专利名称：与猪免疫性状相关的cxcl12基因片段克隆及作为分子标记的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于家畜基因工程技术领域，具体涉及ー种作为猪标记辅助选择应用的与猪免疫性状相关的分子标记的克隆及应用。
背景技术：
近年来，猪的疾病大規模爆发已经成为困扰养猪业的重大难题，传统的治疗方法无法有效地解决问题，而且药物及其有害物质残留影响动物食品安全和环境，因此动物抗病遗传育种越来越受到重视。利用分子抗病育种技术快速有效培育抗病新品种成为可能，也是目前有效的抗病育种技术。CXCL12 又称基质细胞衍生因子 I (stromal cell derivedfactor-1, SDF-1)或前B细胞刺激因子(pre-Bcell stimulatory factor，PBSF)。CXCL12最初被认为是B系祖细胞的生长因子，是由骨髓基质细胞产生。与其它趋化因子产生不同，CXCL12由基质细胞持续产生，为持续表达性趋化因子，其它趋化因子由炎症诱导产生的(李彩霞，SDF-1/CXCR4的研究进展.国外医学分子生物学分册，2003,25 ) :367-369.),无病原侵入时体内就有稳定表达，只是表达量较低。猪的CXCL12基因定位在第14号染色体上，DNA全长15057bp，mRNA全长446bp,有4个外显子。趋化因子是ー类控制细胞定向迁移的细胞因子，其功能行使由趋化因子受体介导，趋化因子与其受体的相互作用控制着各种免疫细胞在循环系统和组织器官间定向迁移，使之到达感染、创伤和异常増殖部位，执行清除感染源、炎症反应、促进创伤愈合和消灭异常增殖细胞、維持组织细胞平衡的功能。并且在细胞及器官的发育、肿瘤的形成及其转移、移植免疫排斥等方面都起着重要的作用(Cascieri MA, Springer MS. The chemokine/chemokine—receptor family potential and progress for therapeutic intervention.Curr Opin Chem Bio,2000,4 (4) :420-427. ；Yoshie 0, Imai T, Nomiyama H. Chemokinesin immunity. Adv Immunol, 2001, 78 :57-110.)。如果趋化因子及其受体的表达和功能异常，将导致免疫细胞不能在正确的位置行使正确的功能，从而会给机体带来损伤，造成疾病的发生，因此以趋化因子及其受体分子为控制靶点，通过激活或拮抗趋化因子受体的信号传导来调控趋化因子系统的功能，可望用于控制和治疗相关疾病。CXCL12基因主要有以下4个方面的功能(I)对免疫细胞的趋化作用趋化因子的基本功能就是对表达有相应趋化因子受体的细胞的定向趋化作用。表达相应趋化因子受体的免疫细胞在滚动前行中由干与血管内皮上趋化因子作用而促使免疫细胞整合素的上调，整合素与内皮细胞上的黏附分子的相互作用导致免疫细胞不可逆地黏附到血管内皮表面。(2)调节血细胞发育可以调节造血干细胞和血细胞前体的増殖，CXCL12能促进人外周血⑶34+前体细胞的增通(Lataillade JJ 等· Chemokine SDF-I enhances circulating CD34+cellproliferation in synergy with cytokines possible role in progenitor survival.Blood, 2000,95 (3) :756-768.)，增强人骨髓、脊柱血及小鼠脊柱中造血干细胞的生存和抗凋亡能力，增强体外长期培养小鼠造血干细胞的植入能力(Broxmeyer HE等· Stromalcell-derived Iactor-IZCKuLlS directly enhances survival/antiapoptosis οιmyeloid progenitor cells through CXCR4 and G(alpha)i proteins and enhancesengraftment of competitive, repopulating stem cells. Leukoc Biol,2003,73 (5)630-638.);可以加强小鼠胚胎干细胞的存活和趋化运动，并可以促进造血祖细胞的生成(Guo Y等· Stem Cells，2005，23 :1324-1332.)。(3)參与胚胎期器官的发育CXCL12/CXCR4生物学轴可能參与器官发育等一系列重要的生理和病理过程，在CXCL12或CXCR4基因敲除的小鼠中研究发现，有半数胚胎死于腹中，出生的也均在一小 时内死亡，表现为造血障碍、血管形成异常、心脏膜性室间隔缺损、小脑神经元分布异常等(Horuk R. Chemokines beyond inflammation. Nature,1998,393(6685) :524-525.)。(4)在肿瘤的转移过程的趋化作用趋化因子在肿瘤的发生及发展过程中表现出双向的作用。一方面则可以通过抑制血管生成、趋化免疫活性细胞来抵抗肿瘤的生长和转移；另一方面，趋化因子能通过刺激肿瘤细胞生长，趋化肿瘤细胞以及促进血管生长和消化细胞外基质的间接作用促进肿瘤的的生长和转移。鉴于CXCL12基因在免疫调节过程中的重要作用，因此以趋化因子及其受体基因为靶基因，调控其功能，从而达到有效控制疾病的目的。并且借助分子标记辅助选择，筛选CXCL12基因潜在的与免疫功能相关分子标记，为抗病育种提供參考。
