专利名称：一种寡核苷酸基因芯片及其在检测多种病菌方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因芯片技术领域，具体涉及一种寡核苷酸基因芯片及其在检测多种病菌方面的应用。
背景技术：
牛结核病(Bovis Tuberculosis)，是由牛分枝杆菌及结核分枝杆菌等菌引起的传染性疾病，该病不仅可以导致奶牛生产力下降，还是一种重要的人兽共患病，严重威胁着公共卫生安全。牛布病(Brucellosis)是由流产布氏杆菌等菌引起的传染性疾病，可以导致奶牛的流产，同时该菌也可以感染人，且难以治愈，今年来人感染布氏杆菌的病例呈上升趋势， 因此对于本病原菌的检测也具有重要的公共卫生学意义。目前关于结核病原菌的检测主要是通过结核菌素实验，但是受制于物理以及生物因素的影响，对本类病原菌的检出率不高；细菌分离培养是经典的鉴别手段，但是分枝杆菌生长周期长，一般要培养4 8周，不利于快速诊断；PCR方法的建立可以实现快速、灵敏的检测，但是易受到污染从而导致假阳性的结果。通过检测外周血淋巴细胞释放IFN-γ的水平也可以对分枝杆菌感染进行检测，且具有较高的敏感性和特异性，不足之处是成本太高， 且必须在采血后他内完成检测。对于布氏杆菌的检测，主要是采用试管凝集试验以及虎红平板凝集试验，该方法会受到物理或生物因素影响，导致假阳性或者假阴性结果。因此针对以上几种病原菌迫切需要研制出一种新型、快速、准确、高通量的检测技术，基因芯片方法以其特异性好，检测通量高而具有一定优势，目前利用基因芯片检测以上所述病原菌的相关技术亟待进一步研究。
发明内容
本发明的一个目的是针对现有技术的不足，提供一种应用于检测多种病菌的寡核苷酸基因芯片，所述病菌包括结核分枝杆菌(i/· tokr^/Axsis)、牛分枝杆菌(I bovis)、 鸟分枝杆菌OK an·腫)、副结核分枝杆菌OK paratuberculosis)和布氏杆菌(^raceBa)寸。本发明的另一个目的是提供所述基因芯片在检测多种病菌方面的应用。本发明的目的通过以下技术方案予以实现
提供一种寡核苷酸芯片，包括基底和固定于该基底上的探针，所述探针可分别与结核分枝杆菌(i/· to力ercWosis)、牛分枝杆菌OK 力on、)、鸟分枝杆菌OK an'腫)、副结核分枝杆菌(M para tuberculosis )和布氏杆菌{Brucella )的PCR扩增产物进行杂交反应；
所述五种细菌的基因序列的检索号分别为M. tuberculosis检索号为S69737. 1 ； M . bovis 检索号为BX248;341. 1 ；Μ. avium 检索号为NC_008595 ；Μ. paratuberculosis 检索号为S74401. 1 ；Brucella 检索号为NC_006933. 1。所述探针是以Genebank 上已公布的 i/· tuberculosis H37Rv、Μ. bovis ΑΝ5、M. avium、Μ. paratuberculosis和Brucella五种细菌的基因序列，分别选择M. tuberculosis H37Rv 的 mp t40 基因、I bo vis AN5 的 pncA 基因、a vian 的 gyrB 基因、 paratuberculosis的IS-900基因、Brucella的基因序列为参考序列,通过DNA star 软件分析比较，设计出多组引物，进行比较分析，针对每种细菌确定了一对特异性引物；克隆鉴定上述5种菌株的阳性质粒，构建质粒参比品；针对上述菌株基因片段设计了 15条相应的寡核苷酸探针进行特异性的筛选检测，最终筛选出5条灵敏度高、特异性强的探针。所述引物分别具有SEQID NO :3和SEQ ID NO 4 ；SEQ ID NO :9和SEQ ID NO 10 ； SEQ ID NO: 11 禾口 SEQ ID NO 12 ；SEQ ID NO: 17 禾口 SEQ ID NO 18 ；SEQ ID N0:23 禾口 SEQ ID NO : 所示的核苷酸序列；
所述探针分别具有 SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 31、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO 37 和 SEQ ID NO :39所示的核苷酸序列。引物的核苷酸序列表示如下
菌株名称引物名称
引物序列
.,DC* IS
C A A C G GC TO GCTC A AG I
C:T〔. Q Q1-T^ YQ Q Q JYJ-r-Q Q
:d-丄 Ct-iT^i CZ Cl-丄 CL Cl! 二 C.-ι. CL α 丄 d- CZ C.- Cl j.
