专利名称：一种复合菌剂及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种复合菌剂及其制备方法和应用，特别涉及一种用于处理猪粪的复合菌剂及其制备方法和应用，属于农业生物技术领域。
背景技术：
随着养殖业的不断规模化发展，产生的大量禽畜粪便严重污染环境并制约了经济的发展，已经成为不可忽视的生态和环境保护的重要问题。2000年我国畜禽粪便产量已达 36. 4亿t，为同期工业固体废弃物量的3. 8倍，禽畜粪便特别是猪粪便大量的产生，引起了人们的高度关注。据统计，1头猪的日排泄粪尿按6kg计，则是人排粪尿量的5倍，年产粪尿约达2. 5t。随着人民生活水平的日益提高，我国的畜禽养殖业在未来20年中将进一步发展，将会带来更大的畜禽污染的压力。到2020年，我国的畜禽养殖业的规模将是2001年水平的1. 67倍，如果届时畜禽养殖业流失的污染物总量维持在2000年的水平，流失系数则要降低到目前水平的60%，畜禽养殖业的环境管理压力非常巨大。另一方面，畜禽粪便中除含有N、P、K三要素外，尚有Cu、Mg、S、i^e、ai等微量元素， 还富含刺激植物生长的某些特殊物质，如胡敏素和抗生素等，是富含有机质及营养养分的优质有机肥源，用畜禽粪便为原料制造的有机肥料和有机-无机复混肥，是一种完全肥料， 在农业上应用不仅可以提高农作物的产量，还能促进土壤团粒结构的形成，使土壤松软，增加土壤的透气性、透水性，从而改善土壤的理化性状。利用畜禽粪便制造有机肥料的传统方法是堆肥，将畜禽粪便与泥土、矿物质等混合，在高温、多湿的条件下，经发酵腐熟、微生物分解而制成有机肥料。在堆肥过程中存在氮素的挥发，将减少畜禽粪中的含氮量、降低其肥效，因而，在堆肥质量的优劣评价中，氮素的保存是一个很重要的指标。畜禽粪便的氮素挥发主要是新鲜畜禽粪在贮存过程中的低分子含氮化合物挥发，主要包括氨(NH3)、三甲胺[(CH3)3N]、二甲胺[(CH3)2NH]以及一甲胺 (CH3N),其中的氨、三甲胺是恶臭气体的重要组成部分，其挥发还会严重污染环境。在传统猪粪堆肥的升温及高温期，PH值较高，脱氨作用占主导，氮素的挥发主要是氨气的释放，同时，传统的堆肥方法所需腐熟周期较长，一般需要1-2个月，难以缓解日益增长的畜禽粪便处理压力。国内外解决这个问题的主要途径是应用微生物发酵菌剂处理禽畜粪便生产有机肥料，以缩短腐熟周期。目前，日本的EM菌剂(由芽孢菌、酵母菌、乳酸菌等有益菌类按一定比例组合而成)是受到公认的能快速腐熟畜禽粪便的一种复合菌剂。但这类菌剂在处理高蛋白含量类的禽畜粪便时，微生物在转化氮类物质的过程中，会产生大量的nh4+-N，NH4+-N, 这些物质的快速积累使PH值进一步提高，一部分铵态氮被微生物进一步转化为硝态氮和生物量态氮，另一部分则在堆温达到50°C以上、pH > 7的环境中，以气态的方式与其它大多数挥发性有机物(如甲硫醇、甲硫基等)一起挥发。这不仅是堆肥恶臭产生的主要原因及形式，而且也是堆肥氮素损失的主要形式之一。据研究报道，这种形式的损失占铵态氮的 10% 100%。
一般情况下，使用以EM菌剂为代表的复合菌剂进行高纤维含量禽畜粪便堆肥能极大缩短其腐熟周期，但由于猪粪是一种高蛋白含量的禽畜粪便，在腐熟过程中含氮有机物质的快速、大量分解会造成大量的氨挥发，氨气的大量产生不仅严重污染空气，对人畜的健康带来极大的危害，并且会由于氮素的损失而极大降低堆肥品质。因此，以EM菌剂为代表的这类菌剂不能单独应用于猪粪等含高蛋白的禽畜粪便堆肥。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中利用微生物菌剂处理畜禽粪便过程中所存在的上述不足，提供一种用于新的复合菌剂及其制备方法和应用。本发明所提供的复合菌剂可用于处理猪粪等高蛋白含量的畜禽粪便，不仅腐熟周期短，而且除臭保氮效果好。为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案
