专利名称：一种人血管eNOS基因启动子改构体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种人血管eNOS基因启动子改构体及其制备方法和应用。
背景技术：
人血管内皮一氧化氮合酶(eNOS)不仅参与了血压调整、血管通透性调节、防止白细胞粘附和血小板聚集等生理过程，而且涉及高血压、动脉粥样硬化性心脏病、血管狭窄和阻塞、缺血性脑卒中等诸多严重病理过程的发生和发展。eNOS基因在心血管内皮细胞中固有表达，越来越多的研究证明eNOS在有害因素存在下对维持血压自稳和血管完整性及张力必不可少，eN0S的表达异常在高血压、动脉粥样硬化、血管功能障碍相关性疾病的发生和发展中至关重要。目前有关人血管eNOS基因的研究主要聚焦于上调或下调eNOS活性的刺激因素，eNOS基因启动子中顺式调控元件的功能，eNOS基因多态性及eNOS基因表达的信号调控通路。传统认为eNOS基因主要对血管壁切应力刺激应答，之后发现很多刺激因素都能明显改变eNOS基因的表达，如缺氧、溶血磷脂酰胆碱、塞利洛尔、黄酮类化合物、非诺贝特、神经酰胺和氧化低密度脂蛋白等。尽管发现影响人血管eNOS基因表达的因素越来越多，但目前对它们如何上调或下调eNOS基因的表达却知之甚少。关于eNOS基因的多态性与相关疾病的潜在联系，有文献表明G894 — T多态性可导致所编码的氨基酸的GlM98Asp多态性，GlM98Asp的错义导致eN0S在此处的构象发生改变，由α-螺旋变为紧密折叠，由此推测此突变可能影响eNOS蛋白的功能，使NO 生成减少，导致血小板聚集性增强，白细胞向内皮黏附，平滑肌细胞增生等病理生理现象。有关eNOS基因表达的信号调控通路，新发现激活丝裂原活化蛋白激酶家族成员细胞外信号调节激酶ERK1/2信号通路可显著上调eNOS基因的转录活性。另一些刺激因素如溶血磷脂酰胆碱也可以通过激活c-jun氮末端激酶JNK信号通路上调eNOS基因的转录活性，而丝裂原活化蛋白激酶P38信号通路的活化则显著下调其活性，这种作用可被靶向 SiRNA沉默ρ38α基因而取消。Seiichiroffariishi等(1995)研究eNOS基因启动子顺式调控元件的功能，发现 SPl元件对转录活性起关键作用。SPl结合位点同时受到位于上游-203位点的GATA位点的调节，当GATA位点发生突变时，eNOS基因启动子的活性只是略微下降，但当SPl位点突变时会导致启动子活性急剧下降，提示GATA顺式调控元件只有在SPl位点完整时才能发挥作用。William C. Sessa等利用PCR点突变方法发现SPl和TATA元件决定了 eNOS启动子的基础转录活性，并得到FotulaKarantzoulis-Fegaras等和KatarzynaCieslik等的进一步证实。人血管eNOS基因在心血管内皮细胞中固有表达，在维持血管张力中起着重要作用，其低表达与血管功能障碍相关性疾病密切关联。可是，已知eNOS基因启动子结构本身缺乏核心启动子识别序列，即传统的TATA BOX和起始子，而依赖GC BOX结合SPl转录因子协助转录调控，导致无论其基础活性还是刺激活性都处于低水平，明显增加了探明其功能的难度，也使得其基因治疗难以推进。因此，基于上述发现SPl是维持eNOS基因启动子活性关键的理论，我们探索了在eNOS基因启动子合适位点插入关键调控元件以改造eNOS基因启动子结构从而从源头提高eNOS基因启动子活性的方法。迄今为止，国内外尚未见任何通过改造eNOS基因启动子的结构而增加其活性的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于根据现有的人血管eNOS基因启动子存在的活性较低等问题， 提供一种基础活性和刺激活性均明显提高的人血管eNOS基因启动子改构体。本发明目的通过以下技术方案予以实现
本发明利用PCR插入序列突变技术为人eNOS基因启动子添加一个调控元件SPl的通用识别序列，以此来改造启动子结构，目的在于提高启动子的转录活性；通过氯化钴构建的 HUVEC-12细胞缺氧模型和双荧光报告系统完成启动子改构体的转染和检测，分析启动子及其改构体的转录活性变化，初步验证了改构体的功能(图1)。具体地，本发明包括如下技术方案