:B￥3 CC:C:TGIC-CCGGAG AAC-CCC-
探针序列信息如下
ACCGCACCIICCACTACCC C-C:C-ACC-A.4ACCC-CCIiei
ACICGACCGCIAATIGAC-
cagcgcgc-ccicgic:gii
产物长度
3F CAACC-C-CTCAGATCAAGGTCAAI BR2 AeCGCAieCGAC-AIGGACeAAJiC
- “·
探针名称探针序列(5’-3’ )长度(bp)ptlACGGGTGGCTCAAGTTGGGTCTGGT-NH2-25pb3CGGCGTCATGGACCCTATATCTG-NH2-23A3TCGAGGGCCAGACCAAGACCAAAC-NH2-24P2GGCGTGGTCGTCTGCTGGGTTGATC-NH2-25B2MCATTGACCGCATTCATGGGTTTCG-NH2-26
在上述序列基础上，本领域技术人员可以通过常规方法进行引物和探针的合成。所有下游引物在合成中用生物素基团亚磷酰化试剂在5’端进行Cy3标记。寡核苷酸探针在3’ 端进行氨基修饰，氨基基团与探针序列之间以间隔臂(聚乙二醇磷酰化试剂)相连，增加探针的活性动力并提高杂交荧光信号的强度。
本发明同时提供了所述基因芯片在检测多种病菌方面的应用，筛选特异性探针，将所筛选出的特异探针点样至基片上，与待测病菌菌株PCR扩增产物进行杂交反应，洗涤干燥后经扫描仪扫描获取杂交信号，实现检测目的。
具体地，包括以下步骤
(1)应用权利要求1所述的引物和探针，将探针点样至基因基片上；
(2)基因基片上的探针与待测病菌菌株的PCR扩增产物进行杂交反应；
4(3)杂交反应后，洗涤干燥，经扫描仪扫描获取杂交信号。步骤(2)所述PCR扩增为五重PCR不对称反应体系，扩增条件为
所述结核分枝杆菌(M. tuberculosis )、牛分枝杆菌(I bo vis )、鸟分枝杆菌(I a vium )、副结核分枝杆菌(M para tuberculosis )和布氏杆菌(^Brucella )引物的荧光引物与非荧光引物的最适浓度比例分别为10 :1、8 1,10 1,10 1,10 1 ；终浓度分别为 1. ΟμΜ/Ο. μΜ、1. ΟμΜ/Ο. 125μΜ、0. 75μΜ/0. 075μΜ、2. 0μΜ/0. 2μΜ、1. 0μΜ/0. μΜ ；
DNA聚合酶的用量为1. OU ；Mg2+浓度为3. OmM/L ；PCR退火温度56°C。步骤(2)所述杂交反应的条件为杂交温度为42°C，杂交时间为60min。本发明的有益效果是本发明可以实现对不同病原菌的快速，高通量检测，且具有较好的敏感性特异性，可以满足对相关病原菌检测的要求。寡核苷酸芯片技术是利用了反相杂交的原理，经过碱基互补配对的严谨性保证杂交反应具有高度的特异性。由于杂交体之间的氢键结合力弱于共价键，在杂交或洗涤时容易被破坏，因此需要通过提高杂交和洗涤的严谨性来提高检测特异性，降低错配和背景，提高信号强度。本发明根据已发表的M. tuberculosis、M. bovis、Μ. avium、Μ. paratuberculosis 和 Brucella 五种菌株序列选择保守区域(i/· tuberculosis H37Rv 的刚 基因、bo vis AN5 的 pncA 基因、a vian 的 gyrB 基因、para tuberculosis 的
基因、Brucella的J/A力基因序列)，综合考虑了引物区的保守性、扩增片段的大小、 多重PCR反应中退火温度等重要因素，精确设计引物和探针；
