专利名称：一种猪细小病毒lamp快速检测引物、检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种环介导等温扩增(LAMP)技术快速检测猪细小病毒的检测试剂盒及其检测方法，属于兽用生物制品领域中疫病诊断技术。
背景技术：
猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)可引起猪的繁殖障碍，广泛存在于世界各地的猪群中，在临床上以受感染母猪产出死胎、畸形胎、木乃伊胎及病弱仔猪为特征，给世界各主要养猪地区的规模化养猪业造成了严重经济损失，也是成为当前危害我国养猪业的主要疫病之一。随着高度集约化养猪业的发展，PPV的防治备受关注。猪的许多疾病可以引起相似临床症状，根据临床症状很难做出初步诊断，病理学变化也只能作出初步诊断。因此，临·床快速诊断具有十分重要的意义。目前，国内外已建立了猪细小病毒的分离培养鉴定、免疫组织化学、PCR及荧光定量PCR等病毒抗原的检测方法；随着猪细小病毒病疫苗的应用，两种病毒抗体检测诊断学作用受到了影响。而病毒分离鉴定技术要求较高，费时，不利于快速检测与诊断。PCR及荧光定量PCR方法在检测方面虽然有很多优势，但都需要昂贵的仪器，且操作复杂，不适于现场快速诊断，同时由于检测成本较高，也加大了推广应用的难度。环介导的等温核酸扩增技术(LAMP)是由T. Notomi等发明的一种新型核酸扩增技术(Notomi, T. , et al. , Loop-mediated isothermal amplification of DNA. NucleicAcids Res. 2000，28，e63.)，该技术依赖4条特异设计的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可以高效、高特异地扩增靶序列。近年来，国外已将该技术广泛应用于病原体检测。现有技术中已经有猪细小病毒LAMP检测试剂盒及其检测方法，CN10157565A和CN101818212A均公开了一种猪细小病毒LAMP检测试剂盒及其检测方法，公开了相应的设计的引物，但是在实际使用过程中，还是存在检测试剂盒的配置不够合理，反应体系不够稳定，以及所设计引物的针对性和灵敏度不够高等缺陷。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述缺陷，研制一种实用的猪细小病毒LAMP检测试剂盒及其检测方法。本发明的技术方案是一种猪细小病毒LAMP检测试剂盒，包括以下成分(I)反应液 A 含有IOXLamp buffer, Bst DNA 聚合酶 8U/μ 1、2· 5 mM dNTP、20-50 μ M 内引物
1,20-50 μ M 内引物 2、3-6μΜ 外引物 1、3_6μΜ 外引物 2,15-25 μ M LooP 引物 1、15_25μΜLooP引物2，甜菜碱(5Μ)，灭菌超纯水，其中I) IOXLamp buffer 含有 200mM Tris-HCl (pH 8· 8，25°C )、IOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和I %曲拉通X-IOO ；2)引物的序列为内引物 I 为GTCCTCCTGTATTGGAGTTGCTGTTTTTCCACATCAGTGAAAACTTCG内引物 2 为CGAGCCAACAACACCAACTTTTTTGTCCGTATTGCTGAATCTGG外引物I 为ACACCAACAGACTCTCAGA外引物2 为GGTTTCTATTTCCGACCAAGLP 引物 I 为CGTAGTTGTTGTCCGCTGG LP 引物 2 为CAACCTGCACTTAACTCCAACA(2)反应液 B :1000XSYBR Green I。