专利名称：一种驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1的方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种驱除炭疽杆菌毒力大质粒PXOl的方法。
背景技术：
炭疽杆菌是一种杆状、能形成芽胞的革兰氏阳性杆菌，能够引起人畜的炭疽病，如果不及时治疗，死亡率极高。炭疽杆菌含有两个致病相关的毒力大质粒pX01(181. 6kb)和pX02(96. 2kb)。质粒pXOl编码保护性抗原、致死因子和水肿因子等炭疽毒素蛋白及他们的调控基因。质粒PX02编码参与荚膜形成和降解的基因。这两个质粒对于炭疽杆菌的致病性至关重要，丢失任何一个质粒都会导致炭疽菌的毒力极大的减低。因此对于炭疽杆菌毒力大质粒的研究一直是研究的热点。构建驱除毒力质粒的突变菌株对于研究质粒在炭疽杆菌致病中的作用及染色体的相关调控非常重要。驱除细菌的大质粒可以使用驱除化学试剂，比如吖啶橙、新霉素、溴化乙啶等。高 温培养或紫外照射等方法。但是这些方法都有潜在的问题，第一是特异性差，即在驱除目的质粒的过程中可能驱除目的质粒以外的其他质粒，第二是可能在处理过程中宿主细胞产生随机突变的可能性。质粒不相容是两个不同的但是相关的质粒不能稳定地在同一个细胞中遗传。这些质粒被放在一个相同的不相容群。这种不相容性主要是由于互相竞争相同的复制位点或分离位点，或者是由于复制起始的抑制。使用这个原理可以模拟自然机制使用一个小的、高拷贝的质粒来去除毒力大质粒。这种方法驱除质粒可以特异的构建质粒缺失菌株而避免了诱导突变的危险。在一些细菌中已经应用质粒不相容原理成功的驱除了目的质粒，证明这是一种高效、安全的方法。但是由于对炭疽杆菌大质粒PXOl的复制相关序列还不是很清楚，因而该方法还未用来驱除炭疽杆菌的大质粒pXOl。早在1881年，Pasteur首先采用高温培养减毒方法，获得两株具有荚膜的弱毒菌株(pX01_pX02+)，用以制备巴氏I苗和II苗。主要用于欧洲和其它国家的畜群免疫；2006年展德文等采用42°C高温培养法，驱除了炭疽杆菌人用减毒疫苗株A16R(pX01+pX02_)中的大质粒pXOl，获得一株无质粒的炭疽菌A16RP(pX0rpX02-) ;2007年韩国的Sung-Ha Park等人，采用42°C高温培养法从炭疽杆菌H9401 (pX01+pX02+)株中驱除了大质粒pXOl，获得了一株衍生菌H9401(pX0rpX02+)。这些驱除pXOl的方法中，pXOl的丢失是随机的，必须经过大量的筛选过程，有时甚至得不到所需要的菌株，另外，在筛选的过程中可能导致宿主菌染色体的随机突变。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种重组载体。本发明提供的重组载体，为将DNA分子插入穿梭质粒的SmaI位点得到的载体；所述DNA分子的核苷酸序列为序列表中的序列I。所述穿梭质粒为温敏型穿梭质粒，
所述温敏型穿梭质粒具体为pKSV7。所述重组载体在驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXOl中的应用也是本发明保护的范围。本发明的另一个目的是提供一种驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXOl的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤将所述的重组载体转入出发菌，得到重组菌；将所述重组菌传代培养，至所述重组菌中的炭疽杆菌毒力大质粒pXOl被驱除，得到驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXOl的重组菌。所述驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXOl方法中，在将所述的重组载体转入出发菌前，还包括将所述重组载体去甲基化的步骤，
所述去甲基化的方法包括如下步骤I)、将所述重组载体转入甲基化酶缺陷的大肠杆菌中，得到重组菌I ;2)、提取步骤I)得到的所述重组菌I的质粒，得到去甲基化的重组载体；所述驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXOl方法中，还包括将所述驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXOl的重组菌去除所述重组载体的步骤，所述将驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXOl的重组菌去除所述重组载体的方法包括如下步骤将所述驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXOl的重组菌分别接种在无所述重组载体抗性筛选标记物培养基和含所述重组载体抗性筛选标记物的培养基中培养，选取在无所述重组载体抗性筛选标记物培养基生长且在含所述重组载体抗性筛选标记物的培养基上不生长的菌，得到驱除炭疽杆菌毒力大质粒PXOl和所述重组载体的重组菌。