专利名称：用于检测ndm-1基因的lamp试剂盒及其专用引物的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域中细菌的分子生物学检测方法，特别是涉及一种NDM-I 基因的LAMP试剂盒及其专用引物与其在检测NDM-I基因中的应用。
背景技术：
在世界卫生组织宣布甲型Hmi流感大流行结束的第2天，也就是2010年 8月11日，英国卡迪夫大学、英国健康保护署和印度马德拉斯大学的31位医学研究者在世界医学权威杂志《Lancet》发表了题目为《Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in India, Pakistan, and the UK :a molecular, biological, and epidemiological study))的论文。论文提到，在印度金奈市和哈利那亚邦分别确诊了 44 例36例感染了 NDM-I细菌的患者，还有英国的37例以及印度和巴基斯坦其它地域的73例 NDM-I细菌患者。携带NDM-I基因的细菌，能够对包括广谱抗生素碳青霉烯类在内的几乎所有的抗生素产生耐药性。论文还警告说，“NDM-1成为全球公共卫生问题的可能性极高”。 紧接着，在美国、加拿大、瑞典、希腊、以色列、荷兰、日本、巴西、香港、台湾等国家和地区也相继发现这类“超级细菌”的感染者，2010年10月沈日中国疾病预防控制中心和军事医学科学院也同时宣布在中国内地的宁夏和福建分别发现这类“超级细菌”。日前全球感染这类 “超级细菌”的病人已达170多例，感染的人数还在进一步增加。环介导的等温核酸扩增技术(LAMP)是由Τ· Notomi (Notomi Τ, Okayama H, MasubuchiH, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res 2000；28(12) :63.)发明的一种新型核酸扩增技术，该技术依赖4条特异设计的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可以高效、快速、高特异地扩增靶序列。 近年来，国外已将该技术广泛应用于病原体检测。Masaki Imai等人(Imai M, Ninomiya A, Minekawa H, et al. Rapid diagnosis of H5Nlavian influenza virus infection by newly developed influenza H5hemagglutinin gene-specific loop-mediated isothermal amplification method. J Virol Methods. 2007 ； 141 (2) :173-80.)利用 LAMP建立了禽流感病毒的实验室确诊体系；Nobuyuki Hayashi等人(Hayashi N, Arai R, Tada S, Taguchi H, Ogawa Y.Detection and identification of Brettanomyces/ Dekkera sp.yeasts with a loop-mediated isothermal amplification method. Food Microbiol. 2007 ；24 (7-8) :778-85.)针对四种香酒酵母的ITS序列设计了 LAMP特异性引物，建立了高效的LAMP检测体系。LAMP还可以检测其它与人类相关的病毒，如病毒性出血性败血病(VHS)、巨细胞病毒(CMV)、埃博拉病毒(EBOV)、慢性伯基特淋巴瘤病毒(EBV)Jl 彩病毒、人类疮疹病毒8型、造血组织坏死病毒(工HHNV)、番茄斑萎病毒、番茄黄化曲叶病毒等。目前，国内外均未见有用于检测NDM-I基因的LAMP试剂盒及其在NDM-I检测中的应用
发明内容
本发明提供了用于对NDM-I基因进行LAMP检测的引物，以实现NDM-I基因的批量检测，提高检测的特异性和灵敏度。本发明所提供的用于对NDM-I基因进行LAMP检测的引物，是根据NDM-I基因特异性的保守靶序列设计的，用以定性检测纯菌、痰液、尿液、粪便等样品中的NDM-I基因；所述 NDM-I基因特异性的保守靶序列如序列表中SEQ ID NO 7所示。具体来讲，所述用于对NDM-I基因进行LAMP检测的六条引物的核苷酸序列如序列表中 SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5 禾口 SEQ ID NO: 6所示。本发明的第二个目的是提供一种NDM-I基因的LAMP检测方法。本发明所提供检测方法，可包括以下步骤1)以待测物的基因组DNA为模板，在上述引物的引导下进行LAMP扩增；2)反应结束后进行结果判定在反应液中添加羟基萘酚兰(HNB)，根据反应液的颜色变化判断结果，天蓝色表示待测样品中存在NDM-I基因，紫色表示待测样品中不存在 NDM-I基因；或者不添加HNB直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果，浊度上升表示待测样品中存在NDM-I基因，浊度无变化表示待测样品中不存在NDM-I基因。