猪细小病毒LAMP检测试剂盒，其反应液A每管22 μ I的组成2. 5 μ I10 X LampbufferU. O μ I Bst DNA 聚合酶(8υ/μ1)、4μ1 2. 5 mM dNTP,O. 5 μ I 20-50 μ M内引物 1、0·5μ 1 20-50μΜ 内引物 2、0· 5μ I 3-6 μ M 外引物 1、0· 5 μ I 3-6 μ M 外引物 2、O. 5 μ 115-25 μ M LooP 引物 1、0· 5μ I 15-25 μ M LooP 引物 2，5μ I 甜菜碱(5Μ)和 6· 5 μ I灭菌超纯水。猪细小病毒LAMP检测试剂盒检测猪细小病毒的检测方法，其步骤包括(I)组织样品中DNA的提取①样品的采集濒死猪、扑杀的成年猪和幼龄猪、流产胎儿取肾、肺、肝和脑等组织；待检活猪，用注射器取血2 4mL，立即送往实验室；②样品的处理每份样品分别处理；③组织样品处理取待检病料约O. Ig置研磨器中剪碎并研磨，加入I. 5mL生理盐水继续研磨。取已研磨好的待检组织液，置I. 5mL灭菌离心管中，8000g离心5min，取上清445μ L，加入 10% SDS 50 μ L，蛋白酶 K(5mg/ml) 5 μ L，混匀后，置 55°C 水浴中 Ih ；④血清样品处理待血液凝固后，取上清放于离心管中，4°C 8000g离心5min，取上清IOOyL,置1.5mL灭菌离心管中，加入345yL消化液，10% SDS50 μ L，蛋白酶K(5mg/ml) 5 μ L，混匀后，置55°C水浴中Ih ；⑤取出已处理的待检样品，每管加入500 μ L酚/氯仿/异戊醇混合液(比例为24 23 1，用之前不要晃动，不要吸到酚/氯仿/异戊醇液上层保护液)，用力颠倒10次混勻，12 OOOg 离心 IOmin ；⑥取上清450 μ L置I. 5mL灭菌离心管中，加入两倍体积的无水乙醇、45“11^六((3厘)，混匀，-201中301^11。取出离心管，室温融化，_4°C 12 OOOg离心15min ;⑦弃上清，沿离心管开口方向管壁缓缓滴入lml-20°C预冷的75%乙醇溶液，轻轻旋转洗一次后倒掉，将离心管倒扣于吸水纸上lmin，真空抽干15min ；⑧取出离心管，用30 μ L灭菌超纯水溶解沉淀，作为模板备用；(2)猪细小病毒的环介导等温扩增在装有22 μ I反应液A的反应管中加入3 μ I待检DNA，于62_64°C恒温水浴箱中放置43min ；(3)扩增产物的显色检测在上述反应结束后，加入I μ I反应液B直接用肉眼观察颜色变化，如颜色变为绿色，则说明样品中含有猪细小病毒；如果颜色为橙色，说明待检样品不含猪细小病毒(见附图I)。本发明与现有技术相比，其优点和积极效果表现在本发明建立了猪细小病毒LAMP检测试剂盒及其检测方法，本方法根据猪细小病毒的基因保守区的六个序列设计了两个特异性内引物和两个特异性外引物及两个环引物，该保守基因序列为猪细小病毒所共有，并且该套引物不同于已公布的猪细小病毒LAMP检测引物，其特异性、敏感性及扩增效率都有明显提升；尤为重要的是本方法试剂配置更加合理，试剂盒的特异性、敏感性和稳定性都进行了改进，增加了检测工作中的可靠性，本发明试剂盒最低检测量可达12fgPPVDNA,反应时间缩短仅为43min。本发明采用LAMP技术，特异性强，比PCR检测方法有更高的灵敏度，但不需要昂贵的PCR仪，只需普通的金属浴或水浴箱即可，简单而快速。可用于猪细小病毒的检测，特别适合于基层现场应用。本发明解决了现有技术中检测猪细小病毒的方法所需周期长、灵敏度较低、成本高、现场应用困难等缺陷，提供的猪细小病毒的检测试剂盒及其检测方法，对猪细小病毒进行LAMP检测，快速、准确性高、灵敏性好、现场应用方便，可广泛应用于兽医、食品、出入境检疫等领域。
