专利名称：干细胞筛选系统、其制备方法及干细胞的筛选方法
技术领域：
本发明属于干细胞筛选技术领域，尤其涉及一种干细胞筛选系统、其制备方法及干细胞的筛选方法。
背景技术：
间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)是来源于中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，广泛存在于人体结缔组织和器官间质中。间充质干细胞具有高分化性能，在不同的诱导条件下能分化成成熟的间质细胞，如成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、网状细胞、血管内皮细胞等。作为进行组织工程研究的重要种子细胞，间充质干细胞在骨及软骨组织损伤的修复、肌肉组织退行性疾病、冠心病等疾病的治疗方面具有良好的应用前景。现有技术公开了多种间充质干细胞的筛选方法，如密度梯度离心法、全血贴壁法、 流式分选法和免疫磁珠筛选法等，其中，筛选软骨干细胞的方法主要有流式分选法、免疫磁珠筛选法和琼脂糖筛选法。琼脂糖筛选法主要包括以下步骤将含有一定细胞量的DEME/ F12培养液与等体积的2%低熔点琼脂糖充分混合，使细胞在琼脂糖筛选系统中成为单细胞状态；琼脂糖的浓度达到后，将筛选系统在4°C下静置IOmin凝固；然后加入DEME/ F12培养液，于温箱中培养3周 6周；最后在倒置显微镜下提取细胞克隆团，即可得到软骨干细胞。琼脂糖筛选法不仅操作过程繁琐、筛选时间长，而且需要严格控制筛选条件，即便严格控制筛选条件，由于需要在倒置显微镜下提取细胞克隆团，在提取过程中软骨干细胞易受污染、纯度较低。流式分选法是通过流式细胞分选仪进行干细胞筛选的方法，免疫磁珠筛选法是根据免疫学原理，利用包备有抗体的磁珠与干细胞表面的特殊标志特异结合后，通过一定强度磁场时被滞留而分选的方法，流式分选法和免疫磁珠筛选法能够简化筛选步骤，提高筛选效率，但是，由于软骨干细胞缺乏特异性的标志物，采用流式分选法和免疫磁珠筛选法进行筛选得到的干细胞纯度较低；而且流式分选法和免疫磁珠筛选法需要的细胞量大，不利于筛选组织块较小的组织。另外，流式分选法和免疫磁珠筛选法需要特定设备仪器和抗体试剂，筛选成本较高。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种干细胞筛选系统、其制备方法及干细胞的筛选方法，本发明提供的筛选方法无需特定仪器设备和抗体试剂，流程简单、操作简便，得到的干细胞纯度高。本发明提供了一种干细胞筛选系统，包括固体支持物；涂布在所述固体支持物上的纤维连接蛋白和牛血清白蛋白。本发明还提供了一种上述技术方案所述的干细胞筛选系统的制备方法，包括以下步骤将纤维连接蛋白与缓冲溶液混合，得到纤维连接蛋白溶液；将所述纤维连接蛋白溶液加入到固体支持物中进行孵育，得到涂布有纤维连接蛋白的固体支持物；向所述涂布有纤维连接蛋白的固体支持物中加入牛血清白蛋白，得到干细胞筛选系统。优选的，所述纤维连接蛋白溶液的浓度为5 μ g/mL 20μ g/mL。优选的，所述孵育的温度为0°C 5°C，所述孵育的时间为IOh以上。本发明还提供了一种干细胞的筛选方法，包括以下步骤a)提供软骨终板细胞重悬液；b)将所述软骨终板细胞重悬液加入到权利要求1 5任意一项所述的干细胞筛选系统中进行孵育，得到干细胞。优选的，所述步骤b)中，所述软骨终板细胞终浓度为200个细胞/cm2 600个细胞 /cm2。优选的，所述步骤b)中，所述孵育的温度为35°C 38°C，所述孵育的时间为 5min 30mino优选的，所述步骤a)具体包括al)用胶原酶将软骨终板进行消化，离心后得到软骨终板细胞团；a2)用DMEM/F12培养液对所述软骨终板细胞团进行重悬，得到软骨终板细胞重悬液。