一种人血管eNOS基因启动子改构体，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。本发明所述人血管eNOS基因启动子改构体的制备方法包括如下步骤
(1)根据eNOS基因启动子序列设计一对5’端相连方向相反的引物，所述eNOS基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，所述引物序列如SEQ ID N0:3 4所示；
(2)通过PCR进行eNOS基因启动子的插入序列突变，所述PCR的反应体系如下 HIS. Ing/ μ L5 μ L
dNIPs 各 2. 5mmol/L2μ L
引物各 20 μ mol/L1 μ L
10X缓冲液2. 5yL
聚合酶 5U/yL0. 1 μ L
灭菌三蒸水13. 5yL;
所述 PCR 的反应程序为95°C 5min，(94°C 45s, 55°C 45s, 72°C 5min)30 个循环，72°C 10min，4°C 24h ；
经过上述步骤，得到人血管eNOS基因启动子改构体。本发明所述人血管eNOS基因启动子改构体为阐明人血管eNOS基因启动子的功能及其调控机制提供了有用的工具。人血管eNOS基因启动子为一种弱启动子，目前为止，用于研究的刺激因素或方法仅能使eNOS基因启动子的活性轻度升高，因而难以通过观察其活性的变化来说明某种内源或外源因素的影响以及揭示这种影响的内在过程和规律，导致 eNOS基因启动子的功能及其调控机制的研究明显滞后于NOS家族的其它成员。另一方面， 已知在血管功能障碍相关性疾病中，eNOS基因的固有表达通过机体代偿机制而上调，但不足以抵消病理性损害因素的侵袭。外源刺激因素的作用又极其有限，如果能从基因调控的源头根本上提高eNOS基因启动子的活性，必将使血管功能障碍相关性疾病的基因治疗成为可能，因此，本发明通过制备得到人血管eNOS基因启动子改构体，可以用于制备治疗血管功能障碍相关性疾病的药物。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
(1)对人eNOS基因启动子传统的研究方法是通过启动子全长不同区域的序列删除或在顺式调控元件上作点突变，以探明该启动子中固有的哪一部分序列和调控元件在决定该启动子的活性中起关键作用，即目的在于阐明它们的作用或功能。与之相比，本发明利用插入序列突变技术在适宜的位置上为eNOS基因启动子添加关键的调控元件，从决定基因活性的源头上提高eNOS基因启动子的基础转录活性和刺激转录活性，这为研究eNOS基因启动子的转录调控机理和基因治疗的探索提供了一种新的工具或方法。因此，无论是研究思路和策略、技术和方法、目的和意义都完全不同；
(2)结果表明，改造后的启动子转录活性有所提高，其基础转录活性达到了原启动子的 2. 3倍，在转染HUVEC-12细胞的同时添加氯化钴刺激的环境下，改构体转录活性依然保持较原启动子更高的转录活性；而且改构体能导致HUVEC-12细胞释放NO的含量升高。这些结果提示我们利用插入序列突变技术巧妙插入调控元件序列以提高人eNOS基因启动子活性的方法和技术具有明显的应用价值。
图1为本发明人eNOS基因启动子改构体的结构改造流程图2为人eNOS基因启动子(pGL2-eN0S-p)的双酶切电泳鉴定图，其中，M为11Λ DNA marker ；1 为 pGL2_eN0S_p ；2 为酶切后的 pGL2 和 eNOS-ρ ； 图3为点突变实验原理图4为切胶回收电泳鉴定图，其中，M为Ikb DNA marker ；1为pGL2_eN0S-p ；2为切胶回收产物；
图 5 为 pGL2-eN0S-Mut-p 的电泳鉴定图，其中，M为 11Λ DNA marker ； 1 为 pGL2_eN0S_p ；2 为 pGL2-eN0S-Mut-p ；
