(1)小鼠脾脏淋巴细胞分离液(达科为生物技术有限公司)O)RPMI-1640完全培养液在RPMI-1640基础培养液加入10%胎牛血清、 100U/ml 青霉素、ΙΟΟμ g/ml 链霉素。(3)RPMI_1640 不完全培养液称取 10. 4g RPMI-1640 干粉、2. 4gHEPES、0. 75g NaHCO3,加去离子水至1000ml, pH 7. 4，超滤除菌，分装。13.快速尿素酶检测试剂2% 尿素，0.04% 酚红，0.04 ^NaH2PO4. H20,0.1% Na2HPO4, pH为6. 0，临用前配制。14. BHI血平板称取3. 5g BHI干粉，加蒸馏水93ml，1. 5g琼脂粉，121°C灭菌 13min，待冷却至60°C以下，加入7ml脱纤维羊血，多粘菌素B (终浓度5 μ g/ml)，万古霉素 (终浓度10 μ g/ml)和甲氧苄氨嘧啶(终浓度5 μ g/ml)，分装至培养皿，冷却后备用。15.尿素肉汤称取葡萄糖lg、蛋白胨lg、磷酸二氢钾2g、氯化钠5g，加蒸馏水 1000ml，矫正PH至7. 2，再加入anl 0. 4 %酚红溶液，高压灭菌(68. 95kPa) 20分钟，冷至 60°C左右时加入已用滤菌器过滤的Iml 50%尿素溶液，混勻后备用。实例1 幽门螺旋杆菌多表位疫苗CTB-UE的分子结构设计根据“机体对Hp的免疫保护性机制”和“尿素酶抗原表位的免疫学性质”，选择尿素酶Th和B细胞表位UreA卿、UreB229__251, UreA183^203和UreB327_3M用于新型Hp多表位疫苗的构建。在新型Hp多表位肽疫苗的设计中，本课题组将Th细胞表位放在B细胞表位的前端，有助于B细胞表位的有效递呈，再经过生物信息学DNAstar和RANKPEP软件的分析和评价，抗原表位顺序确定为 toeAB74_9Q-UreB429_251B-UreAB183_2Q3B-UreBB327_334B ；选择 KK 作为相邻尿素酶Th抗原表位的间隔序列，选择GS作为相邻尿素酶B抗原表位的间隔序列；将尿素酶抗原表位UreA卿、UreB229_244, UreB237^251和UreA183_2(13分别拷贝两次，尿素酶抗原表位 toeB327_334拷贝三次；选择霍乱毒素B亚基(CTB)作为分子内免疫佐剂，融合在尿素酶多表位肽(UE)的N端，增强尿素酶多表位肽(UE)的免疫原性。结果幽门螺旋杆菌多表位疫苗CTB-UE的分子结构设计特点和思路如(图1)所示。实例2 重组表达载体pETCUE (含有融合基因CTB-UE)的构建(1)重组表达载体pETC (含有霍乱素素B亚基基因)的构建以重组载体pETCtUBE (由吴梧桐教授惠赠)为模板，利用I^rimer Premier V5. 0 设计引物Pl-CTB和P2-CTB。引物Pl-CTB和P2-CTB的序列及特点如下引物 Pl-CTB :CATGUCCATGGUGCACACCTCAAAATATTACTGATTTGTGTGC ；引物 P2-CTB:CCCUAAGCTT U CU GGTACC CGCGGATCATTTGCCATACTAATTGCGGCAATC ；引物Pl-CTB前端带有Nco I酶切位点(CCATGG)，用下划线标示；引物P2前端带有Hind III (AAGCTT)和KpnI (GGTACC)酶切位点和部分Linker，酶切位点用下划线标示， Linker用阴影标示。引物均由南京金思瑞生物科技公司合成。利用引物Pl-CTB和P2-CTB 从pETCtUBE扩增CTB基因的反应体系如下pBI121-CtUBE2 μ Pl-CTB (0.1 μg/μL)2 μ P2-CTB (0.1 pg/pL)5mmol/LdNTP5 μLIOxTaq DNA 聚合酶 Buffer5 μ Taq DNA聚合酶Ιμ ddHB2B033 μLTotal50 μ PCR 反应条件为94°C 预变性 4min，94°C 变性 45sec，54°C 退火 60sec，72 °C 延伸 lmin，共30个循环；最后72°C延伸6min。利用DNA片段凝胶回收纯化试剂盒(北京天根生物技术有限公司)回收纯化PCR 扩增的CTB基因；将纯化后的CTB基因片段和pET22b表达质粒用Nco I/Hind III分别进
行双酶切，双酶切反应体系如下
