专利名称：复合微生物饲料添加剂的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种复合微生物饲料添加剂的制备方法及其应用，属于微生物工程技术领域。
背景技术：
随着社会的进步和人们生活水平的提高，食品安全问题近年来越来越引起人们的关注。特别是2008年在三鹿等奶粉中发现有三聚氰胺，后来又在鸡蛋中检出含有三聚氰胺，食品的安全更加令人担忧。通过跟踪调查发现，食品中的三聚氰胺除了人为添加的以外，还有的是动物食用了含有三聚氰胺的饲料而引起的。因此，食品的安全首先要从饲料安全抓起。在我国，长期以来，在畜牧、水产养殖过程中，一直依赖在饲料中添加抗菌素来防治动物疾病。在市场上出售的饲料中，几乎都是添加了抗菌素的，在整个养殖过程中，动物都是吃含有抗菌素的饲料长大，大量的抗菌素畜积在动物体内，通过餐桌，这些抗菌素又在人体内富集，这将对人体造成极大的伤害①容易产生耐药性，抗菌素在体内长期存在，会导致体内某些细菌产生耐药性，从而给预防和治疗某些细菌性疾病带来了困难。细菌越来越耐药，抗菌素越来越失效已成为全球性的普遍问题；②影响人体内微生态平衡抗菌素会同时杀灭体内的病原微生物和有益菌，造成体内的微生态平衡失调，导致人体代谢功能紊乱，可能引起各种消化道疾病，如慢性腹泻、急性肠炎等。随着人们对饲料中滥用抗菌素危害性的逐渐认识，世界上许多国家纷纷禁止在饲料中使用抗生素，饲料安全即食品安全的概念在世界范围内已成为共识。在美国，食品和饲料是同一概念，适用于同一法律。丹麦政府为了保证食品安全，1995年开始禁止在育肥猪日粮中使用抗菌素，目前已制定了饲料生产中严禁使用抗菌素的规定。1999年元月欧共体立法除四种抗菌素被限制使用外，禁止其他所有抗菌素和合成抗菌药作为饲料添加剂。欧盟的决定是世界性的，其影响波及世界主要农业大国，美国、中国也不例外，可以预料，在未来的5 10年内，全世界的主要国家将禁止化学药物作为饲料添加剂。取而代之的将是一些符合人们安全、卫生、健康、生态、环保的无污染、无残留、无毒副作用的高效新型饲料添加剂。微生态制剂是近年来广泛使用的高效、安全的新型饲料添加剂，它正逐渐替代抗生素起防病抗病的作用。微生态制剂是利用某些特殊的有益功能微生物，经培养、收集菌体、干燥等特殊工艺加工而成的含活性益生菌的安全、无污染、无药物残留的优质新型饲料添加剂，它的出现和发展是建立在微生态平衡理论、微生态失调理论和微生态防治理论指导下的，是适应21世纪人类食品生产需要的。绿色健康微生态制剂的作用机理是通过补充益生菌来调节动物体内的微生态平衡，促进机体内原有有益菌的增殖，抑制体内有害菌的定植及生长，起到生物屏障作用，预防和治疗动物的消化道疾病，增加动物体免疫功能， 抵御感染；益生菌能在肠道内代谢产生多种氨基酸、维生素(K、C,B1,B2,B6、泛酸、烟酸、生物素、肌醇和叶酸等)，以及其他一些代谢产物作为营养物质，被动物机体吸收利用，从而促进畜禽的生长发育和增重；益生菌还可以促进动物的脂类代谢，将多余的脂肪降解为脂肪酸和甘油，降低了动物体内脂肪沉积，提高瘦肉率。目前，国外已先后开发了乳酸菌、双歧杆菌、拟杆菌、芽孢杆菌，丁酸梭菌等一系列微生态制剂相关产品，应用于畜禽业和水产业取得了非常显著的治病、防病效果。1989年美国公布了乳酸杆菌、链球菌、拟杆菌、芽孢杆菌、双歧杆菌、丁酸梭菌、曲霉、酵母等10个属的42个种用于饲料添加是安全的。国内外的多年研究应用证明，微生态制剂是安全、无残留、无污染的绿色环保饲料添加剂，是继抗菌素之后，值得大力开发研究推广的一类新型抗菌素替代产品，是21世纪发展的必然趋势。1996年以来，我国农业部已正式批准了纳豆芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、粪链球菌、啤酒酵母菌等12种饲料微生物添加剂品种，到2008年为止，已增加到16个品种。