专利名称：一种耐碱性低温α-半乳糖苷酶AgaAJB13及基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体地说是一种耐碱性低温α -半乳糖苷酶 AgaAJB13及其基因。
背景技术：
α -半乳糖苷酶即蜜二糖酶(1，6-α -d-galactoside galactohydrolase ； α -galactosidase ；melibiase ；EC 3. 2. 1. 22)，可移除不同底物中α-连接的末端非还原性D-半乳糖，包括蜜二糖、棉子糖、水苏糖和毛蕊花糖等低聚糖底物及半乳甘露聚糖等多聚糖底物。这些多糖广泛存在于食品和饲料原料中，特别是豆类植物的种子中，如豆粕、棉柏和菜粕等(Karr-Lilienthal et al. Livest Prod Sci, 2005，97: 1-12·)。α-半乳糖苷酶可应用于饲料、食品、造纸和医疗行业中。在饲料业中，α-半乳糖苷酶制剂可以促进营养物质的消化并消除或减少饲料组成中的抗营养因子(棉子糖等低聚糖)对营养物质消化的副作用，从而改善了动物的生产性能，降低饲料成本；在食品业中，α-半乳糖苷酶制剂可以降低棉子糖等在豆奶中的含量，增加人类对豆类营养的吸收；α-半乳糖苷酶还可提高纸张的漂白效果及治疗Fabry疾病等(Cao et al. Appl Microbiol Biotechnol, 2009，83: 875 - 884·)。α-半乳糖苷酶广泛存在于细菌、放线菌、真菌和植物中。根据氨基酸序列相似性， α -半乳糖苷酶被划分到糖苷水解酶第4、27、36和57家族，绝大多数α -半乳糖苷酶属于糖苷水解酶第27和36家族。真核生物来源的α-半乳糖苷酶多数属于27家族，而原核生物来源α -半乳糖苷酶基本都属于36家族(Finn et al. Nucleic Acids Res, 2008，36: D281-D288.)。但是，目前所报导的α -半乳糖苷酶多为中温或高温酶及耐酸性或耐中性 PH酶，同时具有耐碱性和低温活性的(0 -20°C) α-半乳糖苷酶还未曾报导。
发明内容
本发明的目的是提供一种耐碱性低温α -半乳糖苷酶。本发明的再一目的是提供编码上述α -半乳糖苷酶的基因。本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。本发明所述α-半乳糖苷酶AgaAJB13可得自鞘氨醇单胞菌(分力切卯/^/ sp.)， tWSphingobium estrogenivorans ATCC BAA-1367 AgaAJB 13 的M基酸序歹lj如 SEQ ID NO. 1所示。该酶总共含738个氨基酸，其中N端23个氨基酸为其预测的信号肽序列 “MVMRRffGAALAAATMLAAAPAHA“ (SEQ ID N0. 2)。因此，成熟的α -半乳糖苷酶AgaAJB13的理论分子量为80. OkDa，其氨基酸序列如 SEQ ID N0. 3 所示。本发明的0-半乳糖苷酶々8仏邛13的最适？!1值为5.0，在？!14.5-6.0的范围内维持80%以上的酶活性；经pH4. 0-11.0的缓冲液处理lh，酶活剩余35%以上；最适温度为 60°C，在10°C和20°C分别具有10%和20%以上的酶活，具有低温酶的低温催化特性；在37°C 和60°C下的半衰期>60min，具有良好的热稳定性；可水解豆粕、棉粕和棉籽糖；经胰蛋白酶和蛋白酶K处理Ih后，AgaAJB 13仍能分别保持102. 1%和114. 0%的酶活。本发明提供了编码上述α-半乳糖苷酶的基因a^A/Z^J，该基因序列如SEQ ID NO. 4所示。DNA序列结构分析结果表明，α -半乳糖苷酶基因agaAJB13编码信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。α -半乳糖苷酶基因agaAjm3编码成熟肽的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。本发明通过PCR的方法分离克隆了 α-半乳糖苷酶AgaAJB13的编码基因 agaAJB13,其全长2217bp，起始密码为ATG，终止密码为TAG。经BLAST比对，该α -半乳糖苷酶基因J编码的氨基酸序列与GenBank中Acidobacterium sp. MP5ACTX8来源的潜在α -半乳糖苷酶(EFI56085)具有最高的一致性，为59. 2% ；与确证活性的
corymb if era IFO 8084来源α -半乳糖苷酶(AAF68953)的一致性为40. 1%。说明α-半乳糖苷酶AgaAJB13是一种新的α-半乳糖苷酶。本发明还提供了包含上述α-半乳糖苷酶基因的重组载体，优选为 m~agaAJB130将本发明的α -半乳糖苷酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，将本发明的α-半乳糖苷酶基因插入到质粒ρΕΤ48ει ( + )上的feoRI和历ii/III限制性酶切位点之间，得到重组大肠杆菌表达质粒m_agaAjm30本发明还提供了包含上述α -半乳糖苷酶基因的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株见力^^岁/^^/拟义本发明的制备α -半乳糖苷酶AgaAJB13的方法按以下步骤进行