发明内容
本发明的目的在于克隆与猪免疫力相关的分子标记，利用该分子标记作为猪标记辅助选择的应用。本发明通过以下技术方案实现
申请人克隆得到一种与猪免疫力相关的CXCL12基因片段，它的核苷酸序列如下所示AAGGGTCATTTTCCAAGTAATCGAAGATATTTTAAAATCTCAAGGAAAATTTGAAAGCATCTTCCCCTGGAACCCATGAACCAGAGCCATTCAACCTCTTTCTCCAGTTAAATTCACAGGGCCCTAAATCTTGACCACAATTAAGGAAAGAATAATTTCTGTTTCTCCCCCTAGGGGGAAAATAGATAAAAGGA(G/C)AGACTGCAGTGAAAATGATT ;(该序列见序列表SEQ ID N0:2所述。括号内碱基突变位置及碱基的替换，下划线为197位引入一个错配的碱基G)在该序列第195bp处有I个G195-C195的碱基替换，导致BsmAI-RFLP多态性。申请人:设计了ー种检测上述基因片段碱基突变的引物对，其核苷酸序列如下所示正向引物5’-AAGGGTCATTTTCCAAGTA-3’ (见序列表 SEQ ID NO 3)反向引物5’ -AgACTGCAGTGAAAATGATT-3’(第2位，由原A错配成现在的g，见序列表 SEQ ID NO 4)
申请人建立一种制备上述分子标记和检测上述分子标记的方法，该方法的步骤如下从猪品种耳组织、毛囊、血液中提取总DNA，根据GenBank公布的猪CXCL12 (GeneBank登录号AK237304. I)序列为模板设计引物(正向引物5’ -CAGTGGAAGGGTCATTTTCC-3 ’，反向弓丨物5’ -ATTAGGGGTCACCCAGCTCT-3’)，PCR扩增，PCR产物纯化和克隆测序，获得如序列表SEQ ID N0:1和附图2所示的核苷酸序列，应用CRS-PGR-RFLP方法检测猪CXCL12基因的多态性。更详细的技术方案參见《具体实施方式
》。
SEQ ID NO : I是本发明作为分子标记的猪CXCL12基因片段，序列长度为387bp (该序列与附图2的序列相同)。
SEQ ID NO :2是检测CXCL12基因片段碱基突变的核苷酸序列，序列长度为215bp (该序列与附图4的序列相同)。SEQ ID NO 3和4是扩增基因片段碱基突变引物对的核苷酸序列。图I :是本发明的技术流程图。图2 :本发明克隆的作为分子标记的猪CXCL12基因部分核苷酸序列，括号为碱基的突变位点，即G201-C201，序列首尾的阴影区为引物。图3 :是本发明中猪CXCL12基因部分序列扩增的电泳图谱，片段大小为387bp (琼脂糖胶浓度为I. 2% )。图中=Marker泳道为DNA分子量标准。图4 :是本发明中猪CXCL12基因部分序列，该序列包含在图2所不的序列中，括号内碱基的突变位点G195-C195即图2的G201-C201，首尾的阴影区为设计的引入酶切位点引物对，特别说明的是在该序列的下游引物中方框表示了 G将替代原碱基A(在原碱基A的位置引入错配的碱基G)，创造ー个酶切位点，导致该突变位点可被BsmAI (5’ GTCTCN/3’，3’ CAGAG (N) 5/5’ )识别。图5 :是本发明中猪CXCL12基因部分序列扩增的电泳图谱，片段大小为215bp(琼脂糖胶浓度为I. 2% )。图中=Marker泳道为DNA分子量标准。图6 :是猪CXCL12基因测序后发现的G201-C201突变位点(测序图为反向测序)。图7 :是本发明中猪CXCL12基因PCR-BsmAI-RFLP的三种基因型(CC，CG和GG)电泳图谱。
具体实施例方式实施例I :一、CXCL12基因部分片段的克隆和突变位点的筛选I.引物设计利用引物设计软件Primer 5.0,以猪CXCL12基因(GeneBank登录号AK237304. I)为模板设计出包含部分序列的扩增引物，用来扩增“杜长大”(由国外品种“杜洛克”，“长白”和“大白”三个品种杂交得到，是ー种中国普遍推广应用的商用猪)CXCL12基因的部分序列。引物由上海生物工程技术服务有限公司合成，引物对的DNA序列如下正向引物5’ -CAGTGGAAGGGTCATTTTCC-3 ’，