所述出发菌为炭疽杆菌(Bacillus anthracis)；所述甲基化酶缺陷的大肠杆菌为大肠杆菌SCSllO ；所述抗性筛选标记物为氯霉素。所述传代培养的温度为不高于30°C，所述传代培养的温度具体为30°C ；所述将驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXOl的重组菌去除所述重组载体的方法中，所述培养温度为37°C -42°C，所述培养温度具体为37°C。所述方法制备的驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXOl的重组菌和/或驱除炭疽杆菌毒力大质粒PXOl和所述重组载体的重组菌也是本发明保护的范围。所述重组载体、所述的重组菌在制备疫苗中的应用也是本发明保护的范围；所述疫苗具体为炭疽疫苗。本发明的第三个目的是提供一种炭疽疫苗。本发明提供的炭疽疫苗，其活性成分为所述的重组菌。本发明的实验证明，本发明根据质粒不相容原理构建一个不相容质粒，特异地从炭疽杆菌A16R(pX01+pX02_)中驱除了毒力大质粒pXOl，然后在37°C培养，驱除导入的外源质粒，从而获得了一株驱除PXOl的菌株A16R0。该方法具有简单、快速、特异性好、安全性高的特点。该方法对于构建炭疽杆菌的质粒缺失株，从而研究大质粒PXOl与染色体的相互作用具有极其重要的意义，对于构建新的疫苗株提供了新的实验手段，为炭疽杆菌的防治提供了新的思路。
图I为外源重组质粒pKS5K的酶切鉴定2为驱除pXOl的初步筛选图3为驱除pXOl的PCR方法鉴定图4为Western Blotting方法检测PA蛋白图5为外源重组质粒pKS5K从A16R中驱除鉴定
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、驱除pXOl的重组菌的获得及鉴定I、驱除质粒构建I. I温敏型质粒线性化将温度敏感型穿梭质粒pKSV7(6.9Kb)用限制性内切酶SmaI酶切线性化，之后
0.6%琼脂糖凝胶电泳分离，从凝胶上切下目标条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收线性化载体pKSV7片段，操作步骤按照说明书进行。骨架质粒pKSV7质粒(其上既没有转座子也没有插入序列)Smith K, YoungmanP. Use of a new integrational vector to investigate compartment-specificexpression of the Bacillus subtilis spoIIM gene[J] Biochimie，1992，74 :705-711.，公众可从中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所获得。1.2.驱除片段的PCR获得以炭疽杆菌(Bacillus anthracis) A16R(购自兰州生物制品研究所)基因组为模板，使用引物对5K_F和5K_R (表1)，进行PCR扩增。PCR的体系为IOOul (I y L PyrobestDNA polymerase, 10 u L 10 X polymerase buffer, 8 u L dNTP mixture, 2 u L模板DNA, 2 u Lprimer 5K_F, 2 u L primer 5K_R,用去离子水补足IOOuL体系)；PCR的条件为先94°C变性5min，接着进行30个循环反应94°C变性40s，56°C退火40s，72°C延伸6min，最后在结束前在在72°C延伸5min。之后用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒(博迈德公司)回收PCR片段，操作按照说明书进行。I. 3驱除片段与线性化载体连接、转化、培养、鉴定使用CloneEZ连接试剂盒(南京金斯瑞公司)进行I. I得到的线性化载体pKSV7与I. 2得到的PCR片段的连接反应。方法按照试剂盒说明书进行。连接体系热激转化化学感受态细胞DH5a，之后在ImL不含抗生素的LB培养基中在200rpm摇床上30°C培养3小时；在含氨苄青霉素(100ug/mL)的LB琼脂板上涂布，在30°C孵箱中培养12小时。挑取单克隆进行菌落PCR，引物为5K_F和5K_R，得到4848bp的为阳性克隆，提取阳性克隆的质粒，用SmaI酶切，结果如图I所示，I和2分别为质粒酶切前和酶切后的图，M为DNA标准，得到约6900bp和4848bp的片段为阳性质粒，将该阳性质粒送去测序，该阳性质粒含有序列表中序列I所示的核苷酸，通过比对，即为炭疽杆菌质粒pXOl (GenBank accession no. AF065404)上的一段序列，范围包括第19072到23919位，长度为4848bp，该阳性质粒为将序列表中的序列I插入PKSV7的SmaI酶切位点间得到的载体，将该质粒命名为pKS5K。