不对称PCR (asymmetric PCR)是用不等量的一对引物，经PCR扩增后产生大量的单链 DNA(ssDNA)0这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，在PCR反应的最初10 15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA，获得特异的探针互补单链靶片段，可最大限度获得荧光标记单链杂交模板，提高杂交效率，并可免去对称PCR扩增产物变性后杂交的步骤。本发明关键是控制限制性引物的绝对量以成功进行不对称PCR，当荧光引物与非荧光引物的比值越大，则扩增所得到的单链也就越多，但同时由于上下游引物用量的不平衡也会导致扩增效率的下降，荧光标记的产物的产量下降。荧光标记的产物以单链的形式存在无疑对于杂交反应是有益的，但产物的量的多少对于杂交信号的影响也不容忽视， 因此本发明对于荧光与非荧光引物的比例进行了优化；
随着生物技术的不断发展，对蛋白质、核酸及细胞标记的要求越来越高，传统的同位素标记方法已不能适应当今的发展。而发展起来的荧光探针技术已经在蛋白质、核酸、细胞检测及免疫分析等方面显现出巨大的潜能。荧光探针技术具备高度灵敏性和极宽的动态响应时间，可以使研究人员高灵敏和高选择性地检测复杂生物分子，包括活细胞中的特定成分。 尤其近年来发展起来的荧光化学传感器和分子信号系统更是使荧光探针技术的应用有了很大程度的提高和扩充。如今，它的应用已深入到药物学、生理学、环境科学、信息科学等诸多领域。随着生命科学的飞速发展，对活性高、特异选择性好和灵敏度高的新型荧光探针的需求就显得越来越迫切了。目前，用于标记或衍生的荧光探针主要有荧光素类、罗丹明类、 邻苯二甲醛类等化合物。其中荧光素及其衍生物在生物研究领域中占有极其重要的位置， 一百年来一直是化学及生物分析领域中研究的热点。本发明采用PCR反应荧光标记法标记将荧光素Cy3标记修饰在特异性下游引物在5'端，获得较大的掺合标记率和背景强度，PCR反应过程中，通过Taq酶把荧光标记的引物掺入到PCR产物中，在完成对样品荧光标记的同时实现了对目标片段的特异性扩增，因而使得荧光标记效率大大提高，能够满足基于寡合苷酸芯片检测的灵敏度要求，从而本发明的检测目的。探针浓度是影响探针特异性的重要因素，为了保证荧光信号强度，本发明综合考虑各种因素对检测效果的影响以及相互之间的影响作用，经过大量实验总结和分析，确定所用探针浓度选定为50 μ Μ,为成功筛选出5条特异探针制备牛结核及布病寡核苷酸芯片提供技术保证之一。综上所述，本发明以Genebank 上已公布的 i/· tuberculosis H37Rv、Μ. bo vis AN5、Μ. a vium、Μ. para tuberculosis和Brucella五种细菌的基因序列，分别选择i/· tuberculosis H37Rv 的 mp t40 基因、I bo vis AN5 的 pncA 基因、a vian 的 gyrB 基因、 paratuberculosis的IS-900基因、Brucella的J/姑基因序列为参考序列(Gene Bank检索号Μ. tuberculosis 检索号为S69737. 1 ;M . bovis 检索号为ΒΧΜ8341. 1 ;M. avium 检索号为NC_008595 ；Μ. paratuberculosis 检索号为S74401. 1 ；Brucella 检索号为 NC_006933. 1)，通过DNA star软件分析比较，设计了 12对引物用于比较分析，每种细菌挑选出一对特异性引物；克隆鉴定5种菌株的阳性质粒，构建质粒参比品；针对这个基因片段设计15条相应的寡核苷酸探针进行特异性的检测，最终筛选出5条灵敏度高、特异性强的探针点样，制备基因芯片；并最终确定 M. tuberculosis、M. bovis、Μ. paratuberculosis、Μ. avium和Brucella的荧光引物与非荧光引物最佳比率、最适DNA聚合酶的用量、最适Mg2+浓度、最适PCR退火温度、最佳杂交温度和最适杂交时间等重要条件，本发明确定了每条探针的cutoff值，当检测单一菌株时，检测的灵敏度可达到IO3 copies/^L ；假定五种病原菌同时存在时，检测的灵敏度可达到IO5 copies/^L。本发明基因芯片检测方法具有良好的重复性，批间批内变异系数CV值％均小于 15%。对致病菌待测样本的检测表现出了高的准确度，表明该方法特异性良好，灵敏度高， 实现了高通量、平行化检测，检测结果快速、准确，从核酸制备到完成检测，整个过程仅需 6 8h，在病原检测、进出口检疫、流行病学调查等方面具有广阔的前景。
