专利名称：一种提高虫草菌素产量的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体来说涉及一种提高虫草菌素产量的方法。
背景技术：
两相培养，也称双相培养，两相发酵，双相发酵，细胞培养_分离耦合过程。利用在植物细胞或是微生物培养中加入水溶性或脂溶性的有机物，或者是具有吸附作用的多聚化合物，使培养体系由于分配系数的不同而形成上下两相，细胞在其中一相中生长并合成次生代谢物，而这些产物又通过主动或被动运输方式释放到细胞外，并被另一相所吸附。两相培养大大减轻了产物本身对细胞代谢的抑制作用，提高代谢产物产率，保护了产物免受培养基中催化酶或酸对产物的影响。液-液两相培养作为提高次级代谢产物的一种工艺在植物培养方面已经成熟，一方面可以提高次级代谢产物的含量，另一方面也简化了下游分离纯化过程。但液_液两相培养在现代微生物方面的应用研究甚少，用于提高虫草菌素含量方面更是空白。虫草菌素
办⑶是一类从蛹虫草中分离出来的核苷类抗菌物，具有多种生物活性，但虫草菌素为次级代谢产物，产量不高，使其应用受到了限制。
发明内容
本发明的目的在于克服上述缺点而提供的一种提高虫草菌素含量明显，培养基质容易获得，发酵条件稳定、简单的提高虫草菌素含量的方法。一种提高虫草菌素含量的方法，包括蛹草拟青霉iPaecilomyces mill taris ) 08-01接在PDA斜面培养基上，260C，培养5d，活化3次，再接入到PDA液体种子培养基中， 140rpm，26°C，摇瓶培养3d，得液体母种，以4% (ν/ν)接种量接入到PDA发酵培养基中，同时添加有机溶剂油酸6-8% (v/v), 140rpm，26°C，摇瓶培养7d即得。上述的提高虫草菌素含量的方法，其中PDA斜面培养基的制备方法如下马铃薯 200g切块，用水煮沸30min，过滤取汁，加葡萄糖20g，琼脂20g，水补足1000mL，pH自然。灭菌条件121°C，30min。上述的提高虫草菌素含量的方法，其中PDA液体种子培养基的制备方法如下马铃薯200g切块，用水煮沸30min，过滤取汁，加葡萄糖20g，水补足1000mL，pH自然。灭菌条件121°C，30min。上述的提高虫草菌素含量的方法，其中PDA发酵培养基的制备方法如下马铃薯 200g切块，用水煮沸30min，过滤取汁，加葡萄糖20g，水补足lOOOmL，pH自然。灭菌条件 121°C，30min。该菌种已于2010年9月3日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址中国武汉武汉大学)，保藏号CCTCC NO =M 2010219，名称为蛹草拟青霉08-01 {Paecilomyces militaris 08-01)。本发明的蛹草拟青霉Waecilomyces miHtarism-Ql菌株来源可靠，对温度、pH等自然环境条件的适应范围广，容易培养和保存，产虫草菌素条件稳定，可作为提取虫草菌素的后备菌株，扩充资源库。两相培养体系中用的油酸、其添加时间及浓度的选择，经试验证明提高虫草菌素产量效果好，在真菌次级代谢产物提高方面有很大的应用前景。该技术路线合理，可为大规模工业化生产提供可靠的中试数据和设计依据，为实现液体发酵工业化生产虫草菌素奠定基础。
具体实施例方式试验例
(1)有机相筛选
将油酸，十二酸分别以6%浓度加入到发酵培养基中，接入4%液体母种，26°C，140rpm, 摇瓶培养7天。观察菌丝体生长情况，发现通过肉眼观察，在发酵完成后，添加十二酸的发酵液中未见菌丝的生长，没有菌丝球或菌体，有絮状物漂浮或悬浮，为十二酸遇水析出物； 添加油酸的发酵液中可见到大量菌丝，但未形成菌丝球；由于油酸的IogP值为7. 7，十二酸的IogP值为5. 0，随着IogP值降低，有机溶剂的毒性增大，从而影响菌丝球和菌环的形成， 甚至抑制菌体生长。故有机溶剂十二酸舍去，有机相的添加种类确定为油酸
(2)油酸添加浓度的筛选
油酸分别以2%、4%、6%、8%、10%的浓度加到发酵培养基中，接入4%液体母种，26 °C， 140rpm，摇瓶培养7天，制备待测液，HPLC测定结果显示当油酸添加浓度为2% — 8%时， 虫草菌素产量随添加浓度的增加而升高，但随着添加浓度的继续增加，虫草菌素产量反而降低。因此，确定油酸最适添加的浓度为6 — 8%。(3)油酸添加时间的筛选
将4%液体母种接入发酵培养基中，260C，140rpm,摇瓶培养O d、ld，2d，3d，4d，5d时分别加入8%油酸，继续摇瓶培养到7天，制备待测液，HPLC测定结果显示随着油酸添加时间的推后，虫草菌素产量呈下降趋势。因此，确定油酸最适合添加时间为Od，即与08-01菌株一同发酵培养。(4)油酸提高虫草菌素含量的工艺