2.驱除炭疽炭疽A16R中的pXOl质粒A、转化将I得到的质粒PKS5K先电转入大肠杆菌SCSllO (购自TransGen公司，电转感受态制备参照Shatalin KY, Neyfakh AA(2005)Efficient gene inactivation inBacillus anthracis. FEMS Microbiol Lett 245:315-319;)去甲基化后(将电转化的菌株再次提取质粒后，电转入A16R，因为非去甲基化的质粒进入炭疽后，将会被降解，影响质粒的转化)，再将其电转入炭疽杆菌A16R感受态细胞中(制备参照Shatalin KY,NeyfakhAA(2005)Efficient gene inactivation in Bacillus anthracis. FEMS Microbiol Lett245 :315-319),电转化炭疽杆菌时的电击条件是电压，0.6kv ;电阻，500 Q ;电容，25yF ;所用电击仪为产自美国的Bio-RAD GenePulser II electroporator ;电击杯规格为
0.1cm。B、筛选过程电转完毕后加ImL不含抗生素的LB培养基，在200rpm摇床上30°C培养3小时；在含氯霉素(5y g/mL)的LB琼脂平板上涂布(炭疽芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，在 革兰氏阳性菌中使用氯霉素进行筛选)，在30°C培养箱中培养12小时。然后对平板上长出的单克隆进行PCR鉴定，鉴定引物采用pKSV7-F/pKSV7-R(表I)，得到约4900bp (AF065404第19072到23919位)的片段为阳性克隆，提取阳性克隆的质粒送去测序，结果为该质粒为PKS5K，将含有该质粒的克隆命名为pKS5K/A16R。C.鉴定结果I)菌落PCR初步筛选将pKS5K/A16R接入含氯霉素(5 u g/mL)的Luria-Bertani (LB)液体培养基中，在30°C摇床上225rpm培养12小时，吸取50uL培养液转接到5mL新鲜的LB肉汤中(含氯霉素5 ii g/mL)，在30°C摇床上225rpm培养12小时，如此转接和培养5次，吸取部分菌液适当稀释后，涂LB平板(含氯霉素5 u g/mL)。挑取单克隆进行菌落PCR，对质粒pXOl上的特异的几个基因(pagA, lef,cya和atxA)进行PCR检测，以A16R作为阴性对照，以菌落为模板，pagA的特异引物pag_F、pag_R, Ief的特异引物lef_F、lef_R, cya的特异引物cya_F、cya_R，atxA的特异引物atxA_F、atxA_R分别作为引物(引物的序列见表I)，结果如图2所示，2为pKS5K/A16R，I为A16R，从图中可以看出，A16R菌均含有质粒pXOl上的特异的几个基因(pagA (pag, 1627bp), Ief (2086bp), cya (1354bp)和 atxA (1202bp),而 pKS5K/A16R 菌株单菌落却没有阳性扩增条带，表明PXOl质粒可能已经丢失。菌落鉴定没有扩增条带的菌株为阳性pKS5K/A16R。传代5次，即可筛选出阳性菌株，传代10次，筛选率可达到91 %。2)使用另外16对引物进一步确定的结果为了进一步确认pXOl的丢失情况，提取初步筛选为阳性PKS5K/A16R的基因组DNA JfpXOl质粒上的16个特异基因(16个特异基因比较均匀的分布在整个pXOl质粒上)进行检测，pX01_07的特异引物为pX01_07F和pX01_07R、pX01_13的特异引物为pX01_13F 和 pX01_13R、pX01_16 的特异引物为 pX01_16F 和 pX01_16R、pX01_23 的特异引物为 pX01_23F 和 pX01_23R、pX01_32 的特异引物为 pX01_32F 和 pX01_32R、pX01_42 的特异引物为 pX01_42F 和 pX01_42R、pX01_51 的特异引物为 pX01_51F 和 pX01_51R、pX01_59 的特异引物为 pX01_59F 和 pX01_59R、pX01_67 的特异引物为 pX01_67F 和 pX01_67R、pX01_70 的特异引物为 pX01_70F 和 pX01_70R、pX01_90 的特异引物为 pX01_90F 和 pX01_90R、pX01_95 的特异引物为 pX01_95F 和 pX01_95R、pX01_98 的特异引物 pX01_98F 和 