专利名称：登革病毒样颗粒及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体内容为应用毕赤酵母制备登革病毒样颗粒的方法及应用。
背景技术：
登革病毒(dengue virus，DENV)以伊蚊为传播媒介，感染人可引起登革热 (dengue fever, DF)、登革出血热(dengue hemorrhagic fever, DHF)禾口登革休克症 (dengue shock syndrome, DSS)。DHF/DSS病情严重，病死率高，其发病机制至今尚未阐明。由于缺乏有效的登革病毒疫苗，加上控制蚊媒的实际困难，使登革病毒感染流行的地域和流行强度在不断地扩大。目前登革热在全球许多地方卷土重来，已成为世界上分布最广、 发病最多、危害较大的一种虫媒病毒性疾病。因此，加强DENV致病机制、疫苗的研究及快速诊断试剂盒的研制已经成为十分迫切的问题。登革疫苗的研究已经有近百年的历史，但目前还尚无成功的疫苗问世。制约登革疫苗研究的因素主要有以下几个方面(1)缺乏合适的、能模拟人体感染DENV临床症状的动物模型；O)对DENV感染导致DHF和DSS的具体机制尚不清楚；(3) DENV不同型之间存在抗体依赖的感染增强作用(antibody-d印endent enhancement, ADE)。因此研制DENV疫苗需要对4个型都有均衡的保护作用，因此增加了研制的难度。病毒样颗粒(Virus-like particles, VLPs)疫苗的出现为研发新型安全高效的疫苗提供了一个新的契机。VLPs是指由病毒的一个或多个结构蛋白组装成的，不含病毒核酸，不能进行自主复制的空心颗粒。由于VLPs不包含病毒DNA或RNA，因此不存在毒力的回复和同源重组的隐患。同时，VUs保留了与天然病毒粒子相同或类似的空间构型和诱导中和抗体的抗原表位，具有很强的免疫原性。不但能诱导产生体液免疫，而且可以激发 CD4+T细胞的增殖和CTL反应(cytotoxic T lymphocyte)。目前多数病毒的VLPs是通过体外表达系统来实现有效的自我组装，其中包括HIV, Influenza A virus, Hantaan virus, Rotavirus, Papillomavirus 等病毒。登革病毒为黄病毒科黄病毒属的成员，为单股正链RNA病毒，基因组长约111Λ，含有一条单一的开放读码框。基因排列顺序为5，-NCR-C- PrM/M-E-NSl-NS2A-NS2B-NS3-NS4 A-NS4B-NS5-NCR-3'，共编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白。其中E基因编码的E蛋白为病毒表面包膜糖蛋白，具有与细胞表面受体结合，介导膜融合，诱导产生中和抗体等多种生物学功能，是病毒最重要的抗原成份。PrM基因编码的PrM/M蛋白也被认为是诱导产生中和抗体的抗原成分。非结构基因及非编码区主要与病毒复制及蛋白翻译有关。有报道称，黄病毒的包膜E蛋白与prM蛋白在体外表达系统中共表达时，可折叠为类似天然病毒粒子空间结构的多聚体颗粒即病毒样颗粒，也称作亚病毒颗粒(subviral particles，SVPs)。在登革病毒方面，有研究者应用酵母系统、CH0-K1细胞等进行了 VUs表达的尝试，但DENV VLPs 在哺乳动物细胞中的低水平表达以及蛋白功能的维护一直是阻碍登革VLPs疫苗发展的瓶颈。因此，选择合适的DENV VUs表达系统，并采取合理的策略提高VUs表达产量和分泌水平成为了发展DENV VUs疫苗急需解决的问题。目前，相关研究中尚未发现有在毕赤酵母真核系统中分泌表达四个型登革病毒病毒样颗粒研究的报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供登革病毒1-4病毒样颗粒。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案