在上述NDM-I基因的LAMP检测方法中，所述步骤1)中的25ul LAMP反应体系可包括待测物的基因组DNA 2 μ l,20mM Tris 'HCl (pH 8. 8), IOmM KCl，IOmM(NH4)2S04，0. 1% Tween20，0. 8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO4，1. 4mM dNTP each，8U Bst DNA polymerase,弓丨物加入量为:40pmol SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :2 所示引物，20pmol SEQ ID NO :3 和 SEQ ID NO 4 所示引物，5pmol SEQ ID NO :5 和 SEQ ID NO :6 所示引物。所述步骤1)中的LAMP扩增条件可为置60-65°C恒温45-55min (优选50min)。所述步骤2)中羟基萘酚兰的添加量可为1. 25 μ 1 (终反应体系为26. 25 μ 1)，浓度为 2. 4mmol/L。本发明的第三个目的是提供一种用于对NDM-I基因进行LAMP检测的试剂盒。本发明所提供的试剂盒，包括上述用于对NDM-I基因进行LAMP检测的引物。为方便检测，所述试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含 NDM-I基因的NDM-I细菌的DNA，所述阴性对照为不含DNA的LAMP扩增体系(如双蒸水)。本发明提供了一种NDM-I基因的LAMP检测方法及其专用引物与试剂盒。本发明具有以下优点1)高特异性6条引物对NDM-I基因靶序列的8个特异区域的识别保证了 LAMP扩增的高度特异性，即LAMP能从相差仅一个核昔酸的基因标本中找出相应的靶序列进行扩增；2)高灵敏度灵敏度比普通PCR高100倍；3)结果鉴定简便可通过肉眼观察结果(HNB显色)，也可以直接用浊度仪判断结果；4)操作简单只要将检测样品(靶核酸)和检测试剂一起放入60_65°C恒温水浴锅中45分钟后就可以判断结果；5)快速、高效扩增整个LAMP扩增反应一小时内即可完成，且产率可达到0. 5mg/
mLo
综上所述，本发明可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到 NDM-I基因，不需要复杂仪器，为“超级细菌”的检测提供了新的技术平台，可用于基层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心筛查和检测“超级细菌”，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为HNB染色判定本发明NDM-I基因的LAMP检测结果图2为浊度仪判定本发明NDM-I基因的LAMP检测结果(不同曲线对应的样品稀释度不同)图3不同的反应时间和反应温度对LAMP反应的影响图4为本发明NDM-I基因的LAMP检测方法的特异性检测结果图5为本发明NDM-I基因的LAMP检测方法的灵敏度检测结果
具体实施例方式实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1、用于对NDM-I基因进行LAMP检测的引物设计从美国基因数据库检索获得NDM-I基因序列(GenBank号FN396876. 1)，通过 BLAST软件进行同源性分析，获得NDM-I基因的特异性保守靶序列(序列表中SEQ ID NO 7)，再根据该保守靶DNA序列，用软件I^rimer design V4设计用于对NDM-I基因进行LAMP 检测的引物，引物序列如下FIP :CTGGCGGTGGTGACTCACGTTTTGCATGCAGCGCGTCCA (针对 NDM-I 基因靴序列的自 5’端第411-4 位碱基的特异区域与NDM-I基因靶序列的自5’端第451-469位碱基的特异区域设计，序列表中SEQ ID NO 1)；BIP :CGCGACCGGCAGGTTGATCTTTTGGTCGATACCGCCTGGAC (针对 NDM-I 基因靴序列的自5’端第470-488位碱基的特异区域与NDM-I基因靶序列的自5’端第531-548位碱基的特异区域设计，序列表中SEQ ID NO 