近年来，这些微生物饲料添加剂陆续在各种饲料中得到应用，取得了很好的经济效益和社会效益。丁酸梭菌已于2008年11月被农业部批准为二类新兽药，2009年又批准为新饲料添加剂；地衣芽孢杆菌作为动物饲料添加剂，在国外已得到广泛应用，取得了很好的预防疾病和促生长效果。而在我国，地衣芽孢杆菌也于2010年列入了可以生产的饲料添加剂目录，目前，丁酸梭菌和地衣芽孢杆菌制成的复合制剂在养殖业上的应用还未见报道。丁酸梭菌和地衣芽孢杆菌都是益生菌，在国外早已用来防治人和动物的肠道疾病。在国内，丁酸梭菌作为人药在治疗人体肠道疾病方面已应用广泛，地衣芽孢杆菌作为人药(商品名整肠生)应用于临床也已有14年的历史，在调节人体微生态平衡、治疗人体肠道疾病方面均取得了很好的疗效。丁酸梭菌(JOlostridium butyrium)是归属于梭菌属的革兰氏阳性厌氧芽孢杆菌， 存在于土壤、奶酪、动物的粪便等环境中。丁酸梭菌除了广泛应用于医药、食品和饲料以外， 在日本还被用来作为微生物肥料，能对农作物起到防病抗病和促生长的作用。作为微生态制剂，丁酸梭菌的特点及其临床疗效为
(1)调节肠道微生态平衡。丁酸梭菌是动物肠道内正常的有益菌，它的生长繁殖，可促进动物肠道内有益菌群的增殖和发育，抑制肠道内腐败菌和有害菌(霍乱菌、痢疾菌、沙门氏菌、病原性大肠杆菌)的生长繁殖，纠正肠道内菌群紊乱，减少和降低肠毒素的产生；
(2)在肠道内可产生B族维生素，维生素K，淀粉酶等物质，对机体具有良好的营养和保健作用；
(3)丁酸梭菌的主要代谢产物丁酸是肠上皮组织细胞再生和修复的主要营养物质；
(4)丁酸梭菌能激活免疫系统，能提高机体的免疫功能，具有防病抗病的功能；
(5)丁酸梭菌是厌氧芽孢杆菌，它的芽孢对外界环境有很强的抵抗力，在体外加热至 900C UO分钟，100°C、5分钟不会失活；pH 1. 0 5· 0时仍能存活，pH 4. 0 9· 8时仍能发育生长，所以其在胃肠内不受胃酸、胆汁酸类的影响，在体外产品性能稳定，可长期室温保存。地衣芽孢杆菌是能够产生芽孢的兼性厌氧微生物。是一种革兰氏阳性菌，是一种优良的、广泛应用于医药、食品和饲料的微生态制剂用菌种。作为微生态制剂，地衣芽孢杆菌的特点和作用机理是
(1)调节肠道微生态平衡。地衣芽孢杆菌进人肠道后会迅速生长繁殖，同时，它的生长繁殖起到生物耗氧效应.造成生态环境低氧状态。为肠道内的生理性厌氧菌如双歧杆菌、乳酸杆菌等益生菌的生长繁殖创造有利条件.通过支持生理性厌氧菌的增殖，抑制致病菌的生长，纠正肠道内菌群紊乱，使肠道功能得以恢复。(2)地衣芽孢杆菌具有丰富的酶系，它在肠道内生长繁殖过程中可产生多种消化酶(淀粉酶、蛋白酶、植酸酶等)，可有效地促进动物对饲料的消化吸收，提高饲料利用率，降低饲养成本。特别是植酸酶的产生，能够使饲料中难吸收的植酸磷分解成易吸收利用的肌醇和磷酸，可显著降低动物粪便中植酸磷的排放，减少环境污染，对防治环境污染有其重要
眉、ο(3)地衣芽孢杆菌能增强机体特异性和非特异性免疫反应，促进巨噬细胞的吞噬活性，提高抗感染能力。(4)地衣芽孢杆菌菌体繁殖速度快、容易培养，生产成本低。由于其具有芽孢，产品抗逆性强，能耐高温、耐酸碱、耐挤压。在体内活性不受胃酸的影响，在体外产品性能稳定， 可长期室温保存。目前国内饲用微生态制剂主要有乳酸菌制剂和芽孢杆菌制剂或两种菌的复合制剂。乳酸菌是动物肠道里的有益菌，能定植于肠道中起到很好的整肠作用，但由于乳酸菌没有芽孢，这类制剂产品存放稳定性差，不能在室温长期保存，而且不耐胃酸，在食用过程中通过胃部时会失去很大一部分活性，特别是当添加到饲料中进行造粒时，菌体不耐高温而大量死亡，因此影响了产品的推广应用，目前市场上广泛使用的是能耐酸、耐高温的芽孢杆菌类产品。