一种复合菌剂，它是由以下体积比例的组分组成短短芽孢杆菌(保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2010年6月3日，保藏编号为 CCTCC NO: M2010133，分类命名为短短芽孢杆菌 WZXl Brevibacillus brevis WZX1)发酵菌液10 40份、荧光假单胞菌(保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2010年6月3日，保藏编号为CCTCC NO: M2010135，分类命名为荧光假单胞菌WZX3 Pseudomonas fluorescens WZX3)发酵菌液10 40份、甘蔗热放线菌(保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2010年6月3 日，保藏编号为CCTCC NO: M2010134，分类命名为甘蔗热放线菌WZX2 Thermoactinomyces sacchari WZX2)发酵菌液15 45份，上述发酵菌液中每ml发酵液中菌数为4亿-7亿。上述复合菌剂中各发酵菌液体积比例的较佳选择为，短短芽孢杆菌发酵菌液 15 35份，荧光假单胞菌发酵菌液15 35份，甘蔗热放线菌20 40份。上述复合菌剂中各发酵菌液体积比例的最佳选择为，短短芽孢杆菌发酵菌液30 份、荧光假单胞菌发酵菌液30份、甘蔗热放线菌发酵菌液40份。上述复合菌剂中，所述短短芽孢杆菌是从兔粪中分离所得；荧光假单胞菌和甘蔗热放线菌菌株均从菌渣(香菇菌渣)中分离所得，三种菌株的保藏号分别为CCTCC NO M2010133, CCTCC NO:M2010135, CCTCC NO :M2010134。上述复合菌剂中，所述三株菌株的分离方法如下将腐熟的兔粪和腐熟的香菇菌渣分别作为样品，制成菌悬液，采用稀释平板法，从这两种材料中分离菌株，具体方法是分别取IOg样品，用无菌水稀释，依次制成10人10_2、 10_3、IO-4U6和10_7g/mL的菌悬液，将不同浓度梯度的菌悬液，分别注入ImL到培养皿中，然后倒入40-50°C的液体培养基(分三种牛肉膏培养基、PDA培养基、改良高氏一号培养基)中，各个培养皿小心混合均勻制成混菌平板，待培养基凝固后，将平板置于 45-50°C培养箱中倒置培养，至长出菌落为止，挑取单菌落，在相应的平板上分离纯化、保存。通过以上的分离试验步骤后，得到了 27株菌；再将每种菌株作为单一的菌剂投入到猪粪中，进行发酵堆肥，筛选出适合于猪粪堆肥的有效菌剂；得到三株有效菌株短短芽孢杆菌、荧光假单胞菌和甘蔗热放线菌。