2)；LF GCATCAGGACAAGATGGGC(针对 NDM-1 基因靶序列的自 5，端第 431-449 位碱基的特异区域设计，序列表中SEQ ID NO 3)；LB :TCCAGTTGAGGATCTGGG (针对NDM-I基因靴序列的自5，端第499-516位碱基的特异区域设计，序列表中SEQ ID NO 4)；F3 GCATAAGTCGCAATCCCCG(针对 NDM-I 基因靴序列的自 5，端第 390-408 位碱基的特异区域设计，序列表中SEQ ID NO 5)；B3 GGTTTGATCGTCAGGGATGG (针对 NDM-I 基因靴序列的自 5，端第 564-583 位碱基的特异区域设计，序列表中SEQ ID NO 6)。实施例2、本发明NDM-I基因的LAMP检测方法的建立用实施例1获得的用于对NDM-I基因进行LAMP检测的六条引物对含NDM-I基因的鲍曼不动杆菌(来自中国人民解放军疾病预防控制所传染病控制中心)进行LAMP检测， 以获得最佳反应体系及反应条件，具体方法如下一、最佳反应体系的确定在相同反应条件(置63°C恒温50min)下，在反应体系中添加不同浓度的Mg2+，以确定最佳反应体系，包括以下步骤1)以含NDM-I基因的鲍曼不动杆菌的基因组DNA (用Promega的Wizard Genomic DNA purification Kit商品化DNA提取试剂盒提取待测样品中的核酸)为模板，在实施例 1获得的六条引物的引导下进行LAMP扩增，其中，25ul LAMP反应体系包括含NDM-I基因的鲍曼不动杆菌的基因组 DNA 2 μ l,20mM Tris · HCl (pH 8. 8), IOmM KCl, IOmM(NH4)2SO4, 0. 1 % Tween20,0. 8M 甜菜碱(betaine)，分别添力卩 ^nM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、IOmM) MgSO4,1. 4mM dNTP each，8U Bst DNA polymerase (购自 NEB 公司)，加入的引物量为 40pmol FIP和BIP，20pmol LF和LB，5pmolF3和B3 ；反应条件为置63 °C恒温水浴锅中 50mino2)反应结束后进行结果判定在反应液中添加1.25μ1(终反应体系为 26. 25 μ 1) 2. 4mmol/L的羟基萘酚兰(HNB)，根据反应液的颜色变化判断结果(原理羟基萘酚兰是金属离子指示剂，能指示反应液中Mg2+的变化。)，天蓝色表示待测样品中存在NDM-I 基因(阳性)，紫色表示待测样品中不存在NDM-I基因(阴性)，参见图1，左侧试管显示天蓝色，右侧试管显示紫色；或者不添加HNB直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果(原理LAMP反应的过程中会产生焦磷酸镁，焦磷酸镁是一种白色沉淀，浊度仪可以根据浊度的变化来判断LAMP反应)，浊度上升表示待测样品中存在NDM-I基因(阳性， 参见图2中向上一组6条曲线)，浊度无变化表示待测样品中不存在NDM-I基因(阴性，参见图2中水平一组2条曲线)。判定结果，在IOmM Mg2+浓度下，反应结果最好，故将本发明最佳的NDM-1基因的 LAMP 检测体系定为 Q5ul)待测物的基因组 DNA 2 μ l,20mM Tris · HCl (pH 8. 8), IOmM KCl，IOmM (NH4)2SO4,0· Tween20，0· 8M 甜菜碱(betaine)，8mM MgSO4,1. 4mM dNTP each, 8U Bst DNA polymerase，加入的引物量为:40pmol FIP 和 BIP，20pmol LF 禾口 LB，5pmol F3 禾口 B30二、最佳反应条件的确定在步骤一确定的相同的反应体系下，在不同反应条件下对含NDM-I基因的鲍曼不动杆菌的基因组DNA进行LAMP检测，以确定最佳反应条件，包括以下步骤1)以含NDM-I基因的鲍曼不动杆菌的基因组DNA为模板，在实施例1获得的六条引物的引导下进行LAMP扩增，其中，25ul LAMP反应体系包括含NDM-I基因的鲍曼不动杆菌的基因组 DNA 2 μ 1, 20mM Tris · HCl (pH 8. 8), IOmM KCl, IOmM(NH4)2S04,0. 1% Tween20, 0· 8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO4,1. 4mM dNTP each，8U Bst DNA polymerase，力口入的引物量为:40pmol FIP 和 BIP，20pmol LF 禾口 LB，5pmolF3 禾口 B3 ；分别在不同温度(45°C、46. 