专利名称：利用廉价氮源发酵制备丁二酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用廉价氮源发酵制备丁二酸的方法，属于发酵工程领域。
背景技术：
丁二酸(俗名琥珀酸)是生物炼制产品工程中优秀的碳四平台化合物，微生物法生产丁二酸具有高效率、环保性以及原料的可再生性等优点。微生物法制备丁二酸所用的菌禾中主要有 Mannheimia succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, Anaerobiospirillum succiniciproducens 以及 Escherichia coli 等，而这些微生物禾Ij 用葡萄糖等可再生资源高效生产丁二酸的同时需要富含氨基酸、维生素、无机盐以及微量元素等营养成分来维持菌体正常生长代谢，而酵母粉、蛋白胨、牛肉膏等氮源就是因为富含多种上述营养成分而被广泛利用，但这些氮源价格昂贵，限制了微生物法制备丁二酸的工业化。本申请人的一个在先中国专利申请CN101748162A公开了一种利用微生物发酵废弃细胞实现氮源循环利用的方法。该方法利用发酵工业中微生物发酵生产结束后的菌体细胞破壁后的上清液作为氮源，实现了发酵工业中发酵结束后部分氮源的回收，既降低了产品生产成本，又减轻了废弃物处理的负担。
发明内容
本发明的技术目的是提供一种利用廉价氮源发酵制备丁二酸的方法，使得该方法可以以廉价氮源替代或减少酵母粉等昂贵氮源的用量，以降低丁二酸生产成本。在了解目前氮源使用情况以及成本后，本发明的技术方案为
一种利用廉价氮源发酵制备丁二酸的方法，包括利用廉价氮源配制发酵培养基、接入种子液发酵培养制备丁二酸，其特征在于所述的发酵培养基中的廉价氮源为豆饼粉、棉籽粉、花生饼粉、鱼粉、麸皮、豆粕、玉米蛋白粉、豆粕水解液或者玉米蛋白粉水解液，且其总氮含量等于发酵时微生物所需的的总氮含量。其中，本发明所述的发酵制备丁二酸的方法应理解为现有技术中任何利用产丁二酸微生物发酵生产丁二酸的方法，例如，所述的产丁二酸微生物通常包括Mannheimia succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, AnaerobiospiriHum succiniciproducens以及Escherichia coli ；所述的发酵方法通常是指常规的发酵方法，即首先培养产丁二酸微生物的种子液，再将种子液接种于发酵培养基中进行发酵，发酵结束后的发酵液再进行下游分离处理得到丁二酸产品。本发明的技术要点即在于选择了廉价的氮源来代替现有技术的丁二酸发酵常规培养基中的氮源。而常规的氮源通常是酵母粉、蛋白胨、牛肉膏等价格昂贵的氮源。而本发明通过直接利用豆饼粉、棉籽粉、花生饼粉、鱼粉、麸皮、豆粕、玉米蛋白粉，或者对豆粕、玉米蛋白粉进行预处理、水解得到其水解液，并考察各种廉价氮源对发酵的影响，廉价氮源与酵母粉的联用对发酵的影响。根据各种廉价氮源的特性分别进行预处理和水解，然后根据微生物生长所需的总氮含量加入与之总氮含量相等的氮源或者氮源水解液，或者加入氮源与酵母粉的混合物，替代了传统的高价氮源，实现了同样产率的丁二酸的发酵生产。利用本发明的方法，碳源及其他无机盐等营养成分与常规培养基完全相同，并且在相同的发酵条件下进行微生物发酵，实验结果证明按照本发明配制的培养基与常规培养基发酵能力相当。通过本发明提供的利用廉价氮源发酵制备丁二酸的方法，减少了酵母粉用量，降低了丁二酸生产成本。其中，本发明所述的豆粕水解液的制备方法为
(1)磷酸预处理；
(2)酶水解处理后，离心得到的上清液。其中所述的磷酸预处理方法是指将豆粕粉按固液质量比1:10制成豆粕粉水溶液，在豆粕粉水溶液中按33. 3 μ L/g干物料加入85%的磷酸于90°C下预处理10 min。所述的酶水解处理是指用2 mol/L NaOH溶液将磷酸预处理之后的豆粕粉溶液的 PH调至8. 0，按4. 17g/kg干物料加入碱性蛋白酶(诺维信公司生产)，于55°C下水解Mh。本发明所述的玉米蛋白粉水解液的制备方法为所述的玉米蛋白水解液的制备方法为酶水解处理后，离心得到的上清液将玉米蛋白粉制成质量浓度为10%的水溶液，并用 2 mol/L NaOH溶液将溶液pH调至8. 5，按5. 3 g/kg干物料加入碱性蛋白酶(诺维信公司生产)，于60°C下水解10h，水解结束后留上清液即为玉米蛋白粉水解液。本发明所述廉价氮源还可以是上述豆饼粉、棉籽粉、花生饼粉、鱼粉、麸皮、豆粕、 玉米蛋白粉、豆粕水解液或者玉米蛋白粉水解液与酵母粉联用的氮源；即当单独使用廉价氮源时丁二酸生产能力达到极限，可以选择与酵母粉联合使用，使得丁二酸生产能力进一步提尚。本发明的另一个有益效果在于，豆饼粉、棉籽粉、花生饼粉、鱼粉、麸皮、豆粕以及玉米蛋白粉是食品行业主要的副产物，含有丰富的蛋白、氨基酸以及B族维生素等微生物生长所需的营养成分，可以减少酵母粉、蛋白胨等昂贵氮源的用量，并且价格低廉，来源广泛，能有效地降低丁二酸的生产成本。