pX01_98R、pX01_116的特异引物 pX01_116F 和 pX01_116R、pX01_133 的特异引物 pX01_133F 和 pX01_133R、pX01_142的特异引物pX01_142F和pX01_142R，引物具体序列如下表I中所示，以A16R为对照；结果如图3A-3C所示，I为A16R，2为pKS5K/A16R，以A16R基因组DNA为模板时，16对特异引物都能扩增出特异条带，具体如下pX01_07(1104bp，AF065404第8352到6544) ;pX01_13(787bp，AF065404 第 19002 到 15040) ;pX01_16 (742bp，AF065404 第 22188 到23897) ;pX01_23(1286bp，AF065404 第 33006 到 31621) ;pX01_32 (733bp，AF065404 第 40152到 39169) ；pX01_42(890bp, AF065404 第 53370 到 52012) ；pX01_51 (718bp, AF065404 第65012 到 66490) ；pX01_59 (783bp，AF065404 第 74068 到 75501) ；pX01_67 (1072bp, AF065404第 79684 到 81432) ；pX01_70 (757bp, AF065404 第 84298 到 85611) ；pX01_90 (1250bp,AF065404 第 106772 到 108730) ；pX01_95(1076bp, AF065404 第 113430 到 114761)；pX01_98(767bp, AF065404 第 118950 到 117718) ；pX01_116 (799bp, AF065404 第 143333 到146110) ;pX01_133(981bp，AF065404 第 170713 到 169256) ;pX01_142 (1012bp，AF065404 第179399到176736)(这里的位置是阅读框全长的位置，标示的长度为实际扩增的阅读框中的一部分序列，引物的位置见引物列表)，而当以PKS5K/A16R的基因组DNA为模板时，16对特异引物都没有扩增出特异条带，这进一步确定了 PXOl确实从炭疽杆菌A16R中丢失了。3)表型鉴定因为pXOl上有编码保护性抗原(PA)的基因，驱除了 pXOl后的菌株一定不能产生PA,所以通过Western Blotting来检测PA的表达情况来进一步确认pXOl的丢失情况。pKS5K/A16R在含0. 9%碳酸氢钠的LB琼脂平板上划线，在37°C，15% CO2条件下培养12h，从平板上刮去菌苔制成菌悬液，加上样缓冲液(配方参见科学出版社《分子克隆实验指南》第二版)沸水浴煮lOmin，离心，取上清，SDS-PAGE上样，电泳结束后将蛋白转印至PVDF膜上，做WB检测。一抗为PA抗体，二抗为IgG-HRP。医用胶片，显影液，定影液购自柯达公司。以A16R为对照(样品制备方法同上所述)。抗体购自Santa Cruz公司，一抗PA抗体货号sc-52123，二抗羊抗小鼠IgG-HRP sc-2031。结果如图4所示，从图中看出，显示A16R的菌体蛋白能够与PA抗体产生特异的Western杂交带,而pKS5K/A16R的菌体蛋白与PA抗体没有特异的Western杂交带,这再次说明PXOl已经从A16R中驱除。3、把不相容质粒pKS5K从炭疽杆菌A16R中驱除的过程筛选因为构建的外源质粒的骨架质粒pKSV7为温敏性质粒，在37°C _42°C下丢失，而37°C为炭疽杆菌的最佳生长温度，为了避免炭疽菌在过高的温度生长传代，所以选择在37°C丢外源重组质粒。挑取去掉pXOl质粒的pKS5K/A16R接5mL无抗性LB液体培养基在37°C的摇床上培养12h，然后按I %转接到另一 5mL无抗性LB液体培养中于37°C摇床上培养12h，反复按I %转接多次后，对菌液进行梯度稀释，取10-4、10-5两个稀释度的菌液，涂布无抗平板。次日，挑取平板上的单克隆进行点板，每一个单克隆分别点板于LB无抗板和含氯霉素(Cm浓度为5 ii g/mL)的LB琼脂平板，将点板后的平板置30°C培养箱中培养。次日，挑取在无抗性平板上生长而在Cm抗性琼脂平板上不生长的单克隆进行菌落PCR鉴定(pKSV7P3_F 和 pKSV7P3_R，pKSV7P6_F 和 pKSV7P6_R)和 Cm 抗性试管(5 u g/mL)转接培养、(30°C，225rpm摇床培养)，确定其在Cm抗性试管中不长，由此选出阳性克隆，记作pKS5K/A16R(-pKSV7)。对选出的阳性克隆pKS5K/A16R(_pKSV7)进行接种于无抗性试管培养，然后提取它的基因组，以基因组做模板，以PKSV7P3的特异引物为pKSV7P3_F和pKSV7P3_R、pKSV7P6的特异引物为口1 ￥7 6_ 和pKSV7P6_R(pKSV7P3和pKSV7P6为pKSV7载体的特异片段)，进行PCR鉴定，以pKS5K/A16R为对照，结果如图5所示，其中，I为p KS5K/A16R，2为阳性克隆pKS5K/A16R(-pKSV7)，可以看出，2阳性克隆中均未有片段扩增，I分别得到843bp pKSV7P3和535bp pKSV7P6的片段。将PCR鉴定无片段的阳性克隆命名为A16R0。该菌株A16R0为PXOl质粒的缺失同时又不含外源质粒的突变株。表I :实验中使用的引物