优选的，还包括对所述干细胞进行扩大培养。优选的，采用含有5wt% 20wt%胎牛血清的DMEM/F12培养液对所述干细胞进行扩大培养。与现有技术相比，本发明将纤维连接蛋白溶液加入到固体支持物上进行孵育，得到涂布有纤维连接蛋白的固体支持物；向所述涂布有纤维连接蛋白的固体支持物加入牛血清白蛋白后，得到干细胞筛选系统；将软骨终板细胞重悬液加入到所述干细胞筛选系统中进行孵育，即可筛选、分离得到干细胞。本发明提供的干细胞筛选系统中包括纤维连接蛋白，纤维连接蛋白能够增加干细胞贴壁能力，从而将干细胞与其他细胞分离。本发明提供的筛选方法无需使用大型仪器设备，无需进行相关抗体的标记，流程简单、操作简便、成本较低。本发明提供的筛选方法进行干细胞筛选后，无需进行离心、漂洗等后处理，减少了干细胞受到污染的可能性。另外，通过本发明提供的方法进行筛选后得到的未贴壁细胞悬液还可以继续筛选，从而避免细胞浪费，适于组织取材少、细胞需要量大的干细胞的筛选。实验表明，采用本发明提供的筛选方法对软骨终板干细胞进行筛选后，将得到的干细胞扩大培养2周后，干细胞标志物FGFR3的含量由5%上升至40% ；干细胞标志物 ⑶105的含量由5%上升至85% ；干细胞标志物STR0-1的含量由7%上升至95%。
图1为经过筛选系统筛选后扩大培养2周的细胞形成的克隆团；
图2为经过本筛选系统筛选后扩大培养2周的细胞呈纤维细胞样平行排列生长；图3为本发明实施例软骨终板细胞重悬液在筛选前成杂乱样无规则贴壁生长；图4为筛选前FGFR3的表达量；图5为筛选后FGFR3的表达量图6为筛选前⑶105的表达量；图7为筛选后⑶105的表达量；图8为筛选前STR0-1的表达量；图9为筛选后STR0-1的表达量；图10为筛选前后干细胞表面标记物的百分含量柱状图；图11为本发明实施例提供的干细胞的成骨诱导结果；图12为本发明实施例提供的干细胞的成脂诱导结果；图13为本发明实施例提供的干细胞的成脂诱导油红染色结果；图14为本发明实施例提供的干细胞的成软骨诱导结果；图15为本发明实施例提供的干细胞的成软骨诱导后形成的软骨基质。
具体实施例方式本发明提供了一种干细胞筛选系统，包括固体支持物；涂布在所述固体支持物上的纤维连接蛋白和牛血清白蛋白。本发明还提供了上述技术方案所述的干细胞筛选系统的制备方法，包括以下步骤将纤维连接蛋白与缓冲溶液混合，得到纤维连接蛋白溶液；将所述纤维连接蛋白溶液加入到固体支持物中进行孵育，得到涂布有纤维连接蛋白的固体支持物；向所述涂布有纤维连接蛋白的固体支持物中加入牛血清白蛋白，得到干细胞筛选系统。纤维连接蛋白是一种大分子糖蛋白，具有多种生物活性，广泛存在于动物组织和组织液中。本发明对所述纤维连接蛋白没有特殊限制，可以为从市场上购得的人纤维连接蛋白。 首先将纤维连接蛋白与缓冲溶液混合，得到纤维连接蛋白溶液。在本发明中，所述缓冲溶液优选为含有lmmol/L氯化镁和lmmol/L氯化钙、浓度为lmol/L的磷酸盐缓冲溶液。所述纤维连接蛋白溶液的浓度优选为5 μ g/mL 20 μ g/mL,更优选为10 μ g/mL 15μ g/mL。本领域技术人员可以根据所要筛选的干细胞的特点选取合适的纤维连接蛋白溶液浓度，浓度越大，筛选需要的时间越短，但是筛选得到的干细胞纯度会受到影响。
得到纤维连接蛋白溶液后，将其过滤消毒后加入到固体支持物中进行孵育。在孵育过程中，纤维连接蛋白能够粘附在固体支持物表面。在本发明中，所述固体支持物可以为玻璃或者塑料材质的培养瓶、培养皿等。所述纤维连接蛋白在所述固体支持物表面进行孵育的温度优选为0°c 5°C，更优选为4°C ；所述孵育的时间优选为IOh以上，更优选为 12h 24h。