图I :猪细小病毒LAMP检测显色结果图。I反应管中液体绿色说明样品为阳性。2反应管中液体橙色说明样品为阴性；图2 :本发明试剂盒特异性检测结果1 PPV ；2 PPV ；3 PCV2 ；4 =PRRSV ；5 =PEDV ；6 =CSFV ；7 :阴性对照。图3 :本发明试剂盒敏感性检测结果1 :10^1稀释；2 :10_2稀释；3 :10_3稀释；4 10_4稀释；5 :10_5稀释；6 :10_6稀释；7 :10_7稀释；8 :10_8稀释；9 :10_9稀释；10 :阴性对照。
具体实施例方式下列实例进一步说明本发明，但不应该当作本发明的限制。实施例I按下列配方制作猪细小病毒的环介导等温扩增检测试剂盒；I.猪细小病毒LAMP检测试剂盒检测猪细小病毒的检测方法，其步骤包括(I)组织样品中DNA的提取①样品的采集濒死猪、扑杀的成年猪和幼龄猪、流产胎儿取肾、肺、肝和脑等组织；待检活猪，用注射器取血2 4mL，立即送往实验室；②样品的处理每份样品分别处理；③组织样品处理取待检病料约O. Ig置研磨器中剪碎并研磨，加入I. 5mL生理盐水继续研磨。取已研磨好的待检组织液，置I. 5mL灭菌离心管中，8000g离心5min，取上清445μ L，加入 10% SDS 50 μ L，蛋白酶 K(5mg/ml) 5 μ L，混匀后，置 55°C 水浴中 Ih ；④血清样品处理待血液凝固后，取上清放于离心管中，4°C 8000g离心5min，取上清IOOyL,置1.5mL灭菌离心管中，加入345yL消化液，10% SDS50 μ L，蛋白酶K(5mg/ml) 5 μ L，混匀后，置55°C水浴中Ih ；⑤取出已处理的待检样品，每管加入500 μ L酚/氯仿/异戊醇混合液(比例为24 23 1，用之前不要晃动，不要吸到酚/氯仿/异戊醇液上层保护液)，用力颠倒10次混勻，12 OOOg 离心 IOmin ；⑥取上清450 μ L置I. 5mL灭菌离心管中，加入两倍体积的无水乙醇、45“11^六((3厘)，混匀，-201中301^11。取出离心管，室温融化，_4°C 12 OOOg离心15min ;⑦弃上清，沿离心管开口方向管壁缓缓滴入lml-20°C预冷的75%乙醇溶液，轻轻旋转洗一次后倒掉，将离心管倒扣于吸水纸上lmin，真空抽干15min ；⑧取出离心管，用30 μ L灭菌超纯水溶解沉淀，作为模板备用；
2.猪细小病毒LAMP试剂盒中LAMP反应试剂包括以下成分(I)反应液 A 含有IOXLamp buffer, Bst DNA 聚合酶 8U/μ 1、2· 5 mM dNTP、20-50 μ M 内引物
1,20-50 μ M 内引物 2、3-6μΜ 外引物 1、3_6μΜ 外引物 2,15-25 μ M LooP 引物 1、15_25μΜLooP引物2，甜菜碱(5Μ)，其中I) IOXLamp buffer 含有 2OOmM Tris-HCl(pH 8· 8，25O )、IOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和I %曲拉通X-100 ；2)所含引物序列为内引物 I 为GTCCTCCTGTATTGGAGTTGCTGTTTTTCCACATCAGTGAAAACTTCG内引物 2 为CGAGCCAACAACACCAACTTTTTTGTCCGTATTGCTGAATCTGG外引物I 为ACACCAACAGACTCTCAGA外引物2 为GGTTTCTATTTCCGACCAAGLP 引物 I 为CGTAGTTGTTGTCCGCTGGLP 引物 2 为CAACCTGCACTTAACTCCAACA(2)反应液 B :1000XSYBR Green I。猪细小病毒LAMP检测试剂盒反应液A每次反应由22 μ I组成，其配制如下
