专利名称：一种结核杆菌候选抗原及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种结核杆菌候选抗原及其应用。
背景技术：
y S T细胞由于在抗结核免疫中发挥重要的作用引起越来越多的关注，磷酸抗原被认为是Y S T细胞识别的主要抗原，但磷酸抗原活化的Y S T细胞缺乏对结核杆菌有效的免疫保护。相比而言，结核杆菌的蛋白抗原有着更有效的免疫保护作用。一直以来，研究者采取不同的方法获取Y S T细胞识别的结核杆菌的蛋白抗原，早期的方法是通过不同的方式处理结核杆菌，通过质谱分析活化Y S T细胞的蛋白成分，粗略地鉴定出活化Y S T细 胞的结核蛋白抗原成分集中在10-14KD的范围内。但应用此种方法并没有得到特定的结核抗原成分。Alderson的课题组以结核病人的抗血清和结核杆菌反应性的⑶4+T淋巴细胞为探针，通过筛选结核杆菌的基因表达文库中发现了与之发生特异性结合的抗原表位，为获得有效的结核亚单位疫苗奠定了基础。但到目前为止，以Y S T淋巴细胞为探针钓取抗原表位的研究未见报道。由于分离得到的结核病人外周血Y 6 T细胞在体外存活时间较短，如果没有其他细胞因子和抗Y S TCR抗体的刺激作用仅能存活2周左右，不能满足筛选文库的需要，因此如能够在体外建立结核特异性Y S T细胞系，作为钓取抗原表位的探针，将能够满足筛选
Y6 T细胞识别的结核杆菌抗原表位的需要。缺陷型T淋巴瘤细胞系J. RT3-T3. 5细胞恰恰能够满足这种需要，此种细胞系不表达有功能的TCR，但可接受外源的TCR链，形成有功能的均一化的Y S TCR转染细胞系。此种细胞系在外源抗原的刺激下，活化表达IL-2。因此，根据转染细胞系IL-2的分泌情况，可以判断Y 6 T细胞对相应抗原的识别及在Y S TCR识别抗原的过程中，关键的识别位点(Xi XY, et al. 2009. J. Bio. Chem. 284 27449-27455. Xi XY, et al.2010.International Immunology 22 :299-306.)。但以
YS TCR转染细胞系为探针，筛选文库的研究未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种多肽及其应用，可以用来作为结核杆菌蛋白抗原的候选表位肽。本发明提供的多肽，是具有如下氨基酸残基序列之一的多肽(a)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的多肽；(b)将序列表中序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由(a)衍生的多肽。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。编码所述多肽的基因也是本发明保护的范围。所述基因是如下⑴或⑵或⑶的DNA分子
(I)序列表中序列6所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(I)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的多肽的DNA分子;(3)与⑴限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有相同功能的多肽的DNA分子。含有所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。所述多肽或所述基因或所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备促进Y S T细胞分泌IL-2的促进剂中的应用也是本发明保护的范围。
所述多肽在制备促进Y 6 T细胞的增值的促进剂中的应用也是本发明保护的范围。所述多肽在制备结核杆菌疫苗中的应用也是本发明保护的范围。所述多肽在制备抗结核杆菌产品中的应用也是本发明保护的范围。所述产品为药物。本发明的实验证明，本发明建立了一种筛选Y ST细胞识别的结核蛋白抗原的新策略，以体外建立结核反应性Y S TCR转染细胞系为探针在噬菌体随机文库中钓取
YS TCR识别的结核抗原表位，功能验证的结果显示表位TPl是可能的Y S T细胞识别的结核表位，为开发新型结核疫苗或佐剂成分提供新的思路。
图I为构建结核特异性和非特异性Y 6 TCR转染细胞图2为以转染细胞为探针，筛选噬菌体十二肽库的操作流程图3为优势表位肽TPl与结核特异性Y 6 TCR转染细胞的结合能力鉴定图4为优势表位肽TPl与结核病人外周血中Y 6 T细胞的结合能力鉴定图5为DXS2蛋白的功能鉴定图
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中实验均重复三次，结果取平均值。实施例I、y S T细胞识别的结核杆菌的抗原表位的获得I、构建结核特异性和非特异性Y S TCR转染细胞系取结核病人肝素抗凝新鲜静脉血(由北京胸科医院获得，患者知情。)5毫升，加入等体积RPMI-1640培养液(Hyclone公司，Catalog SH30809)轻轻混匀，将上述混合液缓慢加至预先已加入等体积淋巴细胞分离液的试管中，避免破坏界面，500Xg离心20分钟；取试管中白色界面层于另一试管中，加入等体积RPMI-1640培养液(Hyclone公司，Catalog SH30809)清洗二次。离心后加入Trizol，静置5分钟，加入200 U I氯仿，剧烈振动后于室温(25°C )放置3分钟，12，000Xg，4°C离心15分钟。小心吸取上层水相，转移至一新离心管，加入500 ill异丙醇，上下颠倒混匀，室温放置10分钟。12，000Xg，4°C离心15分钟，弃上清，加入Iml 75%的乙醇，振荡，7，500Xg，4°C离心5分钟，弃上清。室温干燥沉淀，溶于适量DEPC处理的水。取RNA样品12 ill加入Oligo(ClT)15 (500 ii g/ml) I iil，70°C加热变性5分钟，取出后立即置于冰上，待冷却后依次加入5XBuffer 5 iil、dNTP (IOmM) 5 yl、RNA酶抑制剂I yl，MMLV逆转录酶I U 1，总体积为25 u 1，42°C孵育60分钟进行逆转录反应合成外周血PBMC的cDNA第一链。根据结核反应性Y 6 T细胞的⑶R3区序列，设计合成Y 9和S 2链上段搭桥引物和下段搭桥引物，具体序列见表I。表I健康人及结核病人优势Y 9/ S 2链的⑶R3序列
权利要求
1.DXS2蛋白在制备促进Y 6 T细胞分泌IL-2的促进剂中的应用，DXS2蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列6。
2.DXS2蛋白在制备促进YS T细胞的增值的促进剂中的应用，DXS2蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列6。
3.DXS2蛋白在制备结核杆菌疫苗中的应用，DXS2蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列6。
4.DXS2蛋白在制备抗结核杆囷广品中的应用，DXS2蛋白的氣基酸序列为序列表中的序列6。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述产品为药物。
全文摘要
本发明公开了一种结核杆菌候选抗原及其应用。本发明提供提供DXS2蛋白在制备促进γδT细胞分泌IL-2的促进剂中的应用，DXS2蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列6。本发明还提供了DXS2蛋白在制备促进γδT细胞的增值的促进剂中的应用，DXS2蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列6。本发明的实验证明，本发明发现的蛋白，可能的γδT细胞识别的蛋白抗原，为开发新型结核疫苗或佐剂成分提供新的思路。
文档编号C12R1/32GK102747048SQ201110100378
公开日2012年10月24日 申请日期2011年4月20日 优先权日2011年4月20日
发明者何维, 赵振东, 郗雪艳 申请人:中国医学科学院病原生物学研究所