图6为eNOS基因启动子改构体的转录活性变化(不同浓度氯化钴刺激)，其中，1) vs pGL2-eN0S-p (Control), Ρ<0· 01 ；2) :vs pGL2_eN0S_p (50Mmol/L), P<0. 05 ；3) :vs pGL2-eN0S-p (100Mmol/L), P<0. 05 ；4) :vs pGL2_eN0S_p (200Mmol/L), P<0. 05 ；5) :vs pGL2-eN0S-p (400μπιο1/1)，P<0. 05 ；6) :vs pGL2_eN0S_p (800Mmol/L), P<0. 05 ；7) :vs pGL2-eN0S-p (Control), P<0.01 ；Time :48hr ；n=2 ；
图7为eNOS基因启动子改构体的转录活性变化(不同时间氯化钴刺激)，其中，1) :vs pGL2-eN0S-p (Control),P<0. 01 ；2):vs pGL2_eN0S_p (12hr),P<0. 05 ；3):vs pGL2_eN0S_p (24hr),P<0.05 ；4):vs pGL2-eN0S-p(36hr),P<0. 05 ；5):vs pGL2-eN0S-p(48hr),P<0. 05 ； 6) :vs pGL2-eN0S-p (72hr), P<0. 05 ；CoCl2: 200Mmol/L ；n=2 ；
图8为不同浓度氯化钴刺激对已转染eNOS改构体的HUVEC-12细胞释放NO的影响，其中，1): vs Control, P<0. 01 ；2) vs Control, P<0. 05 ；Time: 48hr ；n=2 ；
图9为不同时间氯化钴刺激对已转染eNOS改构体的HUVEC-12细胞释放NO的影响； 1) vs Control, P<0. 05 ；2) vs Control, P<0.01 ；CoCl2: 200Mmol/L ;n=2。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例1 人eNOS基因启动子改构体的制备人eNOS启动子的双酶切鉴定
用损ο /和幻w /限制性内切酶对pGL2-eN0S-p载体进行双酶切。反应体系为20μ ， 载体pGL2-eN0S_p约500ng，XhoI和KpnI各 μ ，加入灭菌的三蒸水至总体积为20μ ，在 37°C水浴中反应4个小时。取50XTAE母液稀释成IX的TAE工作液，称取0. Ig琼脂糖与 IOmL的IXTAE混合，微波炉加入溶解。待温度降至60°C左右，加入溴化乙锭至终浓度为 lPg/mL，插上梳子，室温下静置30分钟。取酶切产物2PL进行电泳，电压固定在5V/cm，待溴酚蓝在凝胶中移动至中间时停止电泳。胶块小心取出，在紫外灯下观察条带情况，实验结果用凝胶成像仪记录(图2)。定点插入序列突变的引物设计
从GeneBank上找到人eNOS基因启动子的序列(Gene BankTM ,Accession Number :AF387340)(SEQ ID NO: 2)，根据文献报道和试剂盒说明(图3)，选择合适的位点进行突变。 设计一对5、端相连方向相反的引物，分别命名为“变异导入引物”(SEQ ID N0:3)和“对应引物”(SEQ ID N0:4)。设计好的引物通过过DNA Club分析软件测试，并通过上海生物工程有限公司合成。进行启动子的插入序列突变
进行PCR点突变实验，PCR采用TaKaRa公司的MutanBEST Kit (D401)突变试剂盒。 取已经抽提好的pGL2-eN0S-p质粒，其0拟60 0D280的范围控制在1. 80 1. 85之间，稀释成 lng/^L作为PCR反应模板；把引物稀释成20Mfflol/L，分装保存于_20°C备用。按照方法5. 2 所设计的引物进行PCR反应。在0. 5mL的已灭菌Eppendorf管中配制PCR反应体系(25μ 反应体积)
组分体积
模板(Ing/μ L)5yL
dNTPs Mixture (各 2. 5mmol/L)2 μ L
变异导入引物(20 ymol/L)IyL
对应引物(20 ymol/L)IyL
IOXPyrobest Buffer II2. 5 μ L
Pyrobest polymerase (5U/μ L)0. 1 μ L
灭菌三蒸水13. 5yL
充分混勻后置于PCR仪上，按下述程序反应
950C 5min，(94°C 45s, 55°C 45s, 72°C 5min) 30 个循环，72°C 10min，4°C 24h。电泳鉴定、切胶回收目的条带
