专利名称：一种检测三种鱼类弹状病毒的测量审核用试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测三种鱼类弹状病毒的测量审核用试剂盒。背景资料
i^M&MKWX^'M'MM (Infectious hematopoietic necrosis virus, IHNV),^| 毒性出血性败血症病毒(Viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)和鲤春病毒血症病毒(Spring Viraemia of Carp Virus, SVCV)是同属弹状病毒科(Rhabdoviridae)的三种鱼类病毒，也是影响水产养殖业的三种重要病毒。其中，IHNV和VHSV属于粒外弹状病毒属 (.Novirhabdovirus), SVCV属于水泡病毒属(Vesiculovirus、,它们均是单链负股RNA病毒。 这三种病毒广泛分布于欧洲、美洲和亚洲的许多地区，可感染多种鱼类，尤其是对鱼苗和幼鱼，能引起较高的死亡率，严重时均可达到90%以上。分别由这三种病毒引起的传染性造 胃ifInfectious hematopoietic necrosis, IΗΝ),^JfiLfi^iil^E(Viral hemorrhagic septicemia, VHS)禾口鲤春病毒血症(Spring Viraemia of Carp, SVC) 一J=L 爆发，将会给水产养殖业带来灾难性的损失，所以它们是世界各国积极进行防制的三种鱼类疫病。目前，国内有许多沿海实验室和内陆水产养殖产业发达的地区试验室都开展关于这三种病毒的检测。常用的病毒检测方法是细胞培养分离病毒法、血清学方法以及聚合酶链反应(PCR)。细胞培养分离病毒法结果可靠，但检测周期长，不适用于快速鉴别诊断，而且往往还需要其他方法进行后继检测，才能确定病毒种类。普通RT-PCR和实时荧光RT-PCR技术的应用，提高了检测的特异性和灵敏度，缩短了检测时间，取得了一定的效果。Williams 等(1999年)还报到了使用多重RT-PCR检测IPNV、IHNV和VHSV的研究，大大提高了多种病毒检测时的工作效率。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种检测三种鱼类弹状病毒的测量审核用试剂盒。该试剂盒主要在动物检疫专业的测量审核领域使用，用于比对实验室检测三种鱼类弹状病毒能力的试剂盒，即该试剂盒能用于评价考核实验室是否能正确检测三种鱼类弹状病 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案
一种检测三种鱼类弹状病毒的测量审核用试剂盒，保存于-20°C，该试剂盒是由以下样品组成
A 含IO7拷贝/mL目的核酸片段的溶液，所述目的核酸片段为病毒性出血性败血症病毒(VHSV)体外转录的RNA片段，其对应的DNA序列为序列表SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列；
B 含IO8拷贝/mL目的核酸片段的溶液，所述目的核酸片段为病毒性出血性败血症病毒(VHSV)体外转录的RNA片段，其对应的DNA序列为序列表SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列；C 含IO7拷贝/mL目的核酸片段的溶液，所述目的核酸片段为传染性造血组织坏死病病毒(IHNV)体外转录的RNA片段，其对应的DNA序列为序列表SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列；
D 含IO8拷贝/mL目的核酸片段的溶液，所述目的核酸片段为传染性造血组织坏死病病毒(IHNV)体外转录的RNA片段，其对应的DNA序列为序列表SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列；
E:含IO7拷贝/mL目的核酸片段的溶液，所述目的核酸片段为鲤春病毒血症病毒 (SVCV)体外转录的RNA片段，其对应的DNA序列为序列表SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列； F:含IO8拷贝/mL目的核酸片段的溶液，所述目的核酸片段为鲤春病毒血症病毒 (SVCV)体外转录的RNA片段，其对应的DNA序列为序列表SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列； G 不含目的核酸片段的溶液。其中，所述溶液优选为75%乙醇溶液。本发明所述测量审核用试剂盒的使用方法
1.各个参试实验室可选择国际、国家和行业标准方法或其他非标方法，进行三种鱼类弹状病毒核酸的检测验证；
2.试剂盒说明书
2. 1保存温度-20°C ； 2. 2有效期6个月；
2. 3使用方法使用前颠倒混勻管内液体，然后再抽提RNA核酸进行测试分析； 2. 4循环条件设置 第一阶段，反转录42 0C 30 min； 第二阶段，预变性92 0C 3 min；
第三阶段，92 V 10 s ；45 V 30 s ；72 V 1 min ;5 个循环；
第四阶段，92 V 10 s;60 V 30 s ;40个循环，在第四阶段每次循环的退火延伸时收