孵育完成后，除去所述固体支持物中的溶液后，得到涂布有纤维连接蛋白的固体支持物。除掉的溶液中含有纤维连接蛋白，将该溶液回收后可以反复利用，能够节约试剂、 降低成本。向所述涂布有纤维连接蛋白的固体支持物中加入牛血清白蛋白，牛血清白蛋白将纤维连接蛋白的非特异性结合位点阻断后，即可得到干细胞筛选系统。本发明优选向所述固体支持物中加入牛血清白蛋白溶液，所述牛血清白蛋白溶液的浓度优选为0. 5% 3%。在本发明提供的干细胞筛选系统中，纤维连接蛋白涂布于所述固体支持物上，牛血清白蛋白将纤维连接蛋白的非特异性结合位点阻断，使所述干细胞筛选系统筛选得到的干细胞纯度更好。本发明还提供了一种干细胞的筛选方法，包括以下步骤a)提供软骨终板细胞重悬液；b)将所述软骨终板细胞重悬液加入到权利要求1 5任意一项所述的干细胞筛选系统中进行孵育，得到干细胞。本发明采用上述技术方案提供的筛选系统对软骨终板细胞重悬液进行筛选，得到干细胞。按照本发明，所述软骨终板细胞重悬液优选按照以下方法制备用胶原酶将软骨终板进行消化，离心后得到软骨终板细胞团；用DMEM/F12培养液对所述软骨终板细胞团进行重悬，得到软骨终板细胞重悬液。本发明采用临床获取的退变的椎间盘软骨终板，首先用0. 01mol/L的PBS清洗， 将其裁剪为碎块，所述碎块优选为Imm3 ；然后用胶原酶将所述软骨终板碎块进行消化，将得到的消化液过滤、离心后得到软骨终板细胞团。本发明优选以II型胶原酶对所述软骨终板进行消化，进行消化的温度优选为35°C 38°C，时间优选为IOh Mh ；本发明优选以150 目 250目的筛网对所述消化液进行过滤以减少细胞粘连；本发明优选以800转/IOmin 1200转/IOmin的转速对经过过滤后的消化液进行离心，弃去上清液后，得到软骨终板细胞团。采用DMEM/F12培养液对所述软骨终板细胞进行重悬，得到软骨终板细胞重悬液。 本发明优选采用不含血清的DMEM/F12培养液对所述软骨终板细胞进行重悬。得到软骨终板细胞重悬液后，将所述软骨终板细胞重悬液加入到上述技术方案所述的干细胞筛选系统中进行孵育，所述软骨终板细胞重悬液中的干细胞在纤维连接蛋白的作用下贴壁，从而实现与其他细胞的分离。按照本发明，将所述软骨终板细胞重悬液加入到所述干细胞筛选系统中厚，所述软骨终板细胞的终浓度优选为200个细胞/cm2 600个细胞/cm2，更优选为250个细胞/ cm2 550个细胞/cm2，最优选为300个细胞/cm2 500个细胞/cm2。按照本发明，所述软骨终板细胞重悬液在所述干细胞筛选系统中进行孵育的温度优选为35°C 38°C，更优选为37°C ；时间优选为5min 30min，更优选为IOmin 25min。 在进行孵育的过程中，根据细胞特点以及所需要的干细胞纯度要求，可以在倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，从而调整合适的孵育时间。实验表明，孵育时间短，贴壁的干细胞纯度较高，时间长时，贴壁的干细胞纯度会下降。软骨终板细胞重悬液在所述筛选系统中进行孵育的过程中，干细胞在纤维连接蛋