图1结核分枝杆菌和牛分枝杆菌探针矩阵分布图2鸟分枝杆菌、副结核分枝杆菌及布氏杆菌探针矩阵分布图； 图3本发明基因芯片制备后外观； 图4牛分枝杆菌引物筛选电泳结果； 图5结核分枝杆菌引物筛选电泳结果； 图6鸟分枝杆菌引物筛选电泳结果； 图7副结核分枝杆菌引物筛选电泳结果； 图8布氏杆菌引物筛选电泳结果；
图9结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、鸟分枝杆菌、副结核分枝杆菌、布氏杆菌的重组阳性质粒鉴定结果；
图10结核分枝杆菌不同引物浓度比芯片的检测结果； 图11结核分枝杆菌不同引物浓度比芯片杂交结果；图12牛分枝杆菌不同引物浓度比芯片检测结果； 图13牛分枝杆菌不同引物浓度比芯片杂交结果； 图14鸟分枝杆菌不同引物浓度比芯片检测结果； 图15鸟分枝杆菌不同引物浓度比芯片杂交结果； 图16副结核分枝杆菌不同引物浓度比芯片检测结果； 图17副结核分枝杆菌不同引物浓度比芯片杂交结果； 图18布氏杆菌不同引物浓度比芯片检测结果； 图19布氏杆菌不同引物浓度比芯片杂交结果； 图20本发明检测用芯片外观及矩阵分布； 图21不同引物用量杂交信号图； 图22不同聚合酶用量芯片检测结果； 图23不同Mg2+浓度芯片检测结果； 图M不同退火温度芯片检测结果； 图25不同杂交温度芯片检测结果； 图26不同杂交时间芯片检测结果； 图27芯片特异性检测结果； 图观基因芯片检测灵敏度检测结果； 图四牛分枝杆菌灵敏度检测；
图30芯片检测结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、鸟分枝杆菌、副结核分枝杆菌、布氏杆菌致病菌灵敏度结果；
图31多重PCR灵敏性结果。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。实验材料 1.试剂
IOXBuffer,dNTPs,Ex-Taq酶、Mg2+等PCR相关试剂购自宝生物(大连)有限公司，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自TIANGEN生物技术有限公司；pGEM-T连接试剂、SDS、琼脂糖购自Promega生物技术有限公司。EDTA 缓冲液EDTA 0. 05g, NaCl 0. 05g, KCl 0. 05g, Na2HP04 0. 288g, KH2P04 0. 05g，加双蒸水至250mL，高压灭菌，4°C保存备用。PBS 缓冲液(ρΗ7· 3) =NaCl 8. 0g, KCl 0. 2g, Na2HP04 · 12H20 2. 9g, KH2P04 0. 2g, 加双蒸水至1，OOOmL,高压灭菌，4°C保存备用。TE (pH8. 0) =IOmmol/ L Tris-Cl (pH8. 0),lmmol/ L EDTA (ρΗ8· 0)。5 X TBE :54g Tris,27. 5g 硼酸，20mL 0. 5mol/ L EDTA (pH8. 0)，加三蒸水定容至 l，000mL。工作液浓度为IX。50XTAE :242g Tris,57. ImL 冰醋酸，IOOmL 0. 5mol/ L EDTA (ρΗ8·0)，加三蒸水至1，OOOmL。工作液浓度为1 X。DNA纯化试剂盒Ε. Ζ. N.A. TM Gel Extraction Kit和质粒快速提取试剂盒Ε. Z. N. A. TM Plasmid Mini Kit 为 Omega 公司产品。2.仪器