反向引物5’ -ATTAGGGGTCACCCAGCTCT-3 ’。2. PCR产物的纯化和测序(I) PCR 扩增PCR 扩增反应体系 20ul，包括 500ng 的 DNA，2. Oul 10XPCR buffer，O. 6ul IOmMdNTP, O. 8ul of each primer (IOuM) and IU Ampli Taq DNA polymerase (上海生エ生物工程技术公司)。PCR反应条件为PCR的反应程序为95°C 5min ；94°C 40s, 56. 3°C 30s，72°C 30s，34个循环；72°C延伸lOmin。扩增产物用I. 2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测(见图3)。(2) PCR产物的纯化及测序以5个猪品种(长白，大白，清平，金华，小梅山)的DNA为模板，每个品种内随机 挑选3个个体用于PCR扩增，回收猪5个品种PCR扩增产物，混合测序。利用北京天根生物技术公司生产的小量DNA片段纯化试剂盒进行纯化回收，具体方法參考该试剂盒的操作说明书。序列測定由上海生ェ生物工程技术公司完成。(3) DNA序列同源性检索鉴定通过NCBI-BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)工具，将测序后获得的序列与GenBank数据库中公布的參考序列(登录号AK237304. I)进行比对，结果显示成功克隆得到猪CXCL12基因部分序列387bp的片段(见图2和序列表SEQ ID NO :1)。(4) DNA序列中突变位点的筛选通过NCBI-BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)工具，将测序后获得的序列与GenBank数据库中公布的序列(登录号AK237304. I)进行比对，将5个猪品种的混合测序峰图导入SeqMan软件进行比对分析，结果显示在猪CXCL12基因部分序列I个位点出现明显的双峰，这说明该基因在这个位点处发生了碱基突变(见图6)。这个突变位点是G201-C201 (见序列表 SEQ ID NO :1 和图 2)。ニ、CRS-PCR-RFLP基因型检测方法的建立I.引物设计针对多态位点G201-C201引入酶切位点设计了ー对引物，用于基因型检测，其核苷酸序列序列分别如下所示(与序列表SEQ ID NO :3和4所示的序列相同)正向引物5’-AAGGGTCATTTTCCAAGTA-3’ (见序列表 SEQ ID NO 3)反向引物5’ -AgACTGCAGTGAAAATGATT-3” (将该引物序列的第2位的原碱基A错配成g，见序列表SEQ ID NO 4)2. PCR 扩增20uL 的反应体系中加入 DNA模板 I μ L，双蒸水 14.3 μ L，10 X PCR buffer 2. O μ L,IOmMdNTP 0. 6 μ L, IOuM 引物各 0. 8 μ L，Taq 酶 1U。PCR 反应条件为94°C预变性 5min 后，94°C变性 40s、56. 3°C退火 30s、72°C延伸 308，34个循环，最后72で延伸 lOmin。3μ L PCR产物经I. 2%琼脂糖凝胶电泳检测(见图5)，阳性样品用于下ー步酶切检测。3. RFLP 检测BsmAI-RFLP 检测分子标记 G201-C201将PCR产物8 μ L，10XBuffer I μ L，限制性内切酶BsmAI为4U，加双蒸水补至10μ L，将样品混匀后离心，37°C培养箱放置12h，酶切产物用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分型，银染并拍照。分子标记基因型分析如图7所示，分别代表G201-C201处单核苷酸多态性(SNP) 3种不同的基因型(基因型用其突变碱基表示)GG、CC、GC，电泳结果显示CC基因型(只有一条带，长度为215bp)、GG基因型(有两条带，长度为190bp和26bp)和CG基因型(有 3 条带，长度为 215bp/190bp/26bp)。聚丙烯酰胺凝胶的制备及RFLP的电泳检测a. 8 %聚丙烯酰胺凝胶的制备
表I 8%聚丙烯酰胺凝胶的制备
_双蒸水—__ — 18.5 ml
30%丙烯酰胺(29: I)9. 3 ml5XTBE 缓冲液7 ml
