专利名称：麻疯树二酰基甘油转移酶及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植物基因技术，尤其涉及高油脂含量的能源植物及藻种的遗传工程构建技术；具体地说是一种与三酰基甘油酯合成相关的麻疯树二酰基甘油转移酶 (Jcdagat)及其编码基因与应用，属于基因工程技术领域。
背景技术：
能源是国家经济和社会发展的命脉。随着化石能源资源的枯竭，原油价格一路攀升，以及化石能源的燃烧导致大气中(X)2量的净增加以致环境与气候的恶化，世界各国不得不考虑加快石油替代原料的研究与开发步伐，其中生物柴油被视为一种可再生的取代能源越来越受到重视。油脂是生物柴油的原料，愈来愈成为我们的重要资源。通过基因工程手段，来优化油脂合成代谢，获取我们所需要的高油脂含量植物是较理想的目标，这导致了在各种各样的生物体里克隆和鉴定相关的脂质代谢基因，以筛选有价值的基因资源，而DAGAT是直接导致具有重要利用价值的三酰基甘油酯(TAG)形成的最关键的基因。在植物体中，三酰基甘油(triacylglycerol，TAG)的生物合成主要发生在发育中的种子、存油小体、质体、果实、花瓣、花粉粒的内质网中。二酰基甘油转移酶(DAGAT)是催化依赖acyl-CoA的sn-1，2-diacylglycerol进一步酰化形成TAG，它位于磷脂和储存脂质的生物合成的分支点上，在sn-glycerol-3-磷酸途径(Kennedy pathway)中，这是唯一一个导致TAG的生物合成的酶。更进一步说，DAGAT的活性大小也影响到植物体的碳流进入种子TAGs的效率。有报道显示，正在成熟的种子中，是TAG合成非常活跃的阶段，DAGAT的酶活性达到了最高。换句话说，DAGAT的酶活性大小反映了植物体中贮存TAG的多少。DAGAT 被认为是一个定位于内质网上的膜结合性质的酶，因而要进行该酶在生物体外合成TAG同样是件不容易的事情。目前，在这些生物体如 mouse (Mus musculus)、Arabidopsis thaliana、 tobacco (Nicotiana tabacum)中鉴定到了几个编码DAGAT的cDNA，但用于实际生产，获得转基因植株应用的报道很鲜见，尤其在利用DAGAT培育高油脂含量的藻类基因工程育种中还没有相关报道。此外不同来源的DAGAT的酶活性和特异性也会有差异，因此，克隆和鉴定形成储存脂质TAG基因，对指导油脂生产植物，包括藻类的选育及品种基因工程改良具有重要意义。微藻(microalgae)能用海水培养，能耐受沙漠、干旱地、半干旱地等极端环境，不占用耕地，因此不会对粮食作物的生产构成威胁；微藻能吸收并利用工农业生产中排放出的大量CO2和氮化物，或从废水中取得氮、磷等，有利于改善环境。微藻(microalgae)因易于培养、具有单位面积产量大等优点，被视为新一代的、甚至是唯一能实现完全替代石化柴油的生物柴油原料。但目前能用于生物能源的天然微藻因其油脂生产能力限制而不能实现商业化应用。如何应用有关优质基因资源改造产油藻类，获得高油脂含量的能源微藻藻种是一个重要的研究方向。
麻疯树(Jatropha curcas)是我国一种重要的含油灌木植物资源。本课题组已进行的研究显示，其种子理论含油量达62%。如果通过基因工程手段，鉴定其二酰基甘油转移酶，对其油脂合成效率进一步改造，则可以使其品质更趋优良；或者把该基因资源用于构建高油脂含量的转基因微藻，将具有重要的应用价值。因此，发明疯树DAGAT基因的应用技术具有重要的理论价值和应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一个能显著提高转基因细胞或植株的油脂含量的麻疯树二酰基甘油转移酶(Jcdagat)；及该二酰基甘油转移酶的编码基因与应用。本发明提供的二酰基甘油转移酶，名称为Jcdagat，来源于大戟科的麻疯树 (Jatropha curcas)，其氨基酸残基序列如SEQ ID No 2所示；或与氨基酸残基序列SEQID No :2具有95%的同源性且与其具有相同活性的并由SEQ ID No :2衍生的蛋白质；或将SEQ ID No :2的氨基酸残基序列经过一个或多个氨基酸取代、缺失或添加具有与SEQ IDNo :2相同功能的由SEQ ID No :2衍生的蛋白质。序列表中SEQ ID No 2的氨基酸残基序列是由521个氨基酸残基组成的蛋白质。编码本发明的麻疯树二酰基甘油转移酶的基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的 SEQ ID No 1 ；2)编码与序列表中SEQ ID No 2蛋白质序列的核苷酸序列；3)与序列表SEQ ID No 1限定的核苷酸序列具有90%以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。