所述筛选方法可以为通过监测每种菌株对猪粪堆肥腐熟速度和保氮的指标，严格计算分析后，筛选出适合于猪粪堆肥的有效菌剂。由上述试验得到三株有效菌株短短芽孢杆菌、荧光假单胞菌和甘蔗热放线菌。本发明复合菌剂的制备方法如下(1)斜面培养将分离得到的三个菌株在无菌条件下分别接入琼脂培养基，短短芽孢杆菌和荧光假单胞菌采用牛肉膏培养基，甘蔗热放线菌采用改良高氏一号培养基，在 45°C 50°C培养箱内(最佳温度为50°C )培养1 4天；(2) 一级种子培养将步骤1)培养得到的菌种在无菌条件下分别接种于各类菌对应的液体培养基中，在45°C 50°C条件下(最佳温度为50°C )，100 200r/min摇床培养 1 4天，制得一级种子；(3) 二级种子培养将一级种子分别接种于发酵罐中经120到125°C (最佳温度为121°C)灭菌25 30分钟，在45 50°C (最佳温度为50°C)培养1 4天，当每mL 发酵液中菌数达到4亿 7亿，制得二级种子；所述发酵罐中的发酵液pH值为7. 0-7. 3， 发酵液由水、大豆豆浆、淀粉、葡萄糖/蔗糖、碳酸钙和三氯化铁组成，发酵液中各组分的重量比例为水制备豆浆的大豆淀粉葡萄糖/蔗糖碳酸钙三氯化铁= 1000 6. 5 4 1 0. 1 0.01 ；(4)混合发酵培养按比例将步骤C3)制得的二级种子混合均勻，接于加入了麦麸皮的混合发酵罐中，室温培养2 4天，获得复合菌剂；二级种子与麦麸皮的体积比为 1 15 1 20。本发明还提供上述复合菌剂的用途，该复合菌剂适用于猪粪堆肥。本发明的复合菌剂用于猪粪堆肥的具体方法步骤如下(1)向猪粪原料中加入稻草，使有机物料中C/N质量比为20-30 1、含水重量为 50% -60%、pH 值 7-7. 5 ；(2)按每IOOOg有机物料加入50_80mL发酵菌液的比例，向步骤(1)得到的有机物料中加入复合菌剂，混合均勻后堆积发酵；(3)堆肥温度升至50°C时，按每IOOOg有机物料加入20_50mL发酵菌液的比例投
加复合菌剂，拌勻；每隔3天进行人工翻堆，直至猪粪腐熟。本发明从兔粪、菌渣中分离出短短芽孢杆菌、荧光假单胞菌和放线菌甘蔗热放线菌三株菌株，并将分离得到的菌株的发酵菌液按适当比例混合，组成复合菌剂。本发明的复合菌剂具有较强的分解能力，在一定的C/N、湿度、pH条件下，复合菌剂中的微生物能加速降解有机物料，产生C02、H20、NH3等气体并释放能量，生成大量小分子物质，微生物利用主发酵产生的易分解小分子有机物及营养物质进行生长，使这些小分子物质进一步分解，变成可被植物吸收利用的有效态N、P、K化合物及稳定的腐殖酸和氨基酸物质。本发明的复合菌剂能加速有机物料的降解，且能减少有机氮转化为气态形式的氮，使得在猪粪堆肥发酵过程中能表现出较强的抑氨能力和分解能力，在加快猪粪腐熟的同时释放较小量的氨气。与现有技术相比，本发明的有益效果本发明的复合菌剂能适应与堆肥环境的中高温，在猪粪堆肥前期加入复合菌剂后，菌剂能迅速生长繁殖，对堆肥有机物进行快速降解，并能有效减少氨气的产生。通过实际堆肥，与不接复合菌剂的试验处理比较，用该菌剂生产猪粪堆肥只需14 18天，比传统堆肥缩短腐熟进程1 2倍，对氨气的抑制率可高达70%，氮素积累增加9% 10%。因此，通过该复合菌剂的作用，猪粪堆肥能达到快速腐熟并降低氨气挥发，从而减少恶臭的产生及氮素损失。
图1为不同处理堆肥pH值的变化；图2为不同处理对猪粪堆肥氨气量的影响；图3不同处理猪粪堆肥种子发芽率的变化。
具体实施例方式下面结合试验例及具体实施方式