6白的作用下贴壁，从而实现与其他细胞的分离。孵育完毕后，除去筛选系统中的液体后，即可得到干细胞。在本发明中，除掉的液体为未贴壁细胞的悬液，可将所述悬液加入到所述干细胞筛选系统中再次筛选，减少细胞浪费。得到干细胞后，本发明优选还包括对所述干细胞进行扩大培养，即将所述干细胞置于培养液中进行培养。本发明优选采用含有5wt% 20wt%胎牛血清的DMEM/F12培养液对所述干细胞进行扩大培养，所述扩大培养的温度优选为35°C 38°C，更优选为37°C。扩大培养两周后，对得到的干细胞进行鉴定和分析，结果表明，本发明提供的筛选方法筛选得到的干细胞能够形成克隆团，且细胞呈纤维细胞样平行排列生长；采用流式分选法对所述扩大培养两周后的干细胞进行分析，结果表明，干细胞标志物FGFR3的含量由5%上升至40%;干细胞标志物⑶105的含量由5%上升至85% ；干细胞标志物STR0-1的含量由7%上升至95% ；对所述扩大培养两周后的干细胞分别进行成骨诱导、成脂诱导和成软骨诱导，结果表明，所述干细胞能够形成钙结节，也能够形成脂滴和软骨基质，说明本发明筛选得到了干细胞。与现有技术相比，本发明将纤维连接蛋白溶液加入到固体支持物上进行孵育，得到涂布有纤维连接蛋白的固体支持物；向所述涂布有纤维连接蛋白的固体支持物加入牛血清白蛋白后，得到干细胞筛选系统；将软骨终板细胞重悬液加入到所述干细胞筛选系统中进行孵育，即可筛选、分离得到干细胞。本发明提供的干细胞筛选系统中包括纤维连接蛋白，纤维连接蛋白能够增加干细胞贴壁能力，从而将干细胞与其他细胞分离。本发明提供的筛选方法无需使用大型仪器设备，无需进行相关抗体的标记，流程简单、操作简便、成本较低。本发明提供的筛选方法进行干细胞筛选后，无需进行离心、漂洗等后处理，减少了干细胞收到污染的可能性。另外，通过本发明提供的方法进行筛选后得到的未贴壁细胞悬液还可以继续筛选，从而避免细胞浪费，适于组织取材少、细胞需要量大的干细胞的筛选。为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的干细胞筛选系统、其制备方法及干细胞的筛选方法进行详细描述。以下各实施例中所用原料均为从市场上购得。实施例1用含有ImMMgCljn ImMCaCl2的0. 1M/L磷酸盐缓冲液(PBS)稀释人纤维连接蛋白， 得到10 μ g/mL的纤维连接蛋白溶液，过滤消毒后于-20°C保存；筛选前一天，将所述纤维连接蛋白溶液解冻后加入到细胞培养瓶中，均勻覆盖细胞培养瓶底，4°C过夜孵育；筛选当天， 将细胞培养瓶内的纤维连接蛋白溶液回收后，加入的牛血清白蛋白(BSA)溶液再次覆盖细胞培养瓶，常温放置5min，得到干细胞筛选系统。实施例2将临床获取的退变的椎间盘软骨终板用0. 01M/L的PBS清洗3次后剪成Imm3大小的碎块，用0. 2% II型胶原酶37°C下过夜进行消化；用200目的筛网将得到的消化液过滤， 1000转/IOmin离心后，弃去上清液，得到软骨终板细胞团；用不含血清的DMEM/F12培养液将所述软骨终板细胞团进行重悬，得到软骨终板细胞重悬液；将所述软骨终板细胞悬液加入到实施例1制备的筛选系统中，每25cm2培养瓶中放置IO4个细胞，于37°C 5% CO2温箱中孵育IOmin ；回收细胞培养瓶中的液体，然后向所述细胞培养瓶中加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，于37°C 5% CO2温箱中扩大培养 2周，得到干细胞。对所述扩大培养2周后得到的细胞进行显微观察，结果参见图1、图2和图3，图1 为经过筛选系统筛选后扩大培养2周的细胞形成的克隆团，由图1可知，该细胞克隆团中细胞形态比较均一，呈纤维细胞样；图2为经过筛选系统筛选后扩大培养2周的细胞呈纤维细胞样平行排列生长，由图2可知，该细胞呈纤维细胞样平行排列生长，并呈现漩涡状，细胞的形态大小比较规则；图3为软骨终板细胞重悬液在筛选前呈杂乱样无规则贴壁生长，由图3可知，筛选前，软骨终板细胞呈杂乱样无规则贴壁生长，贴壁细胞呈现多种形态，如纤维细胞样、多角形、短棒型等。