权利要求
1.一种重组载体，为将DNA分子插入穿梭质粒的多克隆位点得到的载体； 所述DNA分子的核苷酸序列为序列表中的序列I。
2.根据权利要求I所述的重组载体，其特征在于 所述穿梭质粒为温敏型穿梭质粒， 所述温敏型穿梭质粒具体为PKSV7。
3.权利要求I或2所述重组载体在驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXOl中的应用。
4.一种驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXOl的方法，包括如下步骤 将权利要求I或2所述的重组载体转入出发菌，得到重组菌；将所述重组菌传代培养， 至所述重组菌中的炭疽杆菌毒力大质粒PXOl被驱除，得到驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXOl的重组菌。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于 所述驱除炭疽杆菌毒力大质粒PXOl方法中，在所述将权利要求I或2所述的重组载体转入出发菌前，还包括将权利要求I或2所述重组载体去甲基化的步骤， 所述去甲基化的方法包括如下步骤 1)、将权利要求I或2所述重组载体转入甲基化酶缺陷的大肠杆菌中，得到重组菌I; 2)、提取步骤I)得到的所述重组菌I的质粒，得到去甲基化的重组载体； 所述驱除炭疽杆菌毒力大质粒PXOl方法中，还包括将所述驱除炭疽杆菌毒力大质粒PXOl的重组菌去除权利要求I或2所述重组载体的步骤， 所述将驱除炭疽杆菌毒力大质粒PXOl的重组菌去除权利要求I或2所述重组载体的方法包括如下步骤 将所述驱除炭疽杆菌毒力大质粒PXOl的重组菌分别接种在无所述重组载体抗性筛选标记物培养基和含所述重组载体抗性筛选标记物的培养基中培养，选取在无所述重组载体抗性筛选标记物培养基生长且在含所述重组载体抗性筛选标记物的培养基上不生长的菌，得到驱除炭疽杆菌毒力大质粒PXOl和所述重组载体的重组菌。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于 所述出发菌为炭疽杆菌(Bacillus anthracis)； 所述甲基化酶缺陷的大肠杆菌为大肠杆菌SCSllO ； 所述抗性筛选标记物为氯霉素。
7.根据权利要求4-6中任一所述的方法,其特征在于 所述传代培养的温度为不高于30°C，所述传代培养的温度具体为30°C ； 所述将驱除炭疽杆菌毒力大质粒PXOl的重组菌去除权利要求I或2所述重组载体的方法中，所述培养温度为37°C -42°C，所述培养温度具体为37°C。
8.由权利要求4-7中任一所述方法制备的驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXOl的重组菌和/或驱除炭疽杆菌毒力大质粒PXOl和所述重组载体的重组菌。
9.权利要求I或2所述重组载体、权利要求8所述的重组菌在制备疫苗中的应用；所述疫苗具体为炭疽疫苗。
10.一种炭疽疫苗，其活性成分为权利要求8所述的重组菌。
全文摘要
本发明公开了一种驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1的方法。本发明提供了的重组载体，为将DNA分子插入穿梭质粒pKSV7的SmaI位点得到的载体；所述DNA分子的核苷酸序列为序列表中的序列1。本发明的实验证明，本发明根据质粒不相容原理构建一个不相容质粒，特异地从炭疽杆菌A16R(pXO1+pXO2-)中驱除了毒力大质粒pXO1，然后在37℃培养，驱除导入的外源质粒，从而获得了一株驱除pXO1的菌株A16RO。该方法具有简单、快速、特异性好、安全性高的特点。该方法对于构建炭疽杆菌的质粒缺失株，从而研究大质粒pXO1与染色体的相互作用具有极其重要的意义，对于构建新的疫苗株提供了新的实验手段，为炭疽杆菌的防治提供了新的思路。
文档编号C12N1/21GK102732544SQ201110087128
公开日2012年10月17日 申请日期2011年4月7日 优先权日2011年4月7日
发明者冯尔玲, 刘先凯, 王东澍, 王华贵, 王恒樑 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所