1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组α-半乳糖苷酶表达； 3)回收并纯化所表达的α-半乳糖苷酶AgaAJB13。其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21 (DE3 )，得到重组菌株BL21 (DE3) ZagaAJBLS0本发明提供了一个新的α-半乳糖苷酶基因，其编码的α-半乳糖苷酶最适 pH5. 0 ；在10°C和20°C下分别具有10%和20%以上的酶活；经0. IM pHll. 0缓冲液37°C处理lh，仍能保持约40%的活性，作用温度范围较广，良好的热稳定性和蛋白酶抗性；较好的水解各种自然底物的能力，可广泛的应用于饲料和食品等行业。
图1 在大肠杆菌中表达的重组α -半乳糖苷酶的SDS-PAGE分析，其中，M 低分子量蛋白质Marker ；1 纯化的重组α -半乳糖苷酶。图2 重组α -半乳糖苷酶的最适ρΗ。图3 重组α -半乳糖苷酶的ρΗ稳定性。图4 重组α -半乳糖苷酶的最适温度。
图5 重组α -半乳糖苷酶的热稳定性。
具体实施例方式试验材料和试剂
1、菌株及载体鞘氨醇单胞菌(分力切卯况“ sp.)同文献报道菌种性质，如 Sphingobium estrogenivorans ATCC BAA—1367 ；lif Escherichia coli BL21 (DE3) 和表达载体pET18a ( + )可购于Novagen公司。2、酶类及其它生化试剂限制性内切酶、DNA聚合酶、连接酶和dNTP购自TaKaRa ^W] ；/7NPG (/7-nitrophenyl- α -d-galactopyranoside)J)^ g Sigma ^w] 5 ^ /^ 剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。3、培养基
LB 培养基=Peptone 10g, Yeast extract 5g, NaCl 10g，加蒸馏水至 1000ml，pH 自然 (约为7)。固体培养基在此基础上加2. 0% (w/v)琼脂。说明以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。 实施例1 α -半乳糖苷酶基因agaAJB13的克隆
提取鞘氨醇单胞菌基因组DNA:将液体培养2d的菌液离心取菌体，加入ImL溶菌酶，37°C处理60min，再加入裂解液，70°C水浴裂解60min，每隔IOmin混勻一次，在4°C下 IOOOOrpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇， 于室温静置5min后，4°C下IOOOOrpm离心lOmin。弃上清，沉淀用70%的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于_20°C备用。 根据糖苷水解酶第36家族的保守序列([F/L/V]-[L/V]_[L/M/V]-D-D-G-W-F和 E-P-E-M-[V/I]-[N/S]_[P/E])设计合成了简并引物 GH36F 和 GH36R (表 1)。
权利要求
1.一种耐碱性低温α-半乳糖苷酶AgaAJB13，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.如权利要求1所述的耐碱性低温α-半乳糖苷酶AgaAJB13，其特征在于所述α-半乳糖苷酶AgaAJB13的信号肽序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.如权利要求1所述的耐碱性低温α-半乳糖苷酶AgaAJB13，其特征在于所述α-半乳糖苷酶AgaAJB13的成熟肽序列如SEQ ID NO. 3所示。
4.一种编码权利要求1所述的耐碱性低温α -半乳糖苷酶AgaAJB13的α -半乳糖苷酶基因a^aA/^J，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
5.如权利要求4所述的α-半乳糖苷酶基因eigeiAJB13，其特征在于所述α -半乳糖苷酶基因编码信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
6.如权利要求4所述的α-半乳糖苷酶基因eigeiAJB13，其特征在于所述α -半乳糖苷酶基因编码成熟肽的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
7.一种包含权利要求4所述α-半乳糖苷酶基因a^aA^A 的重组载体。
8.一种包含权利要求4所述α-半乳糖苷酶基因的重组菌株。
全文摘要
本发明涉及一种耐碱性低温α-半乳糖苷酶AgaAJB13及其基因。本发明提供了一种来源于鞘氨醇单胞菌(Sphingobiumsp.)的α-半乳糖苷酶AgaAJB13，其氨基酸序列如SEQID NO.1所示，且提供了编码上述α-半乳糖苷酶的编码基因agaAJB13，及包含α-半乳糖苷酶基因agaAJB13的重组载体和包含α-半乳糖苷酶基因agaAJB13的重组菌株。α-半乳糖苷酶具有以下性质最适pH5.0；最适温度60℃，在10℃和20℃下分别具有10%和20%以上的酶活；经0.1MpH11.0缓冲液在37℃下处理1h，仍能保持~40%的活性；良好的热稳定性和蛋白酶抗性；较好的水解各种自然底物的能力；可作为一种饲料或食品添加剂应用于饲料与食品行业。
文档编号C12N15/63GK102220301SQ201110142558
公开日2011年10月19日 申请日期2011年5月30日 优先权日2011年5月30日
发明者周峻沛, 唐湘华, 李俊俊, 潘璐, 董岩岩, 许波, 高雅洁, 黄遵锡 申请人:云南师范大学