10%AP 溶液 0.23 ml _ TEMED _O. 02 ml __,B体积 _35 ml_b.灌胶沿着玻璃板边缘缓慢灌入丙烯酰胺胶液，注意避免气泡产生，当灌至离玻璃板上沿O. Icm时停止灌胶，插入梳子，倾斜胶板与平面成30度夹角，于室温聚合I小吋。c.上样、电泳凝胶聚合后拔掉梳子，用注射器吸取IXTBE缓冲液冲洗加样孔。组装好电泳设备，用O. 8%的琼脂糖胶封闭好玻璃板与电泳槽之间的缝隙，防止电泳缓冲液渗漏。向上下缓冲槽中倒入足量的IXTBE电泳缓冲液。用50 μ I的微量进样器将酶切产物缓缓注入梳孔。上样完毕后开启电泳仪电源，在100V恒压下电泳4小时。d.凝胶染色①电泳完毕，取下玻璃板，小心地将凝胶从玻璃板上剥离下来，放入双蒸水中漂洗一次;②浸入10%こ醇溶液固定lOmin。固定完毕，用双蒸水短暂洗涤凝胶(换水两次， 次 30s)；③用I %硝酸脱色3min，然后用双蒸水迅速漂洗一次；④浸入O. 2%硝酸银，避光，放在摇床上染15 25min ；⑤去离子水洗胶三遍，姆次Imin,加入3% Na2CO3M色,当显色合适时倒掉Na2CO3,迅速加入3%冰醋酸停止显色；⑥将凝胶置于凝胶成像系统暗箱内，进行扫描并保存电泳图谱。实施例2 CXCL12分子标记分型方法在免疫性状关联分析中的应用试验共检测了 437头“杜长大”猪个体的多态性，包括健康猪177头，康复猪131头，严重发病猪113头，死亡猪16头。用CRS-PCR-RFLP方法确定其基因型，并进行基因突变位点与猪繁殖与呼吸综合征的关联分析。应用SAS软件的Logistic回归模型分析方法，设定ー个基因型的OR值(0R值的全称是odd ratio，又称比值比，对于发病率很低的疾病来说，它的OR值即是相对危险度的精确估计值)为參考值(OR= 1)，计算另外2种基因型的OR值，如果OR值大于1，且P值小于O. 05，则此基因型可能是ー个危险因子，即猪群中携带此基因型的个体容易感染猪繁殖与呼吸综合征；反之，如果OR值小于1，且P值小于O. 05，则此基因型可能是保护因子，即猪群中携带此基因型的个体对猪繁殖与呼吸综合征有抵抗力。95% Cl表示OR值的95%置信区间(Andrew M. Smith MDΦ, Environmental Tobacco Smoke and Interleukin 4 Polymorphism(C-589T)Gene Environment Interaction Increases Risk of Wheezing in African-American Infants.The Journal of Pediatrics,2008,152(5) :709-715 ;Yen-Li Lo 等，ATM polymorphismsand risk of lung cancer among never smokers. Lung Cancer,2010,69(148-154))。(一)基因型检测结果表明在437个个体中GG基因型有183个个体，GC基因型有200个个体，CC基因型有54个个体。等位基因G与等位基因C在各个群体中的分布情况见表2，通过观察可以看出在“杜长大”中，G等位基因为优势等位基因。表2 CXCL12基因的SNP在群体中基因型频率和基因频率分布 群体样本含量基因型频率(频率/样本数)基因频率
权利要求
1.一种与猪免疫力相关的CXCL12基因片段，它的核苷酸序列如下所示 AAGGGTCATTTTCCAAGTAATCGAAGATATTTTAAAATCTCAAGGAAAATTTGAAAGCATCTTCCCCTGGAACCCATGAACCAGAGCCATTCAACCTCTTTCTCCAGTTAAATTCACAGGGCCCTAAATCTTGACCACAATTAAGGAAAGAATAATTTCTGTTTCTCCCCCTAGGGGGAAAATAGATAAAAGGA (G/C)AGACTGCAGTGAAAATGATT ； 在该序列第195bp处有I个G195-C195的碱基替换，导致BsmAI-RFLP多态性。
2.扩增权利要求I所述基因片段的引物对，其核苷酸序列如序列表SEQID N0:3和4所示。
3.权利要求I所述的基因片段在猪分子标记辅助选择中的应用。
4.权利要求2所述的引物对在猪分子标记辅助选择中的应用。
全文摘要
本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及一种作为猪标记辅助选择应用的与猪免疫力相关的分子标记的制备与应用。所述的分子标记由猪CXCL12基因克隆得到，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO2所示，在该序列第195bp处有1个G195-C195的碱基替换，导致BsmAI-RFLP多态性。本发明为猪的标记辅助选择提供了一个新的分子标记。
文档编号C12N15/11GK102690828SQ201110067529
公开日2012年9月26日 申请日期2011年3月21日 优先权日2011年3月21日
发明者任钰为, 刘文举, 刘耘, 宋利军, 张淑君, 张滢寅, 李翔, 杨利国, 梁爱心, 江一波, 童勤, 贾启涛 申请人:华中农业大学