8°C、 49. 9°C>54. 3°C>60. 3°C>65. 0°C>68. 1°C、70°C )和反应时间(15min、25min、35min、45min、 55min、65min、75min)下反应。2)结果判定方法同步骤一。反应结束后，对LAMP扩增产物进行2%琼脂糖凝胶检测，结果如图3所示(泳道M表示DNA MARKER D2000,泳道1至泳道7显示在63°C下反应结果，泳道1表示反应15分钟后产物电泳图，泳道2表示反应25分钟后产物电泳图，泳道3表示反应35分钟后产物电泳图，泳道4表示反应45分钟后产物电泳图，泳道5表示反应55分钟后产物电泳图，泳道 6表示反应65分钟后产物电泳图，泳道7表示反应75分钟后产物电泳图，表明反应45分钟以后均获得明显的电泳图，超过45分钟后产物量增加不明显，因此反应时间控制在45分钟-55分钟范围内比较合适，实验中选50分钟；泳道8表示45°C反应50分钟后产物电泳图，泳道9表示46. 8V反应50分钟后产物电泳图，泳道10表示49. 9°C反应50分钟后产物电泳图，泳道11表示54. 3°C反应50分钟后产物电泳图，泳道12表示60V反应50分钟后产物电泳图，泳道13表示65°C反应50分钟后产物电泳图，泳道14表示68. 1°C反应50分钟后产物电泳图，泳道15表示70°C反应50分钟后产物电泳图)，在60-65°C恒温50min下， 反应结果最好，实验中可选该范围内容的任一数值；故将最佳的本发明NDM-I基因的LAMP 反应条件定为置60-65°C恒温反应45-55min，优选50min。实施例3、本发明NDM-I基因的LAMP检测方法的特异性、灵敏性检测一、本发明NDM-I基因的LAMP检测方法的特异性检测分别以两株含NDM-I基因的鲍曼不动杆菌、四株不含NDM-I基因的鲍曼不动杆菌、 含NDM-I基因的嗜麦芽寡养单胞菌、两株不含NDM-I基因的嗜麦芽寡养单胞菌、宋内志贺氏菌、福氏致贺氏菌、肠炎沙门氏菌、沙鱼弧菌、甲型副伤寒沙门氏菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌和副溶血弧菌(所有菌株均来自中国人民解放军疾病预防控制所传染病控制中心)的基因组DNA为模板，以双蒸水为阴性对照，检测实施例2获得的最佳的NDM-I基因的LAMP检测方法的特异性。反应结束后，对LAMP扩增产物进行2 %琼脂糖凝胶检测，检测结果如图4所示(M， DNA marker D2000;l，阴性对照(双蒸水)；2和10，两株含NDM-I基因的鲍曼不动杆菌；3、 4、5、6，四株不含NDM-I基因的鲍曼不动杆菌；7，含NDM-I基因的嗜麦芽寡养单胞菌；8、9， 两株不含NDM-I基因的嗜麦芽寡养单胞菌；11，宋内志贺氏菌；12，福氏致贺氏菌；13，肠炎沙门氏菌；14，沙鱼弧菌；15，甲型副伤寒沙门氏菌；16，肠侵袭性大肠杆菌；17，肠产毒性大肠杆菌；18，肠产毒性大肠杆菌；19，副溶血弧菌)，含NDM-I基因的鲍曼不动杆菌和嗜麦芽寡养单胞菌中检测到了特异性的LAMP条带，其余不含NDM-I基因的菌株均未检测到特异性的LAMP条带，与用实施例2步骤一中的羟基萘酚兰(HNB)染色方法及浊度仪检测方法的结果一致，表明本发明的NDM-I基因的LAMP检测方法具有较高的特异性，可以在众多细菌中特异性地检测到NDM-I基因。二、本发明NDM-I基因的LAMP检测方法的灵敏度检测检测本发明LAMP检测方法与普通PCR方法检测NDM-I基因的灵敏度，方法为提取含NDM-I基因的鲍曼不动杆菌总DNA，然后以10倍梯度(1倍、10倍、IO2倍、IO3倍、IO4倍、 IO5倍、IO6倍、IO7倍)进行稀释，再以经梯度稀释的DNA为模板，分别用本发明的LAMP检测方法与普通PCR方法(引物序列为CAGCACACTTCCTATCTC和CCGCAACCATCCCCTCTT)进行灵敏度检测。反应结束后，对扩增产物进行2%琼脂糖凝胶检测，检测结果如图5所示(A =LAMP 的灵敏度检测结果。B:普通PCR的灵敏度检测结果。1，1倍稀释；2，10倍稀释；3，IO2倍稀释；4，IO3倍稀释；5，IO4倍稀释；6，IO5倍稀释；7，IO6倍稀释；8，IO7倍稀释)，本发明NDM-I基因的LAMP检测方法可检测到IO5倍稀释浓度，而普通PCR方法仅能检测到IO3倍稀释浓度，与用实施例2步骤一中的羟基萘酚兰(HNB)染色方法及浊度仪检测方法的结果一致，表明本发明NDM-I基因的LAMP检测法比普通PCR检测方法的灵敏度高100倍。实施例4、用于NDM-I基因的LAMP检测的试剂盒将20mM Tris · HCl (pH 8. 8), IOmM KCl, IOmM(NH4)2SO4jO. 1% Tween20，0· 8M 甜菜碱(betaine)，8mM MgSO4,1. 4mM dNTP each，8U Bst DNA polymerase，弓|物40pmol FIP 禾口 BIP, 20pmol LF和LB，5pmol F3和B3，以及作为阳性对照的含NDM-1基因的鲍曼不动杆菌的基因组DNA 2 μ 1，作为阴性对照的不含DNA的LAMP扩增体系(双蒸水)共同包装，得到用于NDM-I基因的LAMP检测的试剂盒。