Sport Array 24基因芯片点样仪(美国Perkin Elmer), Scan array GX基因芯片扫描仪(美国I^erkin Elmer),Mai Tai生物芯片杂交仪(SciGene)，醛基化基因芯片片基、基因芯片点样液购自北京博奥生物技术有限公司、凝胶成像及分析系统(美国ABI公司)，高速冷冻离心机(美国Beckman Allegra)。PCR仪(英国Thermo Hykiid公司)，微量可调移液器(德国Eppendorf公司)，高压灭菌锅(Sanyo公司)，凝胶电泳仪(BIO-RAD公司)，1K15台式离心机(Sigma公司)、台式恒温振荡培养箱(德国GFL公司)。3.实验所用菌株
结核分枝杆菌 M. tuberculosis H37Rv、牛分枝杆菌 Μ· bovis AN5、Μ· avium、Μ· paratuberculosis标准株购自中国兽医药品监察所大肠杆菌、链球菌、葡萄球菌等均为常规市购菌株。4.探针、引物的合成及标记
寡核苷酸探针和引物由英潍捷基生物技术有限公司合成与标记。5.培养基及电泳试剂配制
LB液体培养基胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaC110g加单蒸水定容到lOOOmL，121 125°C高压灭菌15min，置4°C冰箱备用。制备LB固体培养基时，在其中加入琼脂粉15g，高压灭菌，无菌操作倒入灭菌平皿中，凝固后于温箱中培养过夜，4°C保存备用。LB固体培养基在LB液体培养基中加入琼脂粉至终浓度1. 5% (W/V)，121. 5°C高压灭菌15min后分装入灭菌平皿内，凝固后4°C保存备用。含Amp的LB固体培养基的制备LB固体培养基高压灭菌，冷却至50°C后加入终浓度为ΙΟΟμ g/mL的Amp，倒入平皿中，4°C保存备用。1. 5%的琼脂糖凝胶称取琼脂糖1. 5g放入锥形瓶，用IXTAE缓冲液定容至 lOOmL。其他试剂、材料、仪器和方法，除非特别说明，皆为本技术领域常规使用的试剂、材料、仪器和方法。实施例1
(一)本发明基因芯片引物的设计及筛选 1.引物的设计
以 Genebank ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov )已公布的i/· tuberculosis H37Rv、 Μ. bovis ΑΝ5、Μ. avium, Μ. paratuberculosis, Brucella
择 Μ. tuberculosis H37Rv 的刚基因、bo vis AN5 的 pncA 基因、a vian 的 gyrB 基因、paratuberculosis的IS-900基因、Brucella的基因序列为参考序列(Gene Bank 检索号M. tuberculosis 检索号为S69737. 1 ；M . bovis 检索号为BX248;341. 1 ；Μ. avium 检索号为NC_008595 ；Μ. paratuberculosis 检索号为S74401. 1 ；Brucella 检索号为NC_006933. 1)，通过DNA star软件分析比较，选取无变异或变异最小的片段，利用 Primer Premier5. O和01iga6. O软件分别设计多对引物引物用于比较分析，本实施例分别选取2 3对引物，将其详细信息列于表1。表1引物的详细信息
权利要求
1.一种应用于检测样本中多种病菌的寡核苷酸芯片，包括基底和固定于该基底上的探针，其特征在于所述探针可分别与结核分枝杆菌(#. tokrcWosis)、牛分枝杆菌(I bo vis )、鸟分枝杆菌(I a vium )、副结核分枝杆菌(M para tuberculosis )禾Π布氏杆菌 {Brucella)的PCR扩增产物进行杂交反应；所述探针是以 Genebank 上已公布的 i/· tuberculosis H37Rv、M. bo vis AN5、M. avium、 M.