2.5μ I IOXLamp bufferU. 0μ I Bst DNA 聚合酶(8U/μ I)、4 μ I 2. 5 mM dNTP,O. 5 μ I40μΜ内引物1、0· 5μ I 40μΜ内引物2、0· 5μ I 5μΜ外引物1、0· 5μ I 5μΜ夕卜弓I物2、O. 5μ I 20 μ M LooP 引物 1、0·5μ I 20 μ M LooP 引物 2，5 μ I 甜菜碱(5Μ)和 6· 5 μ I 灭菌超纯水。(2)猪细小病毒的环介导等温扩增在装有22 μ I反应液A的反应管中加入3 μ I待检DNA，于62_64°C恒温水浴箱中放置43min ；(3)扩增产物的显色检测在上述反应结束后，加入μ I反应液B，直接用肉眼观察颜色变化，如颜色变为绿色，则说明样品中含有猪细小病毒；如果颜色为橙色，说明样品不含猪细小病毒。试验例I :本发明试剂盒在检测PPV中的应用效果特异性、敏感性和稳定性。一、特异性I. I毒株细小病毒(PPV SC株)，伪狂犬(PRVLA株)，圆环病毒2型(PCV2)，猪蓝耳病病毒(PRRSV)，猪流行性腹泻(PEDV)和猪瘟(SFV)由山东省滨州畜牧兽医研究院保存。I· 2提取待检测组织样品DNAI. 3检测体系各组分配比如下
猪细小病毒LAMP检测试剂盒反应液A由22 μ I组成，其配制如下2. 5μ IIOXLamp bufferU. 0μ I Bst DNA聚合酶(8U/μ I)、4 μ I 2. 5 mM dNTP、0. 5 μ 140 μ M 内弓I物 1、0. 5μ1 40μΜ 内引物 2、0. 5μ I 5μΜ外引物 1、0. 5μ I 5μΜ外引物 2、0. 5μ I 20 μ MLooP引物1、0· 5μ I 20 μ M LooP引物2，5μ I甜菜碱(5Μ)和6. 5 μ I灭菌超纯水。I. 4猪细小病毒的环介导等温扩增反应在装有22 μ I反应液A的反应管中加入3 μ I待检DNA，于62_64°C恒温水浴箱中放置43min ；I. 5扩增产物的显色检测 在上述反应结束后，加入I μ I反应液B，直接用肉眼观察颜色变化，如颜色变为绿色，则说明样品中含有猪细小病毒；如果颜色为橙色，说明样品不含猪细小病毒。I. 6试剂盒的特异性结果结果如图2所示，用本试剂盒可特异检测PPV，检测结果为阳性，出现特异性的绿色荧光。而其它六种与PPV相关病毒的核酸及采自健康猪组织提取的DNA(阴性对照)检测结果均为阴性，没有出现特异性的绿色荧光，表明本试剂盒具有很高的特异性。二、敏感性2. I 样品PPVDNA (原始浓度为 12ng/ μ I)2. 2样品处理将PPVDNA (原始浓度为12ng/ μ I)做ΚΓ-ΙΟ—8的倍比稀释。2. 3检测体系各组分配比如下猪细小病毒LAMP检测试剂盒反应液A由22 μ I组成，其配制如下2. 5μ I IOXLamp bufferU. Ομ I Bst DNA聚合酶(8U/μ I)、4 μ I 2. 5 mM dNTP、0·5μ 140μΜ内引物1、0·5μ I 40μΜ内引物2、0· 5μ I 5μ M外引物1、0· 5μ I 5μΜ夕卜弓丨物
2、0·5μ I 20 μ M LooP 引物 1、0·5μ I 20 μ M LooP 引物 2，5 μ I 甜菜碱(5Μ)和 6· 5 μ I 灭菌