发明内容
本发明的目的是由丁酸梭菌和地衣芽孢杆菌制备一种更优良的复合微生物饲料添加剂，广泛应用于养殖业。本发明的技术方案一株丁酸梭菌菌株，其分类命名为丁酸梭菌(C/^irii/i butyricum) RH-2,已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为 CGMCC No. 4664，保藏日期为2011年3月11日。本发明所用的地衣芽孢杆菌是已知的芽孢杆菌，能通过正常渠道获得，具体商品目录见《中国菌种目录》(中国微生物菌种保藏管理委员会编著，机械工业出版社出版， 1992)，菌号为 AS 1. 521。一种复合微生物饲料添加剂，由丁酸梭菌活菌制剂和地衣芽孢杆菌活菌制剂组成；其中丁酸梭菌活菌制剂由保藏编号为CGMCC No. 4664的丁酸梭菌(C/^irii/i butyricum) RH-2经过三角瓶种子培养、种子罐培养、发酵罐培养、离心收集菌泥、与碳酸钙混合后低温干燥、粉碎过筛，最后再与辅料淀粉混合得到；地衣芽孢杆菌活菌制剂由地衣芽孢杆菌经过斜面菌种培养、茄子瓶培养、种子罐培养、发酵罐培养、离心收集菌泥、与碳酸钙混合、低温干燥、粉碎过筛，最后再与辅料淀粉混合得到；将丁酸梭菌活菌制剂和地衣芽孢杆菌活菌制剂按质量1 1比例均勻混合即得复合微生物饲料添加剂，所述复合微生物饲料添加剂含丁酸梭菌0. 25亿 2. 5亿cfu/g、含地衣芽孢杆菌5亿 10亿cfu/g。所述复合微生物饲料添加剂的制备方法，制备步骤如下 (1) 丁酸梭菌活菌制剂的制备
a、三角瓶种子培养配制液体培养基，调节pH 6. 5^7. 5，分装三角瓶中，150mL三角瓶装100mL，2000mL三角瓶装180(Tl900mL，121°C灭菌20 30分钟，冷却后将丁酸梭菌CGMCC No. 4664冷冻管接种至150mL三角瓶中，于厌氧条件下30 38°C培养1414小时；将长好的丁酸梭菌种子以59TlO%的接种量转接入2000mL三角瓶中，于3(T38°C静止培养1414小时。b、种子罐培养在50L种子罐中加入液体培养基，装液量为70%，调节pH 至7. (Γ8. 5，开搅拌，121 °C灭菌2(Γ30分钟，开冷却水降温，并通无菌氮气控制罐压 0. 04MPa 0. 06MPa,当温度降至36 38°C时，将长好的2000mL三角瓶种子液以5% 10%的接种量转入种子罐的培养基中，保持3(T38°C、罐压0. 04MPa^0. 06MPa静止培养1414小时。C、发酵罐培养当种子罐培养液的pH降至4. 5^5. 0、菌数达到5 15亿cfu/mL时， 将种子罐中的培养液以59TlO%的接种量转入装有350L液体培养基的500L发酵罐中，保持 3(T38°C、罐压0. 04ΜΡεΓ0. 06MPa，静止培养1414小时；发酵罐培养基组成和配制方法与种子罐相同。d、配制丁酸梭菌活菌制剂当发酵罐培养液中的丁酸梭菌芽孢率达909Γ95%时， 将培养液通入管式高速离心机中收集菌泥，将收集到的湿菌泥与无水碳酸钙以1 4飞的质量比例充分混勻，于4(T60°C干燥，粉碎过80目筛，然后再将所得菌粉与玉米淀粉以1 4的质量比例混勻，制成丁酸梭菌活菌制剂；或直接将湿菌泥与无水碳酸钙以1 4飞的比例充分混勻后直接与淀粉以1 4的比例混勻，再经干燥粉碎后制成丁酸梭菌活菌制剂。以上所述液体培养基配方为蛋白胨纩20g，酵母膏5 15g、磷酸氢二钾0.2 2g，磷酸二氢钾0. 2 2g，硫酸镁0.广2g，葡萄糖8 20g，碳酸钙ri0g,7jC IOOOmL0(2)地衣芽孢杆菌活菌制剂的制备