集荧光；
试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果；
2. 5相对参考Ct值以2. 4中的循环参数为准，IO7拷贝/mL目的核酸片段溶液的相对参考Ct值约为17，IO8拷贝/mL目的核酸片段溶液的相对参考Ct值约为13。3.结果评价
如果未检测到本试剂盒中的特定RNA序列，则说明该参试实验室检测技术有问题；如果能检测到本试剂盒中的特定目的核酸片段，并且检测的Ct值与标定的Ct值采用两样本均数显著性检验一 t检验进行统计分析无显著差异，则证明该参试实验室检测技术水平优良；如果能检测到本试剂盒中的特定目的核酸片段，但是检测的Ct值与标定的Ct值采用两样本均数显著性检验一 t检验进行统计分析有显著差异，则证明该参试实验室检测技术水平不够规范和稳定，需要改进。本发明创新性本试剂盒可以同时为分辨IHNV、VHSV和SVCV三种病毒核酸的检测提供一组通过随机组合的测量审核样品，用定性评价的方式对参试机构的测试该三种病毒核酸检测的敏感性、特异性及检测方法的准确性提供一个测评基准工具。此试剂盒对于评价参试机构对三种鱼类弹状病毒核酸的检测能力具有很好参考价值，对提升相关机构的检测能力有很强的促进作用。本试剂盒中的三种病毒核酸按照标准物质的要求进行制备，采用了协作标定、计算不确定度、均勻性和稳定性检验等，调制了适用于测量审核的最佳样品浓度，通过实验证明采用了 75%乙醇溶液作为性价比最高，又能有效保护和分散RNA核酸的分散保护剂。首次提出了动物检疫病毒核酸测量审核样品的制备，并将其定量。下面结合说明书附图
和具体实施方式
对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。本发明所用病毒性出血性败血症病毒(Viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)> # ^ fi it IfiI/ΠΝ i^^i'M'MM (Infectious hematopoietic necrosis virus, IHNV)、鲤春病毒血症病毒(Spring viraemia of carp virus, SVCV)以及 EPC 细胞系 (Epithelioma papillosum cyprini)均由北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心动物实
验室保存。本发明所使用的材料来源克隆载体pGEM-T Easy Vector，购自promega公司(全长3015bp，携带有氨苄青霉素抗性基因(Amp)和Lac基因，重组体可通过蓝白斑和氨苄抗性双重筛选鉴定)；E. coli DH5a感受态细胞，购自天根生化科技(北京)有限公司；TRIZOL Reagent 购自 hvitrogen 公司；Taq DNA 聚合酶、dNTP、M-MLV 反转录酶(M-MLV Reverse Transcriptase)、重组 RNA 酶抑制齐[J (Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor)均购自 promega 公司 JakaRa DNA Fragment Purification Kit Ver 2. O ；TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver 2. O均购自宝(大连)生物工程有限公司；Promega RiboMAX Large Scale RNA Production System- T7 ￠1 g Progema ^W] ；Ready-To-Go RT-PCR Beads 购自 Amersham Biosciences 公司。实施例1 三种鱼类弹状病毒测量审核样品的制备 1.分别设计用于扩增三种鱼类弹状病毒N基因的引物
(1)病毒性出血性败血症病毒(VHSV)引物的设计与合成
根据GenBank中登录的VHSV的全基因序列(序列号AF143862、AF143863、X73873、 Z93412、Z93414)，用DNAMAN软件进行比对分析，在病毒N基因的两端选择保守区域，使用 Oligo 6. O软件设计出一对引物(VPl和VP2)，该引物可以扩增出1278 bp的片段，序列如下
VPl 5' -ATGGAAGGAGGAATTCGTGCAG-3，(SEQ ID No. 4) VP2 :5，-GAGAAATTCTTATAATCGTGCCG-3，(SEQ ID No. 5)
(2)传染性造血器官坏死病(IHNV)引物的设计与合成
根据GenBank中登录的IHNV的全基因序列(序列号:L40883、NC001652、X89213)，用 DNAMAN软件进行比对分析，在病毒的N基因选择保守区域，使用Oligo 6. O软件设计出一对引物(IPl和IP2)，该引物可以扩增出977 bp的片段，序列如下 IPl :5，-TCACGAACGATGACAAGCGCACTC-3，(SEQ ID No. 6) IP2 :5，- ACCTTTATCCCTGTCAGTCCTCTC-3，(SEQ ID No. 7)(3)鲤春病毒血症病毒(SVCV)引物的设计与合成