(1)使用上海申能博采生物公司的胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收纯化PCR产物；
(2)取1μ L回收纯化产物，加入灭菌三蒸水中稀释100倍，用核酸分析仪测定回收产物浓度，同时取3 μ L产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定(图4)。反应
(1)按下列体系配制连接反应体系切胶回收产物
IOXBlunting Kination Buffer Blunting Kination Enzyme Mix dH90
补足至20yL;
约 lpmol 2μ L 1 μ L
(2)37°C反应 IOmin ；
(3)75°C反应 IOmin0反应
(1)从5.5步骤的反应产物中取5μ L (约0. 25pmol)加入于微量离心管中；
(2)加入5μ L 的 Ligation Solution I，均勻混合;
(3)16 °C水浴反应16hr。7.转化大肠杆菌
用氯化钙法制备感受态细胞，用热击法把Ligation反应产物转化感受态细胞。(1)取一支用甘油保存的DH5ci菌种，按照菌液LB体积比为1:1000接种于4mL LB中，恒温振荡培养箱37°C培养Uhr，同时作一支加入Amp的阴性对照管；
(2)用移液管无菌条件下取过夜培养液0.2mL，按菌液LB体积比为1:16接种于新鲜的LB中，菌液置恒温振荡培养箱上37°C培养至0D600 = 0. 5 ；
(3)将菌液按每管0.8mL分装置微量离心管中，冰浴IOmin后在4°C下离心7000rpm下离心aiiin收集细菌；
(4)菌体用0.lmol/L预冷的氯化钙溶液重悬并混勻，冰浴30min ；
(5)将菌液从冰浴中取出，在4°C下离心7000rpm下离心aiiin收集细菌
(6)弃去上清，按照每管0.ImL加入预冷的含15%甘油的氯化钙溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液，放于_70°C保存。(7)把10 μ 的Ligation反应产物加入一支感受态细胞中，小心混勻后冰浴 30min ；
(8)把感受态细胞加入42°C水浴热冲击90s，然后迅速取出插入冰上约Hmin；小心加入ImL的LB培养基，37°C约150 200rpm培养Ihr ；
(9)把菌液取出然后在室温下7000rpm离心lmin，弃ImL的上清，剩下上清用于重悬细菌，将剩余菌液全部涂布于含氨苄青霉素(Amp)的LB平板；
(10)置37°C生化培养箱15min，待菌液吸收完全后，倒置培养16_20hr；
(11)取出培养皿，观察转化情况，倒置保存于4。C冰箱。质粒抽提
使用硅胶柱分离法抽提质粒
(1)取出已长出菌落的氨苄青霉素(Amp)LB平板，挑取单菌落接种于含0. lmg/mL Amp 的LB培养基中，37°C约220l40rpm培养12 14hr ；
(2)取过夜培养的ImL细菌，IOOOOrpm离心lmin，彻底去除上清；
(3)加入200μ 的SolutionI，充分混勻；
(4)加入200μ 的SolutionII，立即缓慢地上下颠倒微量离心管，使菌体裂解，室温放置至溶液变成澄清；
(5)加入300μ 的SolutionIII，立即温和混勻液体，使白色沉淀集中；(6)13000rpm离心lOmin，将上清全部转移到硅胶柱中，尽量避免吸入白鹅沉淀；然后 IOOOOrpm离心lmin，弃去收集管中的废液；
(7)向硅胶柱中加入600μ 的BufferHB, IOOOOrpm离心lmin，弃去收集管中的废液；
(8)向硅胶柱中加入600μ 的WashSolution，IOOOOrpm离心lmin，弃去收集管中的废
液；
(9)重复步骤⑶一次；
(10)12000rpm离心2min，再次弃去废液；将硅胶柱放入已灭菌的微量离心管中，向硅胶柱内的膜中央加入30μ 预热至50°C的无菌三蒸水，IOOOOrpm离心Imin ；
(11)把洗脱下来的溶液放于_20°C保存备用。电泳鉴定