a、菌种培养将保存的地衣芽孢杆菌转接在新鲜配制的固体培养基摆成的试管斜面上，于3(T37°C培养M小时，取此斜面菌种转接2个250mL的茄子瓶斜面，于3(T37°C培养 24小时。b、种子罐培养在100L种子罐中加入液体培养基，装液量70%，调节pH 至7. 6^7.8,开搅拌，121°C灭菌2(Γ30分钟，开冷却水降温，并通无菌空气控制罐压 0. 04ΜΡεΓ0. 06MPa,当温度降至36 38°C时，将长好的2个茄子瓶上菌泥用10(T200mL无菌生理盐水清洗，接种至种子罐内的液体培养基中，保持3(T38°C、罐压0. 04MPa^0. 06MPa，搅拌速度为12(Γ160转/分，进行深层通气搅拌培养16 24小时。C、发酵罐培养当种子罐内培养液中地衣芽孢杆菌的菌数达到2(Γ30亿cfu/ HiL时，将种子罐中的培养液以59TlO%的接种量转入Im3发酵罐中的液体培养基中，保持3(T38°C、罐压0. 04MPa^0. 06MPa，搅拌速度为12(Tl60转/分，进行深层通气搅拌培养 2Γ30小时；发酵罐培养基组成和配制方法与种子罐相同。d、配制地衣芽孢杆菌活菌制剂发酵罐培养液中地衣芽孢杆菌芽孢率达909Γ95% 时，将发酵罐中的培养液通入管式高速离心机中收集湿菌泥，将收集到的湿菌泥与无水碳酸钙以1 4飞的重量比例充分混勻，于4(T60°C干燥后粉碎过80目筛，然后再将菌粉与玉米淀粉以1 3的重量比例混勻，制成地衣芽孢杆菌活菌制剂；
或将湿菌泥与无水碳酸钙以1 4飞的重量比例充分混勻后直接与玉米淀粉以1 3 的重量比例混勻，再经干燥粉碎后制成含地衣芽孢杆菌活菌制剂。所述固体培养基的配制按蛋白胨纩10g，牛肉膏5 7g，氯化钠5 7g，蒸馏水定容IOOOmL,调节pH 7. 2 7. 4，加入18 20g琼脂后加热熔化，装18 X 180mm的试管，每支8mL ；装 250mL的茄子瓶，每个装85mL ； 121°C灭菌30分钟，冷却至50°C摆成斜面备用。所述液体培养基的配方蛋白胨5 15g，葡萄糖0. 5飞g，玉米粉4 6g，豆粕粉 4 10g，酵母膏4 6g，磷酸二氢钾0. 5 1. 5g，硫酸镁0. 3 lg，硫酸锰5 20mg，水1000mL。(3)复合微生物饲料添加剂的配制将步骤(1)制得的丁酸梭菌活菌制剂与步骤 (2)制得的地衣芽孢杆菌活菌制剂以1 1的重量比例均勻混合即制成产品复合微生物饲料添加剂。步骤(1) e及步骤(2) e中所述淀粉包括米糠、麸皮。所述丁酸梭菌活菌制剂含活菌0. 5飞亿cfu/g。所述地衣芽孢杆菌活菌制剂含活菌1(Γ20亿cfu/g。所述复合微生物饲料添加剂含丁酸梭菌活菌0. 25亿飞亿cfu/g、含地衣芽孢杆菌活菌5亿 10亿cfu/g。所述复合微生物饲料添加剂应用于仔猪饲料，添加量为饲料总重量的 0. 05% 0· 1%。所述复合微生物饲料添加剂应用于育肥猪饲料，添加量为饲料总重量的 0. 01% 0· 03%O所述复合微生物饲料添加剂应用于肉鸡饲料，添加量为饲料总重量的 0. 05% 0· 1%。所述复合微生物饲料添加剂应用于水产饲料，水产包括甲鱼、虾和各种淡水鱼，添加量为饲料总重量的0. 059Γ0. 1%。所述复合微生物饲料添加剂应用于大型动物牛、羊，添加量为饲料总重量的 0. 03% 0· 05%。饲料造粒对本复合微生物饲料添加剂的影响
本复合制剂使用的丁酸梭菌和地衣芽孢杆菌都是芽孢杆菌，据报道，它们的芽孢对外界环境有很强的抵抗力，在体外加热至90°C、10分钟，100°C、5分钟不会失活。为了考察它们在饲料中活性的变化，将它们的活菌制剂以千分之一的比例添加到水产饲料中进行造粒 (7(T90°C)，检测造粒前后活菌数的变化，结果见表1。表1造粒对几种菌活菌数量的影响
菌名造_料活觀self 括觀造_ mm 活舊数(％)丁_舊1 IxlO81.2x10^9^9x101 82.5地觀賺茵109xiCfSJxlOs 82,4BfKiLIfW2 2χ1098.8χ10323χ102 0.028