根据GenBank中登录的SVCV的全基因序列(序列号AJ318079、DQ097384、DQ491000、 NC002803, U18101)，用DNAMAN软件进行比对分析，在病毒N基因的两端选择保守区域，使用Oligo 6.0软件设计出一对引物(SPl和SP2)，该引物可以扩增出1713 bp的片段，序列如下
SPl :5，-GTTCCTTCCCTGTTCATGGGAG-3，(SEQ ID No. 8) SP2 :5，-AATCCAGACGGAGTATCTTGAC-3，(SEQ ID No. 9) 上述引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。2.分别提取三种鱼类弹状病毒RNA
①向指管中加入600μ1 TRIZOL裂解液，然后加入感染VHSV的细胞悬液200 μ 1，吹打混勻。②加入200 μ 1氯仿，振荡混勻15 sec，然后4°C，13，000 rpm，离心15 min。③将上清液移至500 μ 1异丙醇中，颠倒混勻，然后置_20°C沉淀10 min。④ 4°C,13, 000 rpm,离心 15 min。⑤吸弃上清液，向指管中加入75%乙醇600 μ 1，颠倒洗涤。⑥4°C，13, 000 rpm 离心 10 min，弃上清液。⑦4，000 rpm，离心10 sec，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，室温干燥1-5 min。⑧加入100 μ 1 DEPC水，轻轻混勻，溶解管壁上的RNA，制得VHSV的RNA溶液。制备IHNV和SVCV的RNA溶液的方法同上。3.三种病毒RNA反转录和普通PCR扩增 (I)RNA的反转录
分别以提取的三种鱼类弹状病毒的RNA为模板，以随即引物pdN6进行反转录，体系 (25 μ 1)及步骤如下
①向PCR 管中加入 RNA 模板 10 μ 1，pdN6 (50 μ Μ) 1 μ 1 ；
②70°C，5min，冰上急冷；
③继续向PCR管中加入如下成分，见表1 表1
M-MLV 5 X反应缓冲液5. 0μ 1RNA酶抑制剂(4011/μΙ)0. 5μ 1dNTP(IOmM)1. 5μ 1M-MLV(200υ/μ1)1. 0μ 1DEPC 水8. 5μ 1
④ 42°C，1 h ； 95°C，5 min ； 4°C，保存。
(2)普通PCR扩增
分别以三种RNA反转录产物为模板，用各自病毒对应的引物对进行PCR扩增反应，所述引物对为VPl和VP2引物对或IPl和IP2引物对或SPl和SP2引物对，体系(50 μ 1)如下， 见表2 表2
10XReactionBuffer5. 0μ 1MgCl2(25mM)6. 0μ 权利要求
1.一种检测三种鱼类弹状病毒的测量审核用试剂盒，其特征在于，该试剂盒是由以下样品组成A 含IO7拷贝/mL目的核酸片段的溶液，所述目的核酸片段为病毒性出血性败血症病毒体外转录的RNA片段，其对应的DNA序列为序列表SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列；B 含IO8拷贝/mL目的核酸片段的溶液，所述目的核酸片段为病毒性出血性败血症病毒体外转录的RNA片段，其对应的DNA序列为序列表SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列；C 含IO7拷贝/mL目的核酸片段的溶液，所述目的核酸片段为传染性造血组织坏死病病毒体外转录的RNA片段，其对应的DNA序列为序列表SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列；D 含IO8拷贝/mL目的核酸片段的溶液，所述目的核酸片段为传染性造血组织坏死病病毒体外转录的RNA片段，其对应的DNA序列为序列表SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列；E 含IO7拷贝/mL目的核酸片段的溶液，所述目的核酸片段为鲤春病毒血症病毒体外转录的RNA片段，其对应的DNA序列为序列表SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列；F 含IO8拷贝/mL目的核酸片段的溶液，所述目的核酸片段为鲤春病毒血症病毒体外转录的RNA片段，其对应的DNA序列为序列表SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列； G 不含目的核酸片段的溶液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述溶液为75%乙醇溶液。
全文摘要
本发明公开了一种检测三种鱼类弹状病毒的测量审核用试剂盒。该试剂盒含有三种鱼类弹状病毒的特定核酸样品，可以同时为分辨IHNV、VHSV和SVCV三种病毒核酸的检测提供一组通过随机组合的测量审核样品，用定性评价的方式对参试机构的测试该三种病毒核酸检测的敏感性、特异性及检测方法的准确性提供一个测评基准工具。
文档编号C12Q1/68GK102212620SQ20111010654
公开日2011年10月12日 申请日期2011年4月27日 优先权日2011年4月27日
发明者刘国传, 刘来福, 张伟, 张利峰, 段向英, 谷强 申请人:中华人民共和国北京出入境检验检疫局