由图1、图2和图3可知，筛选前，细胞呈杂乱样贴壁生长，并且未形成克隆团；蹄选后的细胞扩大培养后形成了克隆团，并且细胞呈纤维细胞样平行排列生长。采用流式细胞仪(FACS)检测干细胞表面标记物表达量，结果参见图4、图5、图6、 图7、图8、图9和图10，图4为筛选前FGFR3的表达量，其中，曲线41为同型对照，曲线42 为FGFR3标记的阳性细胞百分数；图5为筛选后FGFR3的表达量，其中，曲线51为同型对照， 曲线52为FGFR标记的阳性细胞百分数；图6为筛选前⑶105的表达量，其中，曲线61为同型对照，曲线62为⑶105标记的阳性细胞百分数；图7为筛选后⑶105的表达量，其中， 曲线71为同型对照，曲线72为CD105标记的阳性细胞百分数；图8为筛选前STR0-1的表达量，其中，曲线81为同型对照，曲线82为STR0-1标记的阳性细胞百分数；图9为筛选后 STR0-1的表达量，其中，曲线91为同型对照，曲线92为STR0-1标记的阳性细胞百分数；图 10为筛选前后干细胞表面标记物的百分含量柱状图，其中，101为筛选前FGFR3的含量，102 为筛选后FGFR3的含量，103为筛选前⑶105的含量，104为筛选后⑶105的含量，105为筛选前STR0-1的含量，106为筛选后STR0-1的含量。由图4、图5、图6、图7、图8、图9和图10可知，采用本发明提供的方法进行筛选后，干细胞表面标记物百分含量有明显提高，说明本发明提供的方法筛选得到了干细胞。将扩大培养两周后的干细胞在成骨诱导液中诱导21天，所述成骨诱导液包括 10 %胎牛血清、10nmol/L地塞米松、IOmmol β -甘油磷酸和0. ImmolL-抗坏血酸-2-磷酸酯；在进行诱导过程中，每周换液2次，3周后进行茜素红染色，结果参见图11，图11为本发明实施例提供的干细胞的成骨诱导结果，由图11可见块状矿化结节，该矿化结节可被茜素红染色为红色结节。可见，所述扩大培养两周后的干细胞在成骨诱导液中诱导21天后形成了红染的矿化结节，即该细胞可成功诱导成骨。将扩大培养两周后的干细胞在成脂诱导液中诱导72h，所述成脂诱导液包括 10 μ g/mL胰岛素、1 μ mol地塞米松、500 μ moIIBMX和IOOmol吲哚美辛，然后在维持液中诱导Mh，所述维持液为含有10%胎牛血清和 ομ g/mL胰岛素的DMEM/F12培养液；处理周期循环3次，最后在维持液中培养至3周，然后在倒置显微镜下观察脂滴形成情况，结果参见图12，图12为本发明实施例提供的干细胞的成脂诱导结果，其中的球形空泡为干细胞经成脂诱导后形成的脂肪滴；对得到的培养物进行油红0染色，结果参见图13，图13为本发明实施例提供的干细胞的成脂诱导油红染色结果，由图13可知，经过成脂诱导后形成的球形空泡可被染成红色。由图12和图13可知，所述扩大培养两周后的干细胞经过成脂诱导后， 细胞内有脂滴形成，即该细胞可成功诱导成脂。
采用micromass法进行成软骨诱导，具体操作如下将干细胞重悬，得到IO7个细胞/mL的干细胞重悬液；将50 μ L干细胞重悬液在培养皿中心静置池，然后加入到成软骨诱导液中诱导21天，所述成软骨诱导液含有lOng/mLTGF-β 3、10_7mol/L地塞米松、50μ g/ mL抗坏血酸、40μ g/mL脯氨酸、100μ g/mL丙酮酸和1 100dilutedITS+Premix的低糖 DMEM ；在诱导过程中，每周换液两次，三周后进行阿利新蓝染色，结果参见图14和图15，图 14为本发明实施例提供的干细胞的成软骨诱导结果，在成软骨诱导过程中，细胞逐渐聚集呈球形，并脱离培养皿壁，呈漂浮生长，且外观有光泽，经过阿新蓝染色后可被染成蓝色；图 15为本发明实施例提供的干细胞的成软骨诱导后形成的软骨基质，其可被阿新蓝染色。