序列表中SEQ ID No 1的DNA序列是由1566个碱基组成，其读码框为自5，端的第一个碱基到第1566位碱基。本发明的另一目的是提供一种提高植物或藻类油脂含量的方法。本发明所提供的方法，是将本发明的麻疯树二酰基甘油转移酶编码基因，应用分子生物学手段，将其连接到能启动该基因转录的藻类或植物启动子下游，而构建相应的表达载体，然后应用基因枪或根瘤农杆菌介导或其他化学转化法等，将表达载体导入藻类细胞或植物细胞内后，使本发明所述基因能在转基因个体中成功表达，获得油脂成份和含量改良的转基因藻类细胞或转基因植物组织和植株。因此本发明对能源微藻育种或油料植物改良具有重要理论意义和应用价值。本发明通过基因工程手段，鉴定了其二酰基甘油转移酶，对其油脂合成效率进一步改造，则使其品质更趋优良；本发明把该基因资源用于构建高油脂含量的转基因微藻。结果显示，含Jcdagat编码基因过量表达结构的转基因藻的基因表达水平显著高于野生型三角褐指藻，进一步抽提油脂含量分析，Jcdagat基因的导入使转基因三角褐指藻油脂含量达到了 35-40%，大大高于野生型三角褐指藻25%的油脂含量。因此本发明用于提高藻类等油脂生产植物的油脂含量，促进生物能源的发展具有实际应用前景。
图1为JcDAGAT酶基因在麻疯树各种组织细胞中的的瞬时表达情况；图2为Jcdagat转基因酵母湿重时的总油脂含量比较；
图3为导入了 Jcdagat基因的转基因三角褐指藻油脂含量比较。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例一麻疯树Ptdagat基因的分子克隆1)麻疯树DAGAT酶基因cDNA中间片段的克隆通过比对4个已知的高等植物的Δ 12脂肪酸脱饱和酶的氨基酸序列(Perilla frutescens, AF298815 ；Glycine max, AY652765 ；Ricinus communis,AY366496 ；Arabidopsis thaliana，NP_179535)，确定保守区域II和区域III，即对应的氨基酸序列分别为LKLVSYAHTNYD和YWRMWNMPVHKWM的位置分别为上游和下游兼并性引物设计区，分别设计兼并性引物JCdagatl，5’-CHTAYG CffC ATA CffA RCT ATG A-3，和 Jcdagat2，5，-CAY TTR TGV ACA GGC ATA TTC CA-3，；麻疯树叶片总 RNA 的提取和纯化都用植物RNA提取试剂盒(华舜公司，上海)，经过除去DNA污染RNA放_80°C 贮存备用；以纯化的总RNA为模板，以Olig (dT) 20为引物，用Reverse Transcriptase XL (AMV) (TaKaRa Bio, Dalian, China)合成第一链 cDNA。RT-PCR 以合成的第一链 cDNA 为模板，以Jcdagatl和Jcdagat2为引物，用rTaq DNA聚合酶做RT-PCR。其参数为95°C 5min， 然后紧跟着；35个循环95°C 30s, 50°C 30s, 72°C 2min，最后在72°C下保持IOmin结束PCR。 所得片段用胶回收试剂盒纯化，亚克隆进PMD18-T，转化TOPO 10E. coli细胞，经菌落PCR确认验证后送公司测序，确认其正确性。2)麻疯树DAGAT酶基因的3，RACE 合成一条为3，RACE的特殊引物RTP，5、-GCTGTC AAC GAT ACG CTA CGT AAC GGC ATGACAGTG (T) 18-3，。以 RTP 做引物，以所纯化的总 RNA 为模板，用 Reverse Transcriptase XL(AMV) (TaKaRa Bio,Dalian,China)合成第一链 cDNA。 用已经克隆的麻疯树18s rRNA基因(AY823528)专一性引物Jcl8sl，5，_GCT CGT AGT TGG ACC TTG GGT T-3，和 Jcl8s2，5，-GTC TGT CAA TCC TTA CTA TGT-3，做 PCR 确认 cDNA 的质量；3，RACE RT-PCR:分别用两个套合的PCR完成，即第一个PCR和Nested-PCR，第一个 PCR反应用各基因的专一性引物见表1 ；以合成好的cDNA为模板，其PCR参数为95°C 5min, 然后紧跟着；35个循环95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 2min，最后在72°C下保持IOmin结束PCR。 Nested-PCR分别用第一个PCR产物的3个1/10梯度稀释做模板，用各基因的专一性引物和 3'RACE的Nested引物3RNP做PCR，其参数同上。各PCR所得片段用胶回收试剂盒纯化，亚克隆进pMDIS-T，转化TOPO 10E. coli细胞，经菌落PCR确认验证后送公司测序。所得序列用序列组装软件CExpress进行组装，组装完成后用Clustal X 1. 83跟已知序列进行比对分析，确认其正确性。表1 麻疯树DAGAT酶基因3’ RACE的相关引物表。基因名称引物代号序列