本发明首先构建用于不同重组表达子所采用的引物序列，分别可扩增登革病毒SprME 基因，其长度为1983 bp，编码prM信号肽，prM蛋白和全长的E蛋白。又可扩增到的是 SprME472基因，其长度为1914 bp，编码prM信号肽，prM蛋白和TM2端截断的E蛋白。本发明还提供用于表达DENVl 4病毒样颗粒的基因元件。其是采用RT-PCR技术获得了 DENV-I GZ01/95 株、DENV-2 ZS01/01 株、DENV-3 H87 株以及 DENV-4 H241 株的 prM-Ε蛋白编码基因序列。为了使登革病毒VUs能获得高效表达，我们对1 4型登革病毒CprM-E或prME基因的表达元件进行了改造，包括在prM基因N端设计理想的信号肽序列，替换四型登革病毒E基因锚定区的部分基因等，本发明构建并表达了截去E蛋白TM2 (E蛋白47ha-496aa)端的prME472和含全长E蛋白的prME，最终确定了表达VLPs的最佳构建策略。四型登革病毒prM-Ε基因元件分别命名为DENVl-PrME，DENV2_sPrME472， DENV3-sPrME, DENV4_sPrME。本发明还提供能够分泌表达四个型登革病毒样颗粒的P. pastoris酵母菌株。其是通过特异的限制性酶切位点Bspll9I和)(ba I，分别将上述的四个型别登革病毒prM-E基因元件克隆入真核系统表达载体pGAPZ α A中。分别命名为1型登革病毒样颗粒毕赤酵母表达工程菌pGAPZ-a-PrMEDl-X33、II型登革病毒样颗粒毕赤酵母表达工程菌pGAPZ-sPrME472-D2-X33、III型登革病毒样颗粒毕赤酵母表达工程菌 pGAPZ-sPrME-D3-X33和IV型登革病毒样颗粒毕赤酵母表达工程菌pGAPZ_sPrME-D4_X33， 再将重组载体转化到P. pastoris酵母菌X33内，获得稳定表达登革病毒病毒样颗粒的工程菌，分别于2011年3月14日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，编号分别为CCTCC M 2011063、CCTCC M 2011064、CCTCC M 2011065 和 CCTCC M 2011066。本发明还提供上述基因编码的登革病毒样颗粒的制备方法，其步骤包括
1)采用RT-PCR 技术从 DENV-I GZ01/95 株、DENV-2 ZS01/01 株、DENV-3 H87 株以及 DENV-4 H241株中分别获得四个型登革病毒的prM_E基因元件；
2)对1 4型登革病毒CprM-E或prME基因的表达元件进行了改造，包括在prM基因 N端设计理想的信号肽序列，替换四型登革病毒E基因锚定区的部分基因；
3)将四个型登革病毒的prM-E基因改造元件分别克隆入真核系统表达载体中；
4)用3)中得到的重组表达载体分别转染Az^1Stori1S酵母X33细胞，并使其分泌表达登革病毒病毒样颗粒；
5)用SDS-PAGE、Wfesternblot技术，检测目的基因表达。6)用15-60%蔗糖密度梯度离心和电镜技术，检测病毒样颗粒的形态特征。本发明进一步提供上述基因编码的登革病毒样颗粒在预防登革类疾病中的应用。 本发明分别用DENVl 4-VLPs单价、双价及四价配伍免疫Balb/c小鼠，能诱发中和抗体、 细胞免疫及免疫记忆反应，为登革病毒疫苗研制奠定了基础。
与现有技术相比，本发明采用如下技术方案
本发明采用非甲醇依赖的/7 .pastoris酵母系统制备登革病毒样颗粒，国内外尚未见报道，具有创新性。该系统制备的登革病毒样颗粒能用于制备疫苗，既克服了目前减毒活疫苗、亚单位疫苗和载体疫苗等登革疫苗研究中的诸多缺点，具有安全高效、适于规模化生产的优势。
图1是本发明所使用的pGAPZ α A表达载体结构示意图，该载体包含组成型的GAP 启动子，编码酿酒酵母α信号肽基因序列和编码抗kocin抗生素的基因。图2是本发明重组载体构建示意图，A 登革病毒包膜蛋白prM和E。Hl (400-413 aa)和H2 (430-449 aa)代表预测的E蛋白C末端茎干部位的α-螺旋区域。CS (413-430 aa)代表间隔Hl和Η2螺旋的区域。TMl (449-472 aa)和TM2 (473-495 aa)代表预测的 E蛋白跨膜区域。箭头代表信号肽酶的切割位点。B:不同重组表达载体的构建。PeAP代表 pGAPZ α A中的GAP启动子。S代表prM的信号肽序列，α代表pGAPZ α A中的α信号肽序列。图3是本发明构建的重组载体酵母转化子用GAP通用引物PCR鉴定结果，其中泳道1是空载体转化子对照，2 4是PGAPZ-sPrME472转化子，5是酵母X33对照，6 9是 pGAPZ-sPrME 转化子，10、11 是 pGAPaZ-sI^rME 转化子。图4是本发明构建的重组载体酵母转化子用目的基因特异引物PCR鉴定结果，其中泳道2 4是pGAPZ-sPrME转化子。图5亦是本发明构建的重组载体酵母转化子用目的基因特异引物PCR鉴定结果， 其中泳道2 4是pGAPZ-sPrME472转化子。