由图14和图15可知，所述扩大培养两周后的干细胞在成软骨诱导液中诱导21天后，细胞呈球形离壁漂浮生长并有软骨基质形成，即该细胞可成功诱导成软骨。由图11、图12、图13、图14和图15可知，本发明提供的筛选方法得到的干细胞经过扩大培养后能够诱导成骨、诱导成脂、诱导成软骨，说明通过本发明提供的方法筛选得到了干细胞。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种干细胞筛选系统，包括 固体支持物；涂布在所述固体支持物上的纤维连接蛋白和牛血清白蛋白。
2.权利要求1所述的干细胞筛选系统的制备方法，包括以下步骤 将纤维连接蛋白与缓冲溶液混合，得到纤维连接蛋白溶液；将所述纤维连接蛋白溶液加入到固体支持物中进行孵育，得到涂布有纤维连接蛋白的固体支持物；向所述涂布有纤维连接蛋白的固体支持物中加入牛血清白蛋白，得到干细胞筛选系统。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述纤维连接蛋白溶液的浓度为 5 μ g/mL 20 μ g/mL。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述孵育的温度为0°C 5°C，所述孵育的时间为IOh以上。
5.一种干细胞的筛选方法，包括以下步骤a)提供软骨终板细胞重悬液；b)将所述软骨终板细胞重悬液加入到权利要求1 5任意一项所述的干细胞筛选系统中进行孵育，得到干细胞。
6.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤b)中，所述软骨终板细胞终浓度为200个细胞/cm2 600个细胞/cm2。
7.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤b)中，所述孵育的温度为 35°C 38°C，所述孵育的时间为5min 30min。
8.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤a)具体包括 al)用胶原酶将软骨终板进行消化，离心后得到软骨终板细胞团；a2)用DMEM/F12培养液对所述软骨终板细胞团进行重悬，得到软骨终板细胞重悬液。
9.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于，还包括 对所述干细胞进行扩大培养。
10.根据权利要求9所述的筛选方法，其特征在于，采用含有5wt% 20wt%胎牛血清的DMEM/F12培养液对所述干细胞进行扩大培养。
全文摘要
本发明提供了一种干细胞筛选系统，包括固体支持物；涂布在所述固体支持物上的纤维连接蛋白和牛血清白蛋白。本发明还提供了一种上述技术方案所述的干细胞筛选系统的制备方法。本发明还提供了一种干细胞的筛选方法，包括以下步骤a)提供软骨终板细胞重悬液；b)将所述软骨终板细胞重悬液加入到上述技术方案所述的干细胞筛选系统中进行孵育，得到干细胞。本发明提供的筛选方法无需使用大型仪器设备，无需进行相关抗体的标记，流程简单、操作简便、成本较低。本发明提供的筛选方法进行干细胞筛选后，无需进行离心、漂洗等后处理，减少了干细胞受到污染的可能性。
文档编号C12M1/00GK102212460SQ201110106899
公开日2011年10月12日 申请日期2011年4月27日 优先权日2011年4月27日
发明者刘兰涛, 周跃, 李长青, 熊承杰, 黄博 申请人:中国人民解放军第三军医大学第二附属医院