从表1中可以看出，丁酸梭菌和地衣芽孢杆菌添加到饲料中，经过造粒后，菌数有一定下降，但成活率都在80%以上，活性保持较好；而嗜酸乳杆菌经造粒后菌数急剧下降，成活率仅为0. 0 %，活性成分大部分已损失。
本发明的有益效果
1、本发明采用的丁酸梭菌和地衣芽孢杆菌都是芽孢杆菌，在动物体内活性不受胃酸、消化酶、胆汁酸等的影响，能快速起到调理肠道微生态平衡、增强动物免疫力、促进对饲料的消化吸收等作用。2、本发明采用的两种菌分别属于厌氧和好氧芽孢杆菌，将两者制成复合制剂，进入动物体内，地衣芽孢杆菌首先发芽繁殖，产生多种酶和维生素等营养物质，同时消耗掉残留的氧气，为厌氧菌丁酸梭菌的发芽繁殖提供了更良好的环境，从而迅速地促进了丁酸梭菌在肠道内的增殖和定殖，两者协同作用，筑起坚实的屏障，更快更有效地起到防病抗病的作用；
3、本发明采用的两种菌在体外对外界环境都有很强的抵抗力，在加热至90°C 10分钟、100°C 5分钟不会失活，因而在饲料造粒过程中能保持较高活性，产品保存稳定性好，不需要冰箱保存，在室温存放能长期保存；而像双歧等乳酸菌在饲料造粒过程中活性损失严重，产品保存稳定性不好，需要冰箱保存，产品无法大量销售。4、本发明采用的两种菌都有丰富的酶系，在肠道生长繁殖过程中能产生多种酶 (淀粉酶、蛋白酶和植酸酶)、有机酸和维生素等，这等于在动物体内可形成一个小型的“酶工厂”。不但能防病治病，提供营养物质，而且有促进消化和提高饲料利用率的作用。特别是植酸酶的产生.可使植酸磷降解为肌醇和磷酸，提高饲料中磷的利用率，降低粪便中磷的排放，减少环境污染，这是其它菌所没有的。5、本发明采用的两种菌的培养基和培养条件都很简单，生产成本低。从两种菌的培养基成分可看出，使用的只是普通的蛋白胨和酵母膏，没有价格昂贵的牛肉膏和胰蛋白胨等成分，其它或是农副产品或是少量无机盐，培养基成本很低，另外培养周期都较短，最长不超过30小时，可节省大量的能耗，提高设备利用率。生物材料样品保藏
一株丁酸梭菌菌株，其分类命名为丁酸梭菌(C/oWrii/i butyricuni)m-2,已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物研究所，保藏号为CGMCC No. 4664。
具体实施例方式在下面所述的所有具体实施例中，如无特殊说明，均为本领域常用方法。实施例1
所述复合微生物饲料添加剂的制备方法，制备步骤如下 (1) 丁酸梭菌活菌制剂的制备
a、三角瓶种子培养按配方配制液体培养基2200mL，调节pH 6. 5^7. 5，分装三角瓶中， 150mL三角瓶装IOOmL，2000mL三角瓶装1900mL，121°C灭菌30分钟，冷却后将丁酸梭菌 CGMCC No. 4664冷冻管接种至1个150mL三角瓶中，于厌氧条件下3(T38°C培养14小时；将长好的丁酸梭菌种子以5%接种量转接入1个2000mL三角瓶中，于3(T38°C静止培养M小时。b、种子罐培养在50L种子罐中加入液体培养基，装液量70%，调节pH至7. (Γ8. 5， 开搅拌，121°C灭菌30分钟，开冷却水降温，并通无菌氮气控制罐压0. 04MPa^0. 06MPa,当温度降至36°C时，将长好的大三角瓶种子液以5%的接种量转入种子罐的培养基中，保持 38"C、罐压0. 04MPa 0. 06MPa静止培养14 24小时。