(1)称取0.Ig琼脂糖粉末，加入12 13mL的1 X TAE缓冲液，微波炉中加热至完全溶解， 待温度降至60°C左右时，加入WL的EB溶液(10mg/ml)，充分混勻后倒胶，并插上梳尺，静置30min以上；
(2)取步骤5.8中提取的质粒WL，稀释10倍后用于电泳，上样量为0. 5μ ；
(3)电泳条件为5V/cm，电泳时间在4(T50min；
(4)电泳结束后取出胶块放在凝胶成像分析系统中观察记录(图5)。测序分析
(1)取经电泳鉴定后质粒大小符合要求的样本送测序鉴定；样本送往深圳华大基因公司测序；
(2)测序用样本是含表达待测质粒的ImL菌液，测序要求是从下游开始反向测序一个反应，采用PGL的通用引物；
(3)测序结果与eNOS基因启动子序列在NCBI网站上进行BLAST比对分析；
(4)经测序成功且比对分析后符合后续实验要求的新载体命名为pGL2-eN0S-Mut-p，而此载体上带有的经过突变的启动子成为eNOS基因启动子的变构体。实施例2不同浓度氯化钴对人eNOS基因启动子改构体活性的影响 HUVEC-12细胞系用含体积分数为5%的新生牛血清、lOOmol/L青霉素、100mg/L链霉素
^ Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)培养基，在37°C培养箱内培养，待细胞生长至80% 90%融合时传代。需要实验时，把细胞按8X 104/孔的密度在M孔板内铺板，待细胞生长至50% 60%融合后，弃细胞上清，用PBS缓冲液洗细胞一次，然后加入含不同浓度氯化钴的新鲜 DMEM培养基。把细胞分成Control组、不同浓度氯化钴刺激组和不同时间氯化钴刺激组。 Control组不加入氯化钴刺激；不同浓度氯化钴刺激组分别加入不同浓度氯化钴刺激，令氯化钴终浓度达0、50、100、200、400和800Mmo 1/L ；不同时间氯化钴刺激组均加入相同浓度的氯化钴，令其终浓度达200Mmol/L。细胞转染将细胞分为对照转染组、不同浓度氯化钴刺激转染组和不同时间氯化钴刺激转染组。其中各组转染情况如表1:
表权利要求
1.一种人血管eNOS基因启动子改构体，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所7J\ ο
2.权利要求1所述的人血管eNOS基因启动子改构体的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)根据eNOS基因启动子序列设计一对5’端相连方向相反的引物，所述eNOS基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述引物序列如SEQ ID N0:3 4所示；(2)通过PCR进行eNOS基因启动子的插入序列突变，所述PCR的反应体系如下 HIS. Ing/ μ L5 μ LdNIPs 各 2. 5mmol/L2μ L引物各 20 μ mol/L1 μ LIOX缓冲液2. 5yL聚合酶 5U/yL0. 1 μ L灭菌三蒸水13. 5yL;所述 PCR 的反应程序为95°C 5min，(94°C 45s, 55°C 45s, 72°C 5min)30 个循环，72°C 10min，4°C 24h ；经过上述步骤，得到人血管eNOS基因启动子改构体。
3.权利要求1所述人血管eNOS基因启动子改构体在制备治疗血管功能障碍相关性疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种人血管eNOS基因启动子改构体及其制备方法和应用。本发明所述人血管eNOS基因启动子改构体的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。本发明通过对人血管eNOS基因启动子进行改造，从根本上改变了eNOS基因固有的弱启动子特性，提高了eNOS基因启动子的基础转录活性和刺激转录活性，为阐明其功能和调控机制建立了有用的工具，在基因治疗领域具有潜在的应用前景。
文档编号C12N15/113GK102242120SQ20111007512
公开日2011年11月16日 申请日期2011年3月28日 优先权日2011年3月28日
发明者樊振华, 邢飞跃 申请人:暨南大学