对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。一、菌株的分离本发明列举的实施例中的菌株是按如下方法分离得到的将腐熟的兔粪和腐熟的香菇菌渣分别作为样品，制成菌悬液，采用稀释平板法，从这两种材料中分离菌株，具体方法是分别取IOg样品，用无菌水稀释，依次制成10人10_2、 10_3、10_4、10_5、IO-6和10_7g/mL的菌悬液，将不同浓度梯度的菌悬液，分别注入ImL到培养皿中，然后分别倒入40-50°C的不同液体培养基(液体培养基分别为牛肉膏培养基、PDA培养基、改良高氏一号培养基)中，各个培养皿小心混合均勻制成混菌平板，待培养基凝固后， 将平板置于45-50°C培养箱中倒置培养，至长出菌落为止，挑取单菌落，在相应的平板上分离纯化、保存。通过以上的分离试验步骤后，得到了 27株菌。再将每种菌株作为单一的菌剂投入到猪粪中，进行发酵堆肥，通过监测每种菌株对猪粪堆肥腐熟速度和保氮的指标，严格计算分析后，筛选出适合于猪粪堆肥的有效菌剂。由上述试验得到三株有效菌株短短芽孢杆菌、荧光假单胞菌和甘蔗热放线菌。二、菌株的鉴定将筛选得到的三菌株送由生工生物工程(上海)有限公司鉴定，其中短短芽孢杆菌肉色、革兰氏阳性、杆状；荧光假单胞菌革兰氏阴性、杆状；甘蔗热放线菌在气丝和基丝上都产生单个孢子，孢子浑圆形、多面体形，着生在短柄上，气丝较短，菌丝体很快溶解，留下孢子厚层，使菌落外貌如细菌。短短芽孢杆菌16S rDNA基因序列见序列表中第1 序列，荧光假单胞菌16S rDNA基因序列见序列表中第2序列，甘蔗热放线菌16S rDNA基因序列见序列表中第3序列，得出三菌株分别为短短芽孢杆菌(Brevikicillus brevis)、 焚光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)禾口方文线菌甘蔴热方文线菌(Thermoactinomyces sacchari)。三、复合菌剂的制备本发明列举复合菌剂的制备方法如下(1)斜面培养将分离得到的菌株在无菌条件下分别接入琼脂培养基，短短芽孢杆菌和荧光假单胞菌采用牛肉膏培养基，甘蔗热放线菌采用改良高氏一号培养基，在 45°C 50°C培养箱内培养1 4天；
(2) 一级种子培养将步骤(1)培养得到的菌种在无菌条件下分别接种于各类菌对应的液体培养基中(细菌采用牛肉膏培养基，甘蔗热放线菌采用改良高氏一号培养基，)，在45°C 50°C条件下(最佳温度为50°C )，100 200r/min摇床培养1 4天，制得一级种子；(3) 二级种子培养将一级种子分别接种于发酵罐中经120 125°C (最佳温度为 121°C )灭菌25 30分钟，在45 50°C培养1 4天，当每mL发酵液中菌数达到4亿 7亿，制得二级种子；所述发酵罐中的发酵液pH值为7. 0-7. 3，发酵液由水、大豆豆浆、淀粉、 葡萄糖/蔗糖、碳酸钙和三氯化铁组成，发酵液中各组分的含量为水1000kg，6. 5kg大豆制备的豆浆(质量百分浓度为6 % 8 % )，淀粉4kg，葡萄糖1kg，碳酸钙100g，三氯化铁IOg ；(4)混合发酵培养按比例将步骤( 制得的二级种子混合均勻，接于加入了麦麸皮的混合发酵罐中，培养2 4天，获得复合菌剂；所述发酵罐中的发酵液组成同步骤中发酵液，发酵液与麦麸皮的体积比为1 15 1 20。四、复合菌剂的用途。本发明列举的复合菌剂用于猪粪堆肥的具体方法步骤如下(1)向猪粪原料中加入稻草，使有机物料中C/N的质量比为20-30 1、含水重量为 50% -60%、pH 值 7-7. 5 ；(2)按每IOOOg有机物料加入50_80mL发酵菌液的比例，向步骤(1)得到的有机物料中加入复合菌剂，混合均勻后堆积发酵；(3)堆肥温度升至50°C时，按每IOOOg有机物料加入20_50mL发酵菌液的比例投加复合菌剂，拌勻；每隔3天进行人工翻堆，直至猪粪腐熟。