C、发酵罐培养当种子罐培养液的pH降至4. 5、菌数达到5 15亿cfu/mL时，将种子罐中的培养液以5%的接种量转入装有350L液体培养基的500L发酵罐中，保持38°C、罐压0. 04MPa^0. 06MPa，静止培养1414小时；发酵罐培养基组成和配制方法与种子罐相同。d、配制丁酸梭菌活菌制剂当发酵罐培养液中的丁酸梭菌芽孢率达909Γ95%时， 将培养液通入管式高速离心机中收集菌泥，将收集到的湿菌泥与无水碳酸钙以1 4的质量比例充分混勻，于4(T60°C干燥，粉碎过80目筛，然后再将所得菌粉与玉米淀粉以1 4 的质量比例混勻，制成丁酸梭菌活菌制剂。所述液体培养基配方蛋白胨8g，酵母膏5g、磷酸氢二钾0. 2g，磷酸二氢钾0. 2g， 硫酸镁0. lg，葡萄糖8g，碳酸钙lg，水1000mL。(2)地衣芽孢杆菌活菌制剂的制备
a、菌种培养将保存的地衣芽孢杆菌转接在新鲜配制的固体培养基摆成的试管斜面上，于37°C培养M小时，取此斜面菌种转接2个250mL的茄子瓶斜面，于37°C培养M小时。b、种子罐培养在100L种子罐中加入液体培养基，装液量70%，调节pH 至7. 6^7.8,开搅拌，121°C灭菌2(Γ30分钟，开冷却水降温，并通无菌空气控制罐压 0. 04ΜΡεΓ0. 06MPa,当温度降至36 38°C时，将长好的2个茄子瓶上菌泥用200mL无菌生理盐水清洗，接种至种子罐内的液体培养基中，保持38°C、罐压0. 04MPa^0. 06MPa，搅拌速度为 160转/分，进行深层通气搅拌培养1614小时。C、发酵罐培养当种子罐内培养液中地衣芽孢杆菌的菌数达到2(Γ30亿cfu/mL 时，将种子罐中的培养液以10%的接种量转入Im3发酵罐中的液体培养基中，保持38°C、罐压0. 04MPa 0. 06MPa，搅拌速度为160转/分，进行深层通气搅拌培养M 30小时；发酵罐培养基组成和配制方法与种子罐相同。d、配制地衣芽孢杆菌活菌制剂发酵罐培养液中地衣芽孢杆菌芽孢率达909Γ95% 时，将发酵罐中的培养液通入管式高速离心机中收集湿菌泥，将收集到的湿菌泥与无水碳酸钙以1 6的重量比例充分混勻，于60°C干燥后粉碎过80目筛，然后再将菌粉与玉米淀粉以1 3的重量比例混勻，制成地衣芽孢杆菌活菌制剂。所述固体培养基的配制按蛋白胨8g，牛肉膏5g，氯化钠5g，水定容lOOOmL，调节 PH 7. 2 7. 4，加入20g琼脂后加热熔化，装18 X 180mm的试管，每支8mL ；装250mL的茄子瓶， 每个装85mL ； 121°C灭菌30分钟，冷却至50°C摆成斜面备用。所述液体培养基的配方蛋白胨15g，葡萄糖5g，玉米粉6g，豆粕粉10g，酵母膏 6g，磷酸二氢钾1. 5g，硫酸镁lg，硫酸锰20mg，水1000mL。(3)复合微生物饲料添加剂的配制将步骤(1)制得的丁酸梭菌活菌制剂与步骤 (2)制得的地衣芽孢杆菌活菌制剂以1 1的重量比例均勻混合即制成产品复合微生物饲料添加剂。应用实施例1
准备三组断奶仔猪，第一组饲料中添加实施例1制备的复合微生物饲料添加剂，添加量为饲料总重量的0. 05%，第二组饲料中添加实施例1制备的复合微生物饲料添加剂，添加量为饲料总重量的0. 1%，第三组则用普通饲料喂养。45天后，三组断奶仔猪数据如表2所示。从表2可以看出，添加0. 059Γ0. 1%的复合制剂，都能有效促进仔猪的生长，大大提高饲料利用率，其中0. 05%的添加量增重效果更加显著，增重率达13. 34%，饲料利用率提高 10.9%，能显著降低养殖成本，提高经济效益。 增重率计算公式(试验组日均头增重-空白对照组日均头增重)/空白对照组日均头增重χ 100%
表2复合制剂对仔猪生长的影响
添r: f'mm平Jl 1 繊平均终 t Mt)曰均头增 1 (S佚)曰均头耗科 (g/头)11军麵利酵.0—1 (3.0530 30WJ5 10026.24 27.0357.56 37178559.08 557 06127% 13 34%1.56(+5.45%) 1—47(+10.9%)5臼对照 (0)30WJ25.3333.33551 11165
所述cfu是通用生物单位，指菌落个数。
权利要求