CTB基因/pET22b载体15 μLIOxK Buffer5μLBSA5 μ Ncol (15U L)2\ihHindlll (15U/pL)2μLddHB2B026 μLTotal50 μL37°C酶切反应池，然后用琼脂糖凝胶电泳，观察电泳结果。分别利用琼脂糖凝胶DNA回收纯化试剂盒回收CTB基因和pET22b载体双酶切产物。将回收的pET22b空载体和CTB基因通过互补的粘性末端，在T4DNA连接酶的作用下过夜)连接成闭合环状的 DNA分子，即形成重组表达质粒pETC。T4DNA连接酶连接体系如下
pET22b线性化载体1.5 μL
CTB基因4.5 μL
10 X T4 DNA 连接酶 Buffer1 pL
T4-DNA 连接酶(3U/pL)1 μ
ddHB2B02 μL
Total μ Γ(2)尿素酶多表位肽UE核苷酸序列的基因合成将前期设计的多表位肽UE的氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏爱性原则转化成相应的核苷酸序列，委托南京金丝瑞生物科技公司进行基因合成。
(3)尿素酶多表位肽UE基因与pETC表达载体的连接通过质粒小量提取试剂盒(天根)提取重组质粒pUCUE和pETC(实验室前期构建)，用Kpn I/Xho I分别进行双酶切，双酶切反应体系如下
pUCUE/pETC15 μ
IOxM Buffer5 μ
Kpnl (15υ/μ )2 μL
Xhol (15υ/μ )2μL
ddHB2B026 μL
Total50 μL37°C酶切反应池，然后用琼脂糖凝胶电泳，观察电泳结果。分别利用琼脂糖凝胶DNA回收纯化试剂盒回收多表位肽UE基因和pETC表达载体双酶切产物。将回收的pETC 线性化载体和UE基因通过互补的粘性末端，在T4DNA连接酶的作用下过夜)连接成闭合环状的DNA分子，即形成重组表达质粒pETCUE。T4DNA连接酶连接体系如下
pETC线性化载体1.5 μι
UE基因4.5 μL
10ΧΤ4 DNA 连接酶 Buffer1 μ
T4-DNA 连接酶(3U/pL)1 pL
ddHB2B02 pL
Total10 μL结果利用Nco I/Xho I双酶切待检重组质粒pETCUE，37°C反应2h，用1 %的琼脂糖凝胶电泳检测，发现双酶切的DNA片段为837bp，与融合基因CTB-UE的理论大小一致。 再将pETCUE送交南京金思瑞生物科技公司，采用T7启动子和终止子通用引物进行基因测序，证明pETCUE中融合基因CTB-UE的核苷酸序列完全正确，且无移码突变。重组表达载体 pETCUE的质粒图谱如(图3)所示。实例3 尿素酶多表位肽融合蛋白CTB-UE的原核表达将验证正确的重组表达质粒pETCUE转化进E. coli BL21 (DE3)菌株中。在预先制备好的含50 μ g/mL Amp的LB平板上，接种环划线基因工程菌株pETCUE/BL21 (DE3)，倒置于 37°C培养箱，过夜培养12 IMi后，挑取单个菌落，接种于含50 μ g/mL Amp的LB培养基中， 370C，180rpm,培养12 16h。以2%接种量分别接种重组菌于含50 μ g/mL Amp LB培养基中，37°C，ISOrpm振荡过夜，次日晨再将该菌液以接种量接种于含50 μ g/mL Amp的LB 液体培养基中，370C，180rpm摇瓶汕后，加入IPTG使终浓度达到lmmol/L，37°C，180rpm诱导表达，以空载体菌pET22b/BL21(DE3)作为阴性对照。结果将基因工程重组菌株pETCUE/BL21 (DE3)在PH值为7、IPTG浓度为lmmol/L、 诱导温度37°C、诱导时间为他的情况下进行诱导表达。与对照菌株对比，基因工程重组菌株pETCUE/BL21 (DE3)在约32KD处出现目的蛋白条带，与尿素酶多表位肽融合蛋白CTB-UE的理论大小相符合(图4)。尿素酶多表位肽融合蛋白CTB-UE在可溶性蛋白和包涵体蛋白中都有存在。实例4 =Hp多表位肽融合蛋白CTB-UE的纯化(1) Ni-NTA镍离子亲和层析柱的纯化将Ni-NTA填料充分混勻后加入层析柱中，溶液可通过重力作用缓慢流出，待完全加入后，将上层筛板平放入柱中；向装填好的柱中加入适量的去离子水将乙醇冲洗干净后， 加入8倍柱体积的Binding buffer平衡，平衡结束后即可上样；收集菌体后，每IOOmg菌体加入l_5ml Binding Buffer，超声裂解菌体；12000rpm离心，弃上清，将沉淀重悬于提前加入l-5mMPMSF的Binding Buffer中，进行超声波处理，直至包涵体清洗干净(呈较洁净的乳白色状)；将沉淀重悬于含8M尿素的Binding Buffer中，冰浴lh，使包涵体溶解；将菌体裂解液负载上柱，流速为10倍柱体积/小时；使用15倍柱体积的Wash buffer冲洗柱子， 收集流穿峰；使用5倍柱体积的Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰；依次使用3倍柱体积的Binding Buffer和5倍柱体积的去离子水洗涤后，用3倍柱体积的20%乙醇平衡，4°C保存。