五、具体实施例实施例1本实施列举的用于处理猪粪的复合菌剂，它是由以下体积比例的组分组成短短芽孢杆菌发酵菌液15份、荧光假单胞菌发酵菌液40份、甘蔗热放线菌发酵菌液45份，按照上述复合菌剂的制备方法制备而成。每mL发酵菌液中含细菌或放线菌约4亿。复合菌剂培养完成后，按上述复合菌剂用于猪粪堆肥的具体方法投加入猪粪堆肥进行发酵。在堆制发酵的第2，5，10，15，20天取样分析，每2 3天更换硼酸吸收液。新鲜堆肥样品按固液比1 10( 1，以干重计)加入一定量的去离子水，在1501~/1^11的速度下振荡浸提lh，测定悬浮液的pH值。测定pH后经过过滤得到的滤液，进行种子发芽率试验。 其余样品于实验室自然风干，用于测定全氮。采用稀酸滴定硼酸溶液计算氨气量。实施例2本实施列举的用于处理猪粪的复合菌剂，它是由以下体积比例的组分组成短短芽孢杆菌发酵菌液40份、荧光假单胞菌发酵菌液15份、甘蔗热放线菌发酵菌液45份。每 mL发酵菌液中含细菌或放线菌约4亿。实施例3本实施列举的用于处理猪粪的复合菌剂，它是由以下体积比例的组分组成短短芽孢杆菌发酵菌液40份、荧光假单胞菌发酵菌液40份、甘蔗热放线菌发酵菌液20份。每 mL发酵菌液中含细菌或放线菌6亿。实施例4
本实施列举的用于处理猪粪的复合菌剂，它是由以下体积比例的组分组成短短芽孢杆菌发酵菌液30份、荧光假单胞菌发酵菌液30份、甘蔗热放线菌发酵菌液40份。每 mL发酵菌液中含细菌或放线菌4亿。此实施例为最佳实施例。最佳实施例的试验结果附图1，图2，图3，表1和表2。经试验结果分析，添加了复合菌剂WZl使猪粪堆肥的整个发酵周期缩短为为13 16天，并且与对照相比，复合菌剂处理的抑氨率达70%以上，氮素增加率达9% 10%，说明复合菌剂WZl有效地提高了堆肥品质并大大缩短猪粪堆肥腐熟时间，节约了成本。表1.复合WZl对氨气的抑制效果
权利要求
1.一种复合菌剂，其特征在于它是由以下体积比例的组分组成短短芽孢杆菌发酵菌液10 40份、荧光假单胞菌发酵菌液10 40份、甘蔗热放线菌发酵菌液15 45份，上述发酵菌液中每ml发酵液中菌数为4亿-7亿。
2.根据权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于各发酵菌液体积比例为短短芽孢杆菌发酵菌液15 35份，荧光假单胞菌发酵菌液15 35份，甘蔗热放线菌20 40份。
3.根据权利要求2所述的复合菌剂，其特征在于各发酵菌液体积比例为短短芽孢杆菌发酵菌液30份、荧光假单胞菌发酵菌液30份、甘蔗热放线菌发酵菌液40份。
4.根据权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于复合菌剂中所述短短芽孢杆菌是从兔粪中分离所得；荧光假单胞菌和甘蔗热放线菌菌株均从香菇菌渣中分离所得，三种菌株的保藏号分别为短短芽孢杆菌CCTCC NO :M2010133，荧光假单胞菌CCTCC NO :M2010135， 甘蔗热放线菌CCTCC NO :M2010134o
5.根据权利要求4所述的复合菌剂，其特征在于所述短短芽孢杆菌、荧光假单胞菌和甘蔗热放线菌菌株的分离方法如下将腐熟的兔粪和腐熟的香菇菌渣分别作为样品，制成菌悬液，采用稀释平板法，从这两种材料中分离菌株，具体方法是分别取IOg样品，用无菌水稀释，依次制成10_\10_2、10_3、 10_4、10_5、10_6和10_7 g/mL的菌悬液，将不同浓度梯度的菌悬液，分别注入ImL到培养皿中， 然后分别倒入40-50°C的牛肉膏培养基、PDA培养基或改良高氏一号培养基中，各个培养皿小心混合均勻制成混菌平板，待培养基凝固后，将平板置于45-50°C培养箱中倒置培养，至长出菌落为止，挑取单菌落，在相应的平板上分离纯化、保存；通过以上的分离试验步骤后，得到了 27株菌；再将每种菌株作为单一的菌剂投入到猪粪中，进行发酵堆肥，筛选出适合于猪粪堆肥的有效菌剂；得到三株有效菌株短短芽孢杆菌、荧光假单胞菌和甘蔗热放线菌。