1.一株丁酸梭菌菌株，其分类命名为丁酸梭菌(CZo1Sirii/i toi_F_ri / )RH-2，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No. 4664。
2.一种复合微生物饲料添加剂，其特征在于所述复合微生物饲料添加剂由丁酸梭菌活菌制剂和地衣芽孢杆菌活菌制剂组成；其中丁酸梭菌活菌制剂由保藏编号为CGMCC No. 4664的丁酸梭菌RH-2经过三角瓶种子培养、种子罐培养、发酵罐培养、离心收集菌泥、 与碳酸钙混合后低温干燥、粉碎过筛，最后再与辅料淀粉混合得到；地衣芽孢杆菌活菌制剂由地衣芽孢杆菌经过斜面菌种培养、茄子瓶培养、种子罐培养、发酵罐培养、离心收集菌泥、 与碳酸钙混合、低温干燥、粉碎过筛，最后再与辅料淀粉混合得到；将丁酸梭菌活菌制剂和地衣芽孢杆菌活菌制剂按质量1 1比例均勻混合即得复合微生物饲料添加剂，所述复合微生物饲料添加剂含丁酸梭菌0. 25亿 2. 5亿cfu/g、含地衣芽孢杆菌5亿 10亿cfu/g。
3.权利要求1所述复合微生物饲料添加剂的制备方法，其特征在于制备步骤如下(1)丁酸梭菌活菌制剂的制备a、三角瓶种子培养配制液体培养基，调节pH6. 5 7. 5，分装三角瓶中，150mL三角瓶装100mL，2000mL三角瓶装180(Tl900mL，121°C灭菌20 30分钟，冷却后将丁酸梭菌CGMCC No. 4664冷冻管接种至150mL三角瓶中，于厌氧条件下30 38°C培养1414小时；将长好的丁酸梭菌种子以59TlO%的接种量转接入2000mL三角瓶中，于3(T38°C静止培养1414小时；b、种子罐培养在50L种子罐中加入液体培养基，装液量70%，调节pH至7.(Γ8.5，开搅拌，121°C灭菌20 30分钟，开冷却水降温，并通无菌氮气控制罐压0. 04MPa 0. 06MPa,当温度降至36 38°C时，将长好的大三角瓶种子液以59TlO%的接种量转入种子罐的培养基中， 保持3(T38°C、罐压0. 04MPa 0. 06MPa静止培养14 24小时；c、发酵罐培养当种子罐培养液的pH降至4.5^5. 0、菌数达到5 15亿cfu/mL时，将种子罐中的培养液以59TlO%的接种量转入装有350L液体培养基的500L发酵罐中，保持 3(T38°C、罐压0. 04ΜΡεΓ0. 06MPa，静止培养1414小时；发酵罐培养基组成和配制方法与种子罐相同；d、配制丁酸梭菌活菌制剂当发酵罐培养液中的丁酸梭菌芽孢率达909Γ95%时，将培养液通入管式高速离心机中收集菌泥，将收集到的湿菌泥与无水碳酸钙以1 4飞的质量比例充分混勻，于4(T60°C干燥，粉碎过80目筛，然后再将所得菌粉与玉米淀粉以1 4的质量比例混勻，制成丁酸梭菌活菌制剂；或直接将湿菌泥与无水碳酸钙以1 4飞的质量比例充分混勻后直接与淀粉以1 4的质量比例混勻，再经干燥粉碎后制成丁酸梭菌活菌制剂；所述液体培养基配方蛋白胨纩20g，酵母膏5 15g、磷酸氢二钾0.2 2g，磷酸二氢钾 0. 2 2g，硫酸镁0.广2g，葡萄糖8 20g，碳酸钙ri0g,7jC IOOOmL ；(2)地衣芽孢杆菌活菌制剂的制备a、菌种培养将保存的地衣芽孢杆菌转接在新鲜配制的固体培养基摆成的试管斜面上，于3(T37°C培养M小时，取此斜面菌种转接2个250mL的茄子瓶斜面，于3(T37°C培养 24小时；b、种子罐培养在100L种子罐中加入液体培养基，装液量70%，调节pH至7.6 7. 8，开搅拌，121°C灭菌20 30分钟，开冷却水降温，并通无菌空气控制罐压0. 04MPa 0. 06MPa,当温度降至36 38°C时，将长好的2个茄子瓶上菌泥用10(T200mL无菌生理盐水清洗，接种至种子罐内的液体培养基中，保持3(T38°C、罐压0. 