力ercWosis和^raceBa五种细菌的基因序列，分别选择i/· tuberculosis H37Rv的 mp t40 基因、bo vis AN5 的 pncA 基因、a vian 的 gyrB 基因、para tuberculosis 的IS-900基因、Brucella的W姑基因序列为参考序列，设计引物，筛选得到；所述引物分别具有 SEQ ID NO :3 禾口 SEQ ID NO 4 ；SEQ ID NO :9 禾口 SEQ ID NO 10 ；SEQ ID NO: 11 禾口 SEQ ID NO 12 ；SEQ ID NO: 17 禾口 SEQ ID NO 18 ；SEQ ID N0:23 禾口 SEQ ID NO: M所示的核苷酸序列；所述探针分别具有 SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 31、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO 37 和 SEQ ID NO 39所示的核苷酸序列；上述引物中所有下游引物在5’端进行Cy3标记；所述探针在3’端进行氨基修饰。
2.—种权利要求1所述基因芯片在检测多种病菌方面的应用，其特征在于包括以下步骤(1)应用权利要求1所述的引物和探针，将探针点样至基因基片上；(2)基因基片上的探针与待测病菌菌株的PCR扩增产物进行杂交反应；所述待测病菌为结核分枝杆菌(i/· to力ercWosis)、牛分枝杆菌力oris)、鸟分枝杆菌ariw )、副结核分枝杆菌(M. para tuberculosis )和布氏杆菌{Brucella )；(3)杂交反应后将洗涤干燥后芯片经扫描仪扫描获取杂交信号。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于步骤(2)所述PCR扩增为五重PCR不对称反应体系，扩增条件为所述结核分枝杆菌Ql tuberculosis )、牛分枝杆菌(I bo vis )、鸟分枝杆菌(I a vium )、副结核分枝杆菌(M para tuberculosis )和布氏杆菌(^Brucella )引物的荧光引物与非荧光引物的最适浓度比例分别为10 :1、8 1,10 1,10 1,10 1 ；终浓度分别为 1. ΟμΜ/Ο. μΜ、1. ΟμΜ/Ο. 125μΜ、0. 75μΜ/0. 075μΜ、2. 0μΜ/0. 2μΜ、1. 0μΜ/0. μΜ ；DNA 聚合酶的用量为1. OU ；Mg2+浓度为3. 0mM/L ；PCR退火温度56°C。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于步骤(2)所述杂交反应的条件为杂交温度为42 °C，杂交时间为60min。
全文摘要
本发明一种寡核苷酸基因芯片及其在检测多种病菌方面的应用。所述寡核苷酸基因芯片的探针可分别与结核分枝杆菌(M．tuberculosis)、牛分枝杆菌(M.bovis)、鸟分枝杆菌(M.avium)、副结核分枝杆菌(M.paratuberculosis)和布氏杆菌(Brucella)的PCR扩增产物进行杂交反应；所述探针分别具有SEQIDNO25、SEQIDNO31、SEQIDNO35、SEQIDNO37和SEQIDNO39所示的核苷酸序列。本发明所述基因芯片应用于检测所述病菌具有良好的重复性，批间批内变异系数CV值％均小于15％。对致病菌待测样本的检测表现出了高的准确度，表明该方法特异性良好，灵敏度高，实现了高通量、平行化检测，检测结果快速、准确，从核酸制备到完成检测，整个过程仅需6～8h，在制备病原检测、进出口检疫、流行病学分析用的试剂和产品等方面具有广阔的前景。
文档编号C12Q1/04GK102260738SQ20111014252
公开日2011年11月30日 申请日期2011年5月30日 优先权日2011年5月30日
发明者李守军, 林志雄, 贾坤 申请人:华南农业大学