超纯水。2. 4猪细小病毒的环介导等温扩增反应在装有22 μ I反应液A的反应管中加入3 μ I待检DNA，于62_64°C恒温水浴箱中放置43min ；2. 5扩增产物的显色检测在上述反应结束后，加入I μ I反应液B，直接用肉眼观察颜色变化，如颜色变为绿色，则说明样品中含有猪细小病毒；如果颜色为橙色，说明样品不含猪细小病毒。2. 6试剂盒的敏感性结果结果如图3所示，试验结果表明采用本发明试剂盒最低检测12 fg PPV DNA，表明本发明试剂盒具有很高的敏感性。三、稳定性3. I样品PPV阳性样品3. 2样品处理同一批样本由3位不同人员间隔3 d、7 d用本发明建立的检测试剂盒分别检测3次。3. 3检测体系各组分配比如下猪细小病毒LAMP检测试剂盒反应液A由22 μ I组成，其配制如下2. 5μ IIOXLamp bufferU. 0μ I Bst DNA聚合酶(8U/μ I)、4 μ I 2. 5 mM dNTP、0. 5 μ 140 μ M 内弓I物 1、0·5μ1 40μΜ 内引物 2、0· 5μ I 5μΜ 外引物 1、0· 5μ I 5μΜ 夕卜弓 I物 2、0· 5μ I 20 μ MLooP引物1、0· 5μ I 20 μ M LooP引物2，5μ I甜菜碱(5Μ)和6. 5 μ I灭菌超纯水。3. 4猪细小病毒的环介导等温扩增反应在装有22 μ I反应液A的反应管中加入3 μ I待检DNA，于62_64°C恒温水浴箱中放置43min ；3. 5扩增产物的显色检测在上述反应结束后，加入I μ I反应液B，直接用肉眼观察颜色变化，如颜色变为绿色，则说明样品中含有猪细小病毒；如果颜色为橙色，说明样品不含猪细小病毒。3. 6试剂盒的稳定性结果 试验结果表明采用本发明试剂盒检测样本的批间变异系数为4.7%，表明本发明试剂盒具有很高的稳定性。
权利要求
1.一种猪细小病毒LAMP检测试剂盒，包含提取DNA试剂和LAMP反应试剂两个组分，其特征在于所述的反应试剂包括以下成分 (1)根据权利要求I中所描述的一种猪细小病毒LAMP检测试剂盒的DNA提取试剂包括浓度10%的SDS、浓度5mg/ml的蛋白酶K和浓度3M的NaAC。
(2)根据权利要求I中所描述的一种猪细小病毒LAMP检测试剂盒的反应液含有IOXLamp buffer, Bst DNA 聚合酶 8U/μ 1、2· 5 mM dNTP、20-50 μ M 内引物 I、20-50 μ M 内引物 2、3-6μΜ外引物 1、3-6“] 外引物2、15-254]\1 LooP 引物 1、15_25μΜ LooP 引物 2，甜菜碱(5Μ)，其中 IOXLamp buffer 含有 200mM、pH 8. 8、25°C 的 Tris-HCl，IOOmM 氯化钾、IOOmM 硫酸铵、.20mM硫酸镁和I %曲拉通X-100 ；
2.根据权利要求I中所描述的一种猪细小病毒LAMP检测试剂盒的所含引物序列为 内引物 I 为GTCCTCCTGTATTGGAGTTGCTGTTTTTCCACATCAGTGAAAACTTCG 内引物 2 为CGAGCCAACAACACCAACTITITTGTCCGTATTGCTGAATCTGG 外引物 I 为ACACCAACAGACTCTCAGA 外引物 2 为GGTTTCTATTTCCGACCAAG LP 引物 I 为CGTAGTTGTTGTCCGCTGG LP 引物 2 为CAACCTGCACTTAACTCCAACA
3.根据权利要求I中所描述的一种猪细小病毒LAMP检测试剂盒反应液B:1000 X SYBRGreen I。