04ΜΡεΓ0. 06MPa，搅拌速度为12(Tl60转/ 分，进行深层通气搅拌培养1614小时；c、发酵罐培养当种子罐内培养液中地衣芽孢杆菌的菌数达到2(Γ30亿cfu/mL时，将种子罐中的培养液以59TlO%的接种量转入Im3发酵罐中的液体培养基中，保持3(T38°C、罐压0. 04MPa 0. 06MPa，搅拌速度为120 160转/分，进行深层通气搅拌培养M 30小时；发酵罐培养基组成和配制方法与种子罐相同；d、配制地衣芽孢杆菌活菌制剂发酵罐培养液中地衣芽孢杆菌芽孢率达909Γ95%时， 将发酵罐中的培养液通入管式高速离心机中收集湿菌泥，将收集到的湿菌泥与无水碳酸钙以1 4飞的重量比例充分混勻，于4(T60°C干燥后粉碎过80目筛，然后再将菌粉与玉米淀粉以1 3的重量比例混勻，制成地衣芽孢杆菌活菌制剂；或将湿菌泥与无水碳酸钙以1 4飞的重量比例充分混勻后直接与玉米淀粉以1 3 的重量比例混勻，再经干燥粉碎后制成含地衣芽孢杆菌活菌制剂；所述固体培养基的配制按蛋白胨纩10g，牛肉膏5 7g，氯化钠5 7g，蒸馏水定容 IOOOmL,调节pH 7. 2 7. 4，加入18 20g琼脂后加热熔化，装18 X 180mm的试管，每支8mL ；装 250mL的茄子瓶，每个装85mL ； 121°C灭菌30分钟，冷却至50°C摆成斜面备用；所述液体培养基的配方蛋白胨5 15g，葡萄糖0. 5飞g，玉米粉4 6g，豆粕粉4 10g，酵母膏4 6g，磷酸二氢钾0. 5 1. 5g，硫酸镁0. 3 lg，硫酸锰5 20mg，水IOOOmL ；(3)复合微生物饲料添加剂的配制将步骤(1)制得的丁酸梭菌活菌制剂与步骤(2)制得的地衣芽孢杆菌活菌制剂以11的质量比例均勻混合即制成产品复合微生物饲料添加剂。
4.根据权利要求2所述复合微生物饲料添加剂的制备方法，其特征在于步骤(1)e及步骤(2) e中所述玉米淀粉改用米糠或麸皮。
5.权利要求1所述复合微生物饲料添加剂的应用，其特征在于应用于仔猪饲料，添加量为饲料总重量的0. 059Γ0. 1%。
6.权利要求1所述复合微生物饲料添加剂的应用，其特征在于应用于育肥猪饲料，添加量为饲料总重量的0. 019Γ0. 03%。
7.权利要求1所述复合微生物饲料添加剂的应用，其特征在于应用于肉鸡饲料，添加量为饲料总重量的0. 059Γ0. 1%。
8.权利要求1所述复合微生物饲料添加剂的应用，其特征在于应用于水产饲料，添加量为饲料总重量的0. 059Γ0. 1%。
9.根据权利要求7所述复合微生物饲料添加剂的应用，其特征在于所述水产包括甲鱼、虾和各种淡水鱼。
10.权利要求1所述复合微生物饲料添加剂的应用，其特征在于应用于大型动物牛、 羊，添加量为饲料总重量的ο. 039Γ0. 05%。
全文摘要
一种复合微生物饲料添加剂的制备方法及其应用，属于微生物工程技术领域。本发明复合微生物饲料添加剂由丁酸梭菌活菌制剂和地衣芽孢杆菌活菌制剂组成；其中丁酸梭菌活菌制剂经过三角瓶种子培养、种子罐培养、发酵罐培养、离心收集菌泥、与碳酸钙混合后低温干燥、粉碎过筛，最后再与辅料淀粉混合得到；地衣芽孢杆菌活菌制剂经过斜面菌种培养、茄子瓶培养、种子罐培养、发酵罐培养、离心收集菌泥、与碳酸钙混合、低温干燥、粉碎过筛，最后再与辅料淀粉混合得到；将丁酸梭菌活菌制剂和地衣芽孢杆菌活菌制剂等质量比混合均匀即得复合微生物饲料添加剂。本复合微生物饲料添加剂能大大提高饲料利用率，显著降低养殖成本，提高经济效益。
文档编号C12R1/145GK102226162SQ201110133468
公开日2011年10月26日 申请日期2011年5月23日 优先权日2011年5月23日
发明者刘佳, 吴燕, 唐宝英, 张六六, 陆茂林 申请人:江苏省微生物研究所有限责任公司