图6是本发明VLPs在酵母细胞中表达的Wfestern blot鉴定图，其中1、2分别是pGAPaZ-PrME转化子表达细胞裂解液和表达上清与登革病毒特异性单抗反应的Western blot鉴定结果，3、4分别是PGAPZ-sPrME472转化子表达细胞裂解液和表达上清与登革病毒特异性单抗反应的^festern blot鉴定结果，5、6分别是pGAPZ-sPrME转化子表达细胞裂解液和表达上清与登革病毒特异性单抗反应的Western blot鉴定结果，可见在各重组子的细胞裂解液和发酵上清均可检测到约50 kDa的E蛋白和20 kDa prM蛋白。图7是本发明用蔗糖密度梯度离心法纯化表达的VLPs的Western blot鉴定图， 其中Al 3是pGAPaZ-PrME转化子表达VLPs在30%、35%、40 %蔗糖层收集，Bl 3是 pGAPZ-sPrME转化子表达VLPs在30 %、35 %、40 %蔗糖层收集，可见本发明表达的登革病毒 VLPs含有E、PrM禾口 M蛋白。图8是本发明得到的VLPs的负染电镜照片，直径为30 nm和55 nm直径的VLPs 均被检测到，且具有与天然登革病毒颗粒相似的形态。图9是本发明得到的VUs的免疫电镜照片，其中A、B是细胞裂解液中的VLPs，C、D 是表达上清浓缩液中的VLPs，所用抗体为登革病毒多抗血清，亦观察到直径为30 nm和55 nm直径的VLI3S。图10是本发明得到的VLPs的透射电镜照片，其中A是酵母X33对照，B是本发明构建的转化子，在酵母细胞的胞浆中形成了许多双层膜囊泡结构，每个囊泡中都充满了直径约为30-55 nm左右呈结晶状排列的VLPs。图11是本发明VLPs免疫小鼠的血清效价随时间变化的水平测定，其中PBS为PBS 免疫Balb/C小鼠阴性对照，PrME代表pGAPZ-sI^rME VLPs免疫Balb/C小鼠，CPrME代表 pGAPZ-sCPrME VLPs 免疫 Balb/C 小鼠。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1 DENVl 4VLPs基因表达元件最佳构建策略的确定一、DENVl 4病毒培养及病毒RNA的抽提
将 DENV-I GZ01/95 株、DENV-2 ZS01/01 株、DENV-3 H87 株以及 DENV-4 H241 株分别接种C6/36细胞单层上，加入含洲灭活小牛血清的MEM培养液，于37°C培养至出现细胞病变达“+++ ++++”，收集上清进行RNA的制备。采用Trizol试剂法提取培养上清总 RNA。Trizol LS试剂为美国hvitrogen公司产品。二、DENVl 4 prME基因元件的制备
采用 ThermoScript RT-PCR System (美国 hvitrogen)将 DENV1-4 的 RNA 反转录合成cDNA第一链。反应体系模板RNA (5-10 μ g)8 μ 1，引物 R 2 μ l,dNTPs (IOOmM)2 μ 1，DEPC 水3 μ L·总体积15 μ 1，将上述成分混勻并在65°C水浴5 min，迅速在冰上预冷2 min以上。加入下列成分5X PrimeScript buffer 4 μ 1, RNase Inhibitor(40 U/μ 1)1 μ 1， Reverse Transcriptase (200 U/μ 1) 0. 5 μ 1。反应条件42°C保温30 min，70°C 15 min。得到的cDNA 用于 PCR 扩增，PCR 反应体系10 X LA Buffer (Mg2+ free) 5 μ 1， MgCl2 5 μ 1，dNTPs 8 μ 1，cDNA 5 μ 1，引物 F、R 各 2 μ 1，LA Taq 酶 1 μ 1，ddH20 22 μ 1。 实施例2 能分泌表达DENVl 4VLPs的重组载体的构建及鉴定一、重组载体的构建
将实施例1中制备的PrME基因经Bspll9 I和)(ba I双酶切后回收目的片段，与经同样双酶切的PGAPZaA载体anvitrogen公司产品)定向连接，连接产物转化五coli DH5 a (美国Mratagene公司产品)感受态细胞，挑取单克隆接种含有抗生素的LB培养基进行 37°C振荡培养过夜，质粒经小量制备后酶切及测序鉴定。选取鉴定正确的质粒分别命名为 pGAPZ-a -PrMED 1、pGAPZ_sPrME472_D2、pGAPZ_sPrME_D3 和 pGAPZ_sPrME_D4，将鉴定正确的重组载体转化到P. pastoris酵母细胞中，获得稳定表达的工程菌，分别于2011年3月"2 C IG irnii结果如图2所示。四、DENVl 4VLPs 的 Western blot 鉴定