4.根据权利要求I中所描述的一种猪细小病毒LAMP检测试剂盒，其特征在于反应液A每次反应由 22μ I 组成2· 5μ I IOXLamp bufferU. 0μ I Bst 的 8U/μ I 的 DNA 聚合酶、.4μ I 2. 5 mM dNTP,O. 5 μ I 20-50 μ M 内引物 I、0· 5 μ I 20-50 μ M 内引物 2、0· 5 μ I 3-6 μ M外引物 1、0·5μ1 3-6μΜ 外引物 2、0. 5μ I 15-25 μ M LooP 引物 1、0· 5 μ 115-25 μ M LooP引物2，5 μ I的5Μ甜菜碱和6. 5 μ I灭菌超纯水。
5.根据权利要求I中所描述的一种猪细小病毒LAMP检测试剂盒检测猪细小病毒的检测方法，其步骤包括 (I)组织样品中DNA的提取 ①样品的采集濒死猪、扑杀的成年猪和幼龄猪、流产胎儿取肾、肺、肝和脑等组织；待检活猪，用注射器取血2 4mL，立即送往实验室； ②样品的处理每份样品分别处理； ③组织样品处理取待检病料约O.Ig置研磨器中剪碎并研磨，加入I. 5mL生理盐水继续研磨。取已研磨好的待检组织液，置I. 5mL灭菌离心管中，8000g离心5min，取上清.445 μ L，加入10% SDS 50μ L，5y L的5mg/ml蛋白酶K，混匀后，置55°C水浴中Ih ； ④血清样品处理待血液凝固后，取上清放于离心管中，4°C8000g离心5min，取上清.100 μ L,置I. 5mL灭菌离心管中，加入345 μ L消化液，10% SDS50 μ L, 5 μ L的5mg/ml蛋白酶K，混匀后，置55°C水浴中Ih ； ⑤取出已处理的待检样品，比例为24 23 1，用之前不要晃动，不要吸到酚/氯仿/异戊醇液上层保护液的每管加入500 μ L酚/氯仿/异戊醇混合液，用力颠倒10次混匀，12OOOg 离心 IOmin ；⑥取上清450μ L置I. 5mL灭菌离心管中，加入两倍体积的无水乙醇、45 μ 13Μ的NaAC，混匀，_20°C中30min。取出离心管，室温融化，-4°C 12000g离心15min ； ⑦弃上清，沿离心管开口方向管壁缓缓滴入lml-20°C预冷的75%乙醇溶液，轻轻旋转洗一次后倒掉，将离心管倒扣于吸水纸上lmin，真空抽干15min ； ⑧取出离心管，用30μ L灭菌超纯水溶解沉淀，作为模板备用； (2)猪细小病毒的环介导等温扩增 在装有22 μ I反应液A的反应管中加入3 μ I待检DNA，于62_64°C恒温水浴箱中放置43min ； (3)扩增产物的显色检测 在上述反应结束后，加入Ιμ I反应液B :直接用肉眼观察颜色变化，颜色变为绿色，则说明样品中含有猪细小病毒；颜色为橙色，说明样品不含猪细小病毒。
全文摘要
本发明涉及一种用环介导等温扩增(LAMP)技术快速检测猪细小病毒的检测试剂盒及检测方法。本发明含有10×Lamp buffer、Bst DNA聚合酶8U/μl、10mM dNTP、20-50μM内引物1、20-50μM内引物2、3-6μM外引物1、3-6μM外引物2、15-25μM LooP引物1、15-25μM LooP引物2和5M甜菜碱的反应液A和反应液B1000×SYBR Green I。通过对照组织样品中DNA的提取、猪细小病毒的环介导等温扩增、扩增产物的显色检测，从而检测出猪细小病毒。解决了现有技术时间长、工作量大、交叉污染、仪器昂贵和操作复杂等缺陷。本发明具有特异性强、灵敏度高、快速且成本低、操作方法更简单，反应时间仅为43min，更加有利于推广和现场快速检测。
文档编号C12Q1/70GK102808038SQ20111014272
公开日2012年12月5日 申请日期2011年5月30日 优先权日2011年5月30日
发明者沈志强, 曲光刚 申请人:山东省滨州畜牧兽医研究院