08-01菌株接在PDA斜面上，260C，培养5d，活化3次，转接到PDA液体种子培养基中， 140rpm，26°C，摇瓶培养3d，得液体母种，以4%接种量接入到PDA发酵培养基中，同时添加 6 - 8%油酸，140rpm，26°C，摇瓶培养7d，虫草菌素总量为5. 570 士0. Olmg/L,比未加油酸的发酵体系提高2.5。实施例1
一种提高虫草菌素含量的方法，包括以下步骤
(1)PDA斜面培养基的制备
马铃薯200g切块，用水煮沸30min，过滤取汁，加葡萄糖20g，琼脂20g，水补足IOOOmL, pH自然；灭菌条件:121°C，30min ；
(2)PDA液体种子培养基的制备
马铃薯200g切块，用水煮沸30min，过滤取汁，加葡萄糖20g，水补足lOOOmL，pH自然； 灭菌条件:121°C，30min ；
(3)PDA发酵培养基的制备马铃薯200g切块，用水煮沸30min，过滤取汁，加葡萄糖20g，水补足lOOOmL，pH自然； 灭菌条件:121°C，30min ；
(4) 孢子悬液的制备
蛹草拟青霉、Paeci lomyces mili tar is ) 08-01菌株接于PDA斜面培养基，26 °C培养 5d，用无菌吐温-80生理盐水洗下孢子，转入带有玻璃珠的无菌三角瓶中，振荡，充分打散孢子，用4层无菌镜头纸过滤除去菌丝，制成孢子数为IO6倍的孢子悬液；
(5)液体母种的制备
取制好的孢子悬液，以5%接种量接于PDA种子培养基中，26°C，140rpm，摇瓶培养3天， 获得液体母种；
(6)接种:
以4% (ν/ν)接种量接入到PDA发酵培养基中，同时添加6%油酸，140rpm，26°C，摇瓶培养7d。得到的虫草菌素总量为5. 481 士0. 01mg/L,比未加油酸的发酵体系提高2. 46。实施例2:
一种提高虫草菌素含量的方法，包括以下步骤
(1)PDA斜面培养基的制备
(2)PDA液体种子培养基的制备
(3)PDA发酵培养基的制备
(4)孢子悬液的制备
(5)液体母种的制备以上五步同实施例1 ；
(6)接种:
以4% (ν/ν)接种量接入到PDA发酵培养基中，同时添加7%油酸，140rpm，26°C，摇瓶培养7d。得到的虫草菌素总量为5. 608士0. 01mg/L,比未加油酸的发酵体系提高2. 52。实施例3:
一种提高虫草菌素含量的方法，包括以下步骤
(1)PDA斜面培养基的制备
(2)PDA液体种子培养基的制备
(3)PDA发酵培养基的制备
(4)孢子悬液的制备
(5)液体母种的制备以上五步同实施例1 ；
(6)接种:
以4% (ν/ν)接种量接入到PDA发酵培养基中，同时添加8%油酸，140rpm，26°C，摇瓶培养7d。得到的虫草菌素总量为5. 621 士0. 01mg/L,比未加油酸的发酵体系提高2. 53。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
权利要求
1.一种提高虫草菌素含量的方法，包括蛹草拟青霉08-01接在PDA斜面培养基上， 260C，培养5d，活化3次，再接入到PDA液体种子培养基中，140rpm, 26°C，摇瓶培养3d，得液体母种，以v/v为4%接种量接入到PDA发酵培养基中，其特征在于同时添加有机溶剂油酸ν/ν为6-8%，140rpm, 26°C，摇瓶培养7d即得。
2.如权利要求1所述的提高虫草菌素含量的方法，其特征在于PDA斜面培养基的制备方法如下马铃薯200g切块，用水煮沸30min，过滤取汁，加葡萄糖20g，琼脂20g，水补足 IOOOmL, pH 自然；灭菌条件:121°C，30min。
3.如权利要求1或2所述的提高虫草菌素含量的方法，其特征在于PDA液体种子培养基的制备方法如下马铃薯200g切块，用水煮沸30min，过滤取汁，加葡萄糖20g，水补足 IOOOmL, pH 自然；灭菌条件121°C，30min。
4.如权利要求3所述的提高虫草菌素含量的方法，其特征在于PDA发酵培养基的制备方法如下马铃薯200g切块，用水煮沸30min，过滤取汁，加葡萄糖20g，水补足lOOOmL，pH 自然；灭菌条件:121°C，30min。
全文摘要
本发明公开了一种提高虫草菌素含量的方法，包括蛹草拟青霉(Paecilomyces militaris)08-01接在PDA斜面培养基上，26℃,培养5d，活化3次，再接入到PDA液体种子培养基中，140rpm，26℃，摇瓶培养3d，得液体母种，以4%(v/v)接种量接入到PDA发酵培养基中，同时添加有机溶剂油酸v/v为6-8%，140rpm，26℃，摇瓶培养7d即得。本方法提高虫草菌素含量明显，培养基质容易获得，发酵条件稳定、简单。
文档编号C12R1/79GK102220397SQ20111009350
公开日2011年10月19日 申请日期2011年4月14日 优先权日2011年4月14日
发明者任秀秀, 刘吴娟, 周礼红, 李祝, 肖洋, 陈青 申请人:贵州大学