权利要求
1.用于对NDM-I基因进行LAMP检测的引物，是根据NDM-I基因特异性的保守靶序列设计的，用以定性检测纯菌、痰液、尿液、粪便样品中的NDM-I基因；所述NDM-I基因特异性的保守靶序列具有序列表中SEQ ID NO :7所示序列。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于所述用于对NDM-I基因进行LAMP检测的六条引物的核苷酸序列具有序列表中SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO 6 所示序列。
3.一种NDM-I基因的LAMP检测方法，包括以下步骤1)以待测物的基因组DNA为模板，在权利要求1或2所述引物的引导下进行LAMP扩增；2)反应结束后进行结果判定在反应液中添加羟基萘酚兰(HNB)，根据反应液的颜色变化判断结果，天蓝色表示待测样品中存在NDM-I基因，紫色表示待测样品中不存在NDM-I 基因；或者不添加HNB直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果，浊度上升表示待测样品中存在NDM-I基因，浊度无变化表示待测样品中不存在NDM-I基因。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于所述步骤1)中的25ulLAMP反应体系包括待测物的基因组 DNA 2 μ 1，20mM Tris · HCl (pH 8. 8)，IOmM KCl，IOmM(NH4)2SO4, 0.1 % Tween20，0. 8M 甜菜碱(betaine)，8mM MgSO4,1. 4mM dNTPeach，8U Bst DNA polymerase，引物加入量为40pmol SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :2 所示引物，20pmol SEQ ID NO :3 禾口 SEQ ID NO :4 所示引物，5pmol SEQ ID NO :5 禾口 SEQ ID NO :6 所示引物。
5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于所述步骤1)中的LAMP扩增条件为 置 60-65°C恒温 45-55min，优选 50min。
6.根据权利要求3或4或5所述的检测方法，其特征在于所述步骤2~)中羟基萘酚兰的添加量为1. 25 μ 1 (终反应体系为26. 25 μ 1)，浓度为2. 4mmol/L。
7.一种用于对NDM-I基因进行LAMP检测的试剂盒，包括权利要求1或2所述用于对 NDM-1基因进行LAMP检测的引物。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含NDM-I基因的NDM-I细菌的DNA，所述阴性对照为不含DNA的LAMP 扩增体系。
9.权利要求1或2所述的引物在NDM-I基因的LAMP检测中的应用。
10.权利要求7或8所述的试剂盒在NDM-I基因的LAMP检测中的应用。
全文摘要
本发明公开了用于检测NDM-1基因的LAMP试剂盒及其专用引物。用于对NDM-1基因进行LAMP检测的引物是根据NDM-1基因特异性的保守靶序列设计的，用以定性检测纯菌、痰液、尿液、粪便样品中的NDM-1基因。所述用于对NDM-1基因进行LAMP检测的六条引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所示。本发明可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到NDM-1基因，不需要复杂仪器，为“超级细菌”的检测提供了新的技术平台，可用于基层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心筛查和检测“超级细菌”，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。
文档编号C12N15/11GK102242197SQ20111012978
公开日2011年11月16日 申请日期2011年5月19日 优先权日2011年5月19日
发明者刘威, 袁静, 黄留玉 申请人:中国人民解放军疾病预防控制所