专利名称：通过超量表达comA基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法
技术领域：
本发明涉及通过超量表达C—基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法，属于生物技术领域。背景技术：
枯草芽孢杆菌OfeCiBm ·5油ii/is)是目前公认的安全微生物之一，其抗菌代谢产物丰富多样，尤其是脂肽类抗菌物质，不仅抗菌谱广而且还具有生物表面活性剂的功能，因此不仅可以在农业上用于进行生物防治，而且在工业和环境保护上也有着广泛的应用。枯草芽孢杆菌(feci/^Assubtil is) ATCC 9943 是一种可以分泌 surfactin， fengycin等抗菌月太物质的枯草芽孢杆菌(Val6rie Leclere, Romain Marti, Max Bechet. The lipopeptides mycosubtilin and surfactin enhance spreading of Bacillus subtilis strains by their surface-active properties. Arch Microbiol. (2006) 186: 475-483)。其中，surfactin作为一种生物表面活性剂，与化学表面活性剂相比，其具有拥有生物降解能力，低毒，结构丰富的优点，随着对工业原料的环境适应性要求的提高， 其应用于环境保护，石油开采方面潜力将会越来越大。但实际中，其并未在工业以及环境保护中广泛应用，究其原因，是因为它生产成本巨大，所以提高其产量便成为降低其生产成本的核心问题。目前，世界范围内，提高其产量的方法主要是筛选优良菌株，以及优化发酵条件， 而很少采用分子生物学技术对菌种进行改良的方法来提高其产抗菌物质的产量。但随着对抗菌肽合成分泌研究的日益深入，已经逐渐开始采用分子生物学技术，通过改造其合成分泌中信号通路等方法来对原始菌种进行基因改良，从而提高其自身合成分泌抗菌肽能力。co—基因(Gene ID: 126362990)，其表达产物枯草杆菌感受态因子ComA是枯草杆菌中十分重要的调控蛋白之一，在枯草芽孢杆菌各种生理代谢过程中发挥着重要的作用，相关研究表明，ComA蛋白可以与surfactin合成酶基因启动子结合从而刺激其表达。本方法首先以枯草芽孢杆菌ATCC 9943为出发菌株，以枯草杆菌整合载体pDK为骨架构建一个基因整合载体pDK-ComA，利用同源重组原理，通过双交换过程将comA基因整合到枯草芽孢杆菌ATCC 9943基因组中使其超量表达的方法构建了一个高产抗菌肽菌株 FMB 27。
发明内容
技术问题
本发明的目的是利用分子生物学技术，构建comA超量表达载体，经过电转化通过同源重组将Pspac-comA基因整合入枯草芽孢杆菌ATCC 9943基因组a 对位点，从而构建一种高产抗菌肽的枯草芽孢杆菌菌株FMB 27。技术方案
1、通过超量表达C—基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法，其特征在于 (1) comA基因超量表达载体PDK-ComA的构建
3根据红霉素抗性基因设计引物EM-F和EM-R，以pMUTIM质粒DNA为模板PCR扩增红霉素抗性基因，获得850 bp基因片段；根据枯草芽孢杆菌基因设计引物ComA-F和 ComA-R，以枯草芽孢杆菌ATCC 9943基因组DNA为模板PCR扩增co—基因，获得645 bp基因片段；扩增得到的两个基因分别克隆至PMD19-T载体，转化大肠杆菌(federidia coli) DH5a,经验证、测序正确后，分别命名为pZI-T、pComA-T,于_20°C条件下保存备用；
权利要求
1.通过超量表达C—基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法，其特征在于 U) comA基因整合载体pDK-ComA的构建设计引物EM-F和EM-R，以pMUTIM质粒DNA为模板PCR扩增红霉素抗性基因涨，获得 850 bp基因片段；设计引物ComA-F和ComA-R，以枯草芽孢杆菌ATCC 9943基因组DNA为模板PCR扩增comA基因，获得645 bp基因片段；扩增得到的两个基因分别克隆至pMD19_T 载体，转化大肠杆菌(fecAericAia co7i)DH5a,经验证、测序正确后，分别命名为pEM_T、 pComA-T,于_20°C条件下保存备用；名称序列酶切位点ComA-F5 ‘ CCGGAATTCATGACCAGTCAGTCAATAMAAATG3‘EcoRIComA-R5 ‘ GCGGGATCCTTACTCTTCTTCCGTTCCCGG3‘BamHIEM-F5 ‘ CGATACGTATGATAGGTGGTATGTTTTCGC3‘SnaBIEM-R5 ‘ AAMGTACTCATGTGTACATTCCTCTCTT3 ‘SacIPDK用snaBI/Sall双酶切后获得的大片段，与经过相同双酶切处理的pMUTIM载体后获得的包括Pspac启动子和多克隆位点MCS的片段，用T4 DNA连接酶连接，构建pDK-Pspac 载体，酶切验证正确后于-20°C条件下保存备用；pDK-Pspac用SrmBI/sacl双酶切后获得的大片段，与经过相同双酶切处理的pEM_T载体后获得的涨基因片段，用T4 DNA连接酶连接，构建pDK-Pspac-EM载体，酶切验证正确后于-20°C条件下保存备用；pComA-T用BamHI/EcoRI酶切后获得comA片段，与经过相同酶切处理的pDK-Pspac-EM 载体，用T4 DNA连接酶连接，构建comA基因超量表达载体pDK-ComA，酶切验证正确后，转化大肠杆菌DH5a，用于下一步转化； (2) FMB 27突变菌株的构建以枯草芽孢杆菌ATCC 9943制备感受态细胞，采用电转化方法，将获得的基因超量表达载体pDK-ComA转化入枯草芽孢杆菌ATCC 9943，在基因组_yE位点发生双交换，红霉素平板上筛选得到红霉素抗性菌株，命名为FMB 27 ；该菌株的amyE基因被/^pac-Cb— 基因所取代，成为超量表达基因的突变菌株，即为所得到的菌株。
2.权利要求1所述方法获得的超量表达基因菌株FMB27。
3.权利要求2所述超量表达基因菌株FMB27在生产枯草芽孢杆菌抗菌肽中的应用。
4.权利要求2所述超量表达基因菌株FMB27生产的枯草芽孢杆菌抗菌肽产品。
全文摘要
本发明涉及通过超量表达comA基因提高枯草杆菌抗菌肽产量的方法，属于生物技术领域。本方法首先以枯草芽孢杆菌ATCC9943为出发菌株，以整合载体pDK为骨架构建一个基因超量表达载体pDK-ComA，利用同源重组原理，通过双交换过程将comA基因整合到枯草芽孢杆菌ATCC9943基因组的方法构建了一个高产抗菌肽菌株FMB27。经过高效液相色谱分析，确定改良菌株产surfactin和fengycin的能力大大提高。
文档编号C12N15/75GK102220366SQ20111010539
公开日2011年10月19日 申请日期2011年4月27日 优先权日2011年4月27日
发明者别小妹, 吕凤霞, 张充, 曹国强, 钟蕾, 陆兆新 申请人:南京农业大学