具体实施例方式以下实施例对本发明做了详细说明，但对本发明的应用并无限制。实施例1
ActinobaciIlus succinogenes NJ113(CGMCC 1716)利用豆饼粉为氮源厌氧发酵制备丁二酸，总氮含量测定方法为凯氏定氮法。表1豆饼粉总氮含量以及发酵培养基中豆饼粉用量
发养慕豆^^中Jb^r 申豆饼粉翔重1.25 gO^ CLOS 1 s^g15.53 S^U
由表1可见，Actinobacillus succinogenes NJl 13以豆饼粉为氮源厌氧发酵制备丁酸时豆饼粉用量为15. 53 g/L。
种子培养基酵母膏5 g/L，玉米浆干粉 2. 5 g/L，NaHCO3 10 g/L，NaH2PO4 · 2H20 9. 6 g/L, K2HPO4 · 3H20 15. 5 g/L。种子培养方法在250mL血清瓶中加入上述培养基96mL，121°C灭菌15 min，加入已灭菌的浓度为500 g/L的葡萄糖2mL，菌液2mL，于37°C，200rpm摇床中培养10h。发酵培养基豆饼粉15.53 g/L，玉米浆干粉7.5 g/L，乙酸钠1.36 g/L，K2HPO4 3 g/L, NaCl 1 g/L, CaCl2 0. 2 g/L, NaH2PO4 · 2H20 1. 6 g/L, Na2HPO4 · 3H20 0. 31 g/L。在3L发酵罐中加入上述发酵培养基1.25 L，121°C灭菌15 min，加入已灭菌的浓度为500 g/L的葡萄糖150 mL，种子液100 mL。此时培养基中总氮含量为1. 25 g/L，相当于常规培养基中10 g/L酵母粉的总氮含量，葡萄糖浓度为50g/L。实验条件按接种量7 % ^AAc tinobacillus succinogenes NJ113 种子液 IOOmL,发酵温度37 °C，搅拌转速200 r/min，CO2通气量0. 2 vvm，以25% Na2CO3 SpH调节剂维持PH在6. 8。将本实施例发酵培养基和常规发酵培养基在上述相同条件下进行发酵实验， 48h后检测发酵液中丁二酸以及甲酸、乙酸、乳酸的含量，结果见表2。表2以豆饼粉为氮源的发酵结果
权利要求
1.一种利用廉价氮源发酵制备丁二酸的方法，包括利用廉价氮源配制发酵培养基、接入种子液发酵培养制备丁二酸，其特征在于所述的发酵培养基中的廉价氮源为豆饼粉、棉籽粉、花生饼粉、鱼粉、麸皮、豆粕、玉米蛋白粉、豆粕水解液或者玉米蛋白粉水解液，且其总氮含量等于发酵时微生物所需的总氮含量。
2.根据权利要求1所述的利用廉价氮源发酵制备丁二酸的方法，其特征在于所述的豆粕水解液的制备方法为(1)磷酸预处理；(2)酶水解处理后，离心得到的上清液。
3.据权利要求2所述的利用廉价氮源发酵制备丁二酸的方法，其特征在于所述的步骤(1)的磷酸预处理方法是指将豆粕粉按固液质量比1:10制成豆粕粉水溶液，在豆粕粉水溶液中按33. 3 μ L/g干物料加入85%的磷酸于90°C下预处理10 min。
4.据权利要求2所述的利用廉价氮源发酵制备丁二酸的方法，其特征在于所述的步骤(2)的酶水解处理方法是用2mol/LNaOH溶液将磷酸预处理之后的豆粕粉溶液的pH调至 8. 0，按4. 17g/kg干物料加入碱性蛋白酶，于55°C下水解Mh。
5.根据权利要求1所述的利用廉价氮源发酵制备丁二酸的方法，其特征在于所述的玉米蛋白水解液的制备方法为酶水解处理后，离心得到的上清液。
6.根据权利要求5所述的玉米蛋白水解液酶水解方法是将玉米蛋白粉制成质量浓度为10%的水溶液，并用2 mol/L NaOH溶液将溶液pH调至8. 5，按5. 3g/kg干物料加入碱性蛋白酶，于60°C下水解IOh后得到上清液。
7.根据权利要求1所述的利用廉价氮源发酵制备丁二酸的方法，其特征在于所述的廉价氮源是豆饼粉、棉籽粉、花生饼粉、鱼粉、麸皮、豆粕、玉米蛋白粉、豆粕水解液或者玉米蛋白粉水解液与酵母粉联用的混合物。
全文摘要
本发明涉及一种利用廉价氮源发酵制备丁二酸的方法，属于发酵工程领域。本发明的技术要点在于所述的发酵培养基中的廉价氮源为豆饼粉、棉籽粉、花生饼粉、鱼粉、麸皮、豆粕、玉米蛋白粉、豆粕水解液或者玉米蛋白粉水解液，且其总氮含量等于发酵时微生物所需的的总氮含量。按照本发明配置的培养基与常规培养基发酵能力相当。通过本发明提供的利用廉价氮源发酵制备丁二酸的方法，减少了酵母粉用量，降低了丁二酸生产成本。
文档编号C12P7/46GK102191283SQ201110102338
公开日2011年9月21日 申请日期2011年4月23日 优先权日2011年4月23日
发明者姜岷, 方晓江, 李建, 欧阳平凯, 郑晓宇, 陈可泉 申请人:南京工业大学