挑取经PCR鉴定为阳性的含有重组载体pGAPZ- α -PrMEDl，pGAPZ-sPrME472_D2， pGAPZ-sPrME-D3，pGAPZ_sPrME_D4，的酵母转化子分别接种于3 ml YPD液体培养基 (100 μ g/ml Zeocin)中，30 °C, 250 rpm有氧振荡培养12 h。接着按1:100比例将菌液转至100 ml新鲜YPD发酵培养液中，30 ！振荡培养120 h，4 V 10,000 rpm离心，分别收集上清和菌体，保存于一 70 °C备用。用裂解缓冲液(50 mM NaH2PO4, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA, 5% glycerol, pH 7. 4)裂解细胞。以空载体pGAP α A的Χ33转化子作对照。取80 μ 1上清与20 μ 1 5Χ上样缓冲液混合，20 μ 1细胞裂解液与等量的2Χ上样缓冲液混合，煮沸10 min。样品冷却后，进行SDS-PAGE。每个点样孔加30 μ 样品。电泳结束后，将一块胶进行考马斯亮蓝染色，相同点样顺序的另一块胶进行Western blotting 检测。经半干电转法，将蛋白转移到PDVF膜上，以DENVl 4的抗E单抗(商品化试剂)或以抗DENVl 4免疫的多抗血清为一抗，HRP标记羊抗鼠IgG为二抗(1 :2000美国Sigma)，
权利要求
1.登革病毒1-4病毒样颗粒重组载体转化的P./^astoris酵母菌株，其分另Ij 为 pGAPZ- α -PrMEDl-X33、pGAPZ_sPrME472-D2_X33、pGAPZ-sPrME-D3-X33 禾口 pGAPZ-sPrME-D4-X33，分别于2011年3月14日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心， 编号分别为 CCTCC M 2011063、CCTCC M 2011064、CCTCC M 2011065 和 CCTCC M 2011066。
2.登革病毒1-4病毒样颗粒，其特征在于由权利要求1所述重组载体转染A/^astoris 酵母X33细胞并分泌所得。
3.登革病毒1-4病毒样颗粒的制备方法，其特征在于包括如下步骤1)采用RT-PCR 技术从 DENV-I GZ01/95 株、DENV-2 ZS01/01 株、DENV-3 H87 株以及 DENV-4 H241株中分别获得四个型登革病毒的prM_E基因元件；2)对1 4型登革病毒CprM-E或prME基因的表达元件进行改造，在prM基因N端设计理想的信号肽序列，替换四型登革病毒E基因锚定区的部分基因；3)将四个型登革病毒的prM-E基因改造元件分别克隆入真核系统表达载体中；4)用3)中得到的重组表达载体分别转染Az^1Stori1S酵母X33细胞，并使其分泌表达登革病毒病毒样颗粒；5)用SDS-PAGE和Westernblot检测目的基因表达；6)用15-60质量％蔗糖密度梯度离心和电镜技术，检测病毒样颗粒的形态特征。
4.登革病毒1-4病毒样颗粒在制备预防登革类疾病的疫苗中的应用。
全文摘要
本发明公开了登革病毒样颗粒及其制备方法与应用。登革病毒1-4病毒样颗粒重组载体转化的P.pastoris酵母菌株，其分别为pGAPZ-α-PrME-D1-X33、pGAPZ-sPrME472-D2-X33、pGAPZ-sPrME-D3-X33和pGAPZ-sPrME-D4-X33，分别于2011年3月14日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，编号分别为CCTCCM2011063、CCTCCM2011064、CCTCCM2011065和CCTCCM2011066。登革病毒1-4病毒样颗粒，由权利要求1所述重组载体转染P.pastoris酵母X33细胞并分泌所得。本发明采用非甲醇依赖的P.pastoris酵母系统制备登革病毒样颗粒，国内外尚未见报道，具有创新性。该系统制备的登革病毒样颗粒能用于制备疫苗，既克服了目前减毒活疫苗、亚单位疫苗和载体疫苗等登革疫苗研究中的诸多缺点，具有安全高效、适于规模化生产的优势。
文档编号C12N7/04GK102363751SQ20111007504
公开日2012年2月29日 申请日期2011年3月24日 优先权日2011年3月24日
发明者刘岩, 周俊梅, 江丽芳, 黎孟枫 申请人:中山大学