结果经Ni-NTA镍离子亲和层析柱的纯化后，收集的各个蛋白峰进行SDS-PAGE分析，可以发现目的蛋白集中在50mM咪唑和250mM咪唑洗脱产生的蛋白峰。通过凝胶成像检测仪分析在50mM咪唑和250mM咪唑洗脱的目的蛋白纯度均在85%以上(图5)。(2)阴离子交换层析(kpharose FF)的纯化Sepharose FF阴离子交换层析方法用离子交换层析缓冲液A平衡DEAE Sepharose FF离子交换层析柱。将经过Ni-NTA亲和层析一级纯化后的蛋白样品以IOml/ min流速上样DEAEkpharose FF阴离子交换层析柱；用离子交换层析缓冲液B洗脱蛋白； 洗脱方式连续梯度洗脱40min，收集目的蛋白峰。结果d^kpharose FF阴离子交换层析纯化，收集的各个蛋白峰进行SDS-PAGE分析，尿素酶多表位肽融合蛋白CTB-UE主要集中在用0. 5M NaCl的磷酸盐缓冲溶液洗脱下的蛋白峰中。经凝胶成像检测仪软件，尿素酶多表位肽融合蛋白CTB-UE的纯度在90%以上 (图 6)。实施例5 =Hp多表位疫苗CTB-UE的免疫原性和免疫特异性研究(1) BALB/c小鼠的免疫实验分组将SPF级BALB/c小鼠随机分为4组，分别为新型Hp多表位融合蛋白 CTB-UE免疫组、重组尿素酶B亚基(rtoeB)免疫组、重组霍乱毒素B亚基(rCTB)免疫组和 PBS免疫组。每组6只BALB/c小鼠，共M只，详细分组如下图所示表1 :SPF级BALB/c小鼠分组及免疫方案
权利要求
1.一种幽门螺旋杆菌多表位疫苗，其活性成分是一条多肽，主要由霍乱毒素B亚基 (CTB)和尿素酶多表位肽UE构成，其氨基酸序列如序列1所示。
2.如权利要求1所述，一种幽门螺旋杆菌多表位疫苗，其核苷酸序列如序列2所示。
3.如权利要求1所述，尿素酶多表位肽UE主要由尿素酶A、B双亚基的Th和B细胞抗原表位的多拷贝体构成，其氨基酸序列如序列3所示。
4.如权利要求3所述，尿素酶多表位肽UE的核苷酸序列如序列4所示。
5.如权利要求1所述，霍乱毒素B亚基(CTB)和尿素酶多表位肽UE之间的间隔序列为 DPRVPSS。
6.一种幽门螺旋杆菌多表位疫苗的制备方法，通过基因合成技术合成尿素酶多表位肽UE的核苷酸序列，将其融合在霍乱毒素B亚基(CTB)基因的下游，构建含有融合基因 CTB-UE的重组表达载体pETCUE及其重组基因工程菌。重组基因工程菌株发酵后，经Ni-NTA 镍离子交换层析和kpharose FF阴离子交换层析，获得该疫苗的融合蛋白CTB-UE。
7.按照权利要求1和6所述的幽门螺旋杆菌多表位疫苗，其特征在于能够激发机体产生针对Hp尿素酶A、B双亚基的T细胞免疫应答和有效抑制Hp尿素酶活性的高滴度表位特异性抗体。
8.按照权利要求1和7所述的幽门螺旋杆菌多表位疫苗，其特征是可以用作预防和治疗幽门螺旋杆菌感染的药物组合。
全文摘要
本发明提供一种幽门螺旋杆菌多表位疫苗，其活性成分是一条多肽，主要由幽门螺旋杆菌尿素酶A、B双亚基的Th和B细胞抗原表位的多拷贝体以及黏膜免疫佐剂霍乱毒素B亚基构成。本发明主要通过基因合成技术合成一个人工基因，其包含有尿素酶A、B双亚基的Th和B细胞抗原表位多拷贝体的基因序列，然后将该人工基因与霍乱毒素B亚基的基因序列相偶联，形成一个融合基因。利用大肠杆菌原核表达系统表达该融合基因，经蛋白纯化后，获得幽门螺旋杆菌多表位疫苗。该幽门螺旋杆菌多表位疫苗能够诱发机体产生针对尿素酶A、B双亚基的T细胞免疫应答和高滴度特异性抗体体液免疫应答，可用于预防和治疗幽门螺旋杆菌感染相关性疾病。
文档编号C12N15/70GK102178941SQ20111006459
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月17日 优先权日2011年3月17日
发明者何赟绵, 奚涛, 李小康, 邢莹莹, 郭乐 申请人:中国药科大学