DAGAT3RJcdagat5，-CCT ATT GTC CAG AAT TCA CAA CA-3'3RJcdagatN5，-GGG ATC TAT TAT ATG CCA TTG AA~3'3，RACE反转录引物RTP5: ACAGCT GTC AAC GAT ACG CTA CGT AAC GGC ATG GTG (T)18 -3，3，RACE引物3RP5，-GTC AAC GAT ACG CTA CGT AAC G-3'
3，RACE Nested 引物3RNP 5’ -TAC GTA ACG GCA TGA CAG TG-3，3)麻疯树DAGAT酶基因的5’ RACE 封闭5’已经降解了的暴露出了 5’磷酸基团的 mRNA ；用专一性的脱帽酶切掉完整的mRNA的5’茑苷帽，暴露出5’磷酸基团，使之能参加下一步反应；连接一段已知序列的RNA oligo到被脱帽的mRNA上。具体方法合成一段自己设计的 RNA oligo，5:GAG CAC GAG GAC ACU GAC AUG GAC UGA AGG AGU AGAAA_3(上海生工)，用T4RNA Iigase (上海生工)进行连接反应。经处理的mRNA的反转录。用Oligo (dT) 2(1 做反转录的引物，用 Reverse Transcriptase XL (AMV) (TaKaRa Bio，Dalian，China)合成第一链cDNA。RT-PCR，用各基因的专一性引物(GSP1，GSP2)(见下表)和根据oligo RNA设计的 5，RACE 引物(5RP，5RNP)做第一个 PCR 和 Nested-PCR。其 PCR 参数同 3，RACE，各 PCR 所得片段用胶回收试剂盒纯化，亚克隆进PMD18-T，转化TOPO 10 E. coli细胞，经菌落PCR 确认验证后送上海申能博彩生物技术有限公司测序。所得序列用序列组装软件CExpress 进行组装，组装完成后用Clustal X 1.83跟已知序列进行比对分析，确认其正确性。表2 麻疯树DAGAT酶基因5’ RACE的相关引物表
基因名称名称序列麻疯树DAGAT酶5RJcdagat5，--GCT AAC ATC ACG TGA AGA ATC TG-3'5RJcdagatN5，-CAC CGA TGG CCG GTA CGT GA-3'OligoRNA5， AGG-GAG CAC GAG GAC ACU GAC AUG GAC UGA AGU AGA AA-3'5’ RACE引物5RP5，--GAG CAC GAG GAC ACT GAC ATG-3'5，RACE Nested 引物5RNP5，--CAC TGA CAT GGA CTG AAG GAG TA-3’ 至此麻疯树二酰基甘油转移酶编码基因全长cDNA序列被获得，见序列表中序列1。实施例二JcDAGAT酶基因在麻疯树各种组织细胞中的的瞬时表达情况实验材料及取材时期见表3 表3 麻疯树二酰基甘油转移酶基因瞬时表达分析材料列表
权利要求
1.麻疯树的二酰基甘油转移酶，其氨基酸残基如序列表中SEQID No:2所示。
2.编码权利要求1所述二酰基甘油转移酶的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因的碱基序列如序列表中SEQ IDNo 1 所示。
4.含有权利要求2所述基因的表达载体。
5.含有权利要求2所述基因的转基因细胞系。
6.一种提高植物或藻类油脂含量的方法，是将权利要求2所述的编码二酰基甘油转移酶的基因导入藻类或植物组织或细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述植物为藻类植物，或单子叶植物，或双子叶植物。
全文摘要
本发明公开了一个麻疯树二酰基甘油转移酶(Jcdagat)及其编码基因与应用，属于基因工程技术领域。该麻疯树二酰基甘油转移酶其氨基酸残基序列如SEQ ID No2所示；或与氨基酸残基序列SEQ ID No2具有95％的同源性且与其具有相同活性的并由SEQ IDNo2衍生的蛋白质；或将SEQ ID No2经过一个或多个氨基酸取代、缺失或添加具有与SEQ ID No2相同功能的并由SEQ ID No2衍生的蛋白质。编码二酰基甘油转移酶的基因。实验证明，本发明的转基因可显著提高植物或藻类油脂含量，从而为植物或藻类的油脂含量改善提供了一个优质基因，具有广阔的应用前景和重要的应用价值。
文档编号C12N15/63GK102199579SQ20111007564
公开日2011年9月28日 申请日期2011年3月28日 优先权日2011年3月28日
发明者卿人韦, 徐莺, 李湘, 郭亮, 陈放 申请人:四川大学