6.权利要求1-5任意一项所述的复合菌剂的制备方法，包括如下步骤(1)斜面培养将分离得到的三个菌株在无菌条件下分别接入琼脂培养基，短短芽孢杆菌和荧光假单胞菌采用牛肉膏培养基，甘蔗热放线菌采用改良高氏一号培养基，在45°C 50°C培养箱内培养1 4天；(2)—级种子培养将步骤1)培养得到的菌种在无菌条件下分别接种于各类菌对应的液体培养基中，在45°C 50°C条件下，100 200r/min摇床培养1 4天，制得一级种子；(3)二级种子培养将一级种子分别接种于发酵罐中经120到125°C灭菌25 30分钟， 在45 50°C培养1 4天，当每mL发酵液中菌数达到4亿 7亿，制得二级种子；所述发酵罐中的发酵液PH值为7. 0-7. 3，发酵液由水、大豆豆浆、淀粉、葡萄糖/蔗糖、碳酸钙和三氯化铁组成，发酵液中各组分的重量比例为水制备豆浆的大豆淀粉葡萄糖/蔗糖碳酸钙三氯化铁=1000:6. 5:4:1:0. 1:0.01 ；(4)混合发酵培养按比例将步骤(3)制得的二级种子混合均勻，接于加入了麦麸皮的混合发酵罐中，室温培养2 4天，获得复合菌剂；二级种子与麦麸皮的体积比为1 :15 1 :20 ο
7.根据权利要求6所述复合菌剂的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述培养箱的温度为50°C。
8.根据权利要求6所述复合菌剂的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述灭菌温度为121°C。
9.权利要求1-6任意一项所述复合菌剂的用途，其特征在于所述复合菌剂适用于猪粪堆肥。
10.根据权利要求9所述的复合菌剂的用途，其特征在于所述复合菌剂用于猪粪堆肥的具体方法步骤如下(1)向猪粪原料中加入稻草，使有机物料中C/N质量比为20-30:1、含水重量为 50%-60%、pH 值 7-7. 5 ；(2)按每IOOOg有机物料加入50-80mL发酵菌液的比例，向步骤(1)得到的有机物料中加入复合菌剂，混合均勻后堆积发酵；(3)堆肥温度升至50°C时，按每IOOOg有机物料加入20-50mL发酵菌液的比例投加复合菌剂，拌勻；每隔3天进行人工翻堆，直至猪粪腐熟。
全文摘要
本发明公开了一种复合菌剂及其制备方法和应用，属于农业生物技术领域。本发明的复合菌剂，是由以下体积比例的组分组成短短芽孢杆菌发酵菌液10～40份、荧光假单胞菌发酵菌液10～40份、甘蔗热放线菌发酵菌液15～45份，上述发酵菌液中每ml发酵液中菌数为4亿-7亿。本发明从兔粪、菌渣中分离出短短芽孢杆菌、荧光假单胞菌和放线菌甘蔗热放线菌三株菌株，并将分离得到的菌株的发酵菌液按适当比例混合，组成复合菌剂。本发明的复合菌剂能加速有机物料的降解，且能减少有机氮转化为气态形式的氮，使得在猪粪堆肥发酵过程中能表现出较强的抑氨能力和分解能力，在加快猪粪腐熟的同时释放较小量的氨气。
文档编号C12R1/08GK102199562SQ20111006864
公开日2011年9月28日 申请日期2011年3月22日 优先权日2011年3月22日
发明者周锐, 曾敏, 曾晰菀, 李冰, 李启权, 杨娟, 王昌全, 袁大刚 申请人:四川农业大学