专利名称：运用双重pcr引物检测禾草腥黑粉菌和雀麦腥黑粉菌的方法
技术领域：
本发明涉及使用PCR技术检测寄生于禾本科草种中禾草腥黑粉菌(7 fusca E II & E V )和雀麦腥黑粉菌[Jilletia bromi (Brockm.) Brockm]的方法，属于禾本科草种腥黑粉菌检测领域。
背景技术：
早熟禾属(/^3L )植物中的许多种是优质的牧草和草坪草，在全国各地广泛种植， 以满足畜牧业及城市园林绿化建设的需要。草地早熟禾A pratensis L.的再生能力强， 抗寒性和秋季保绿性较好；加拿大早熟禾A compressaL.具发达的根系和根状茎，耐寒、 耐土壤干旱、耐瘠薄的能力优；一年生早熟禾A annua L.喜光，耐阴、耐旱性强，耐瘠薄 (谢可军等.10种早熟禾属植物的过氧化物酶同工酶分析.中国草地，2003，25(2): 30-33 )。目前，在进境禾本科草种中，早熟禾数量最多，每年约有2000多吨被引入中国。优良草种的引进，一定程度上促进了畜牧业的发展和改善了城市的环境水平，产生了较好的经济效益和社会效益。但同时，随着国外草籽的大量引进，外来危险性有害生物也随草籽进入，对我国城市园林绿化建设及农牧业生产安全造成潜在威胁。龚贤弟等(六月禾腥黑穗病菌的初步研究.植物检疫，，1991，5(6): 407-411)和李鸣等(从美国进口六月禾中检出狐草腥黑穗病菌.植物检疫，1992，6(6): 42)报道，从进境草地早熟禾即六月禾0°. /Trateasil5)中发现一种冬孢子形态与雀麦上的TYBeiia bromi (Brockm.) Brockm.、乌尔波草上的(7 /i/sca E II & E V)、早熟禾中的 7 sterilis 私 T. togwateei 相似的腥黑粉菌。随后，天津出入境检验检疫局多次从来自美国的草地早熟禾、一年生早熟禾和加拿大早熟禾的种子中截获此菌。
腥黑粉菌riBeiia Tul. & C. Tul.引起的腥黑穗病是早熟禾上重要的真菌病害， 严重影响早熟禾的品质和产量。Mof^iJilletia puccinelliae, a new species of reticulate-spored bunt fungus infecting Puccinellia distans. Mycologia, 2010, 102(3) : 613-623)认为，侵染早熟禾属的腥黑粉菌有6种7 cathcartae Duran & G. W. Fisch.、T. paradoxa Jacz.、Τ. poae Nagorny> Τ. sterilis Ule、Τ. togwateei 禾口 Τ. transiliensis Μ. N. Kusnezow & Schwarzman.。其中，Τ1· paradoxa > Τ. transiIiensis 和Τ. cathcartae的冬孢子表面具瘤突，其它3种表面纹饰网状-’T. sterilis的冬孢子堆聚生于叶鞘和茎部，其它种则危害子房，将种子变为菌瘿(Durto R et al. , The genus Tilletia. Pullman Press, Washington. , 1961, 138)。就寄主范围而论，T1. togwateei Poareflexa Vasey & Scribn (Guillemette MK et al.， a new bunt species from Poa reflexa. Mycologia, 1988，80(3) : 273-285), T. /？彻没寄生于林地早熟禾户.nemoralis L.。依据 Guillemette (Guillemette MK. Tilletia togwatii, a new bunt species from Poa refIexa. Mycologia, 1988, 80 (3) : 273—285)、Boyd (Boyd ML et al.， Molecular relationships among varieties of the Tilletia fusca(71. bromi) complex and related species. Mycological Research, 1997, 101 (3): 269-277)； Boyd ML et al. , Evidence supporting the separation of the Vulpia- and Bromus-infecting isolates in the Tilletia fusca (T. bromi) complex. Mycologia, 1998， 90(6): 1031-1039)禾口 Vanky (Vanky K. European smut fungi. Gustav Fischer Verlag Press, Germany. 1994，570)的分类观点，7和 7力寄主不包括早
熟禾属，那么，从早熟禾中发现的类似7 ⑵和7力的腥黑粉菌之分类地位及有关特性需要进一步明确。罗加凤(罗加凤等，从进口早熟禾种子中检出的一种腥黑粉菌与其近似种的比较.菌物学报，2011，30(1): 32-38)根据3种早熟禾上截获的腥黑粉菌与4 种近似种基于菌瘿、冬孢子形态及萌发生理特性的比较，将早熟禾上的腥黑粉菌定名为7 bromi 0但是长期以来检疫系统一直将早熟禾上发现的这种腥黑粉菌鉴定为禾草腥黑穗病菌7 /iAsca (龚贤弟等，六月禾腥黑穗病菌的初步研究.植物检疫，1991，5(6): 407-411;王圆.中国进境植物检疫有害生物选编，北京中国农业出版社，1997， 505-506)，而且T. bromi和T. fusca之间冬孢子形态及萌发生理特性非常相似(罗加凤等，从进口早熟禾种子中检出的一种腥黑粉菌与其近似种的比较.菌物学报，2011， 30(1): 32-38. ),Boyd 等(Boyd ML et al. , Molecular relationships among varieties of the Tilletia fusca (T. bromi) complex and related species. Mycological Research, 1997, 101(3): 269-277; Boyd ML et al., Evidence supporting the separation of the Vulpia- and Bromus-infecting isolates in the Tilletia fusca (T. bromi) complex. Mycologia, 1998，90(6): 1031-1039)从寄主专化性、分子生物学及细胞学三方面阐述了侵染Vulpia的专化型和侵染Io^as的专化型的不同，将集合种分为两个独立的种，T. ZiAsca和7 bromi -’\k为T. /i/sca寄主仅限于fe7/7ia，而将侵染雀麦的腥黑粉菌归为7力ro i。腥黑粉菌属主要依据形态学、萌发生理、细胞学诸方面的特性以及寄主专化性这些传统方法进行分类，但萌发实验耗时费力，萌发是否成功受材料新鲜程度、材料多少、培养条件等诸多因素的制约，不利于口岸的快速检测。随着草业国际化引种频繁，7 bromm T. /皿⑵通过口岸传入我国的风险越来越大。为了保护我国的牧草生产和城市绿化，因此为了在口岸更为快速、准确的对这两种腥黑粉菌进行检测，有必要在口岸建立雀麦腥黑粉菌和禾草腥黑粉菌的快速准确的分子检测方法。
发明内容
本发明建立了快速简便、特异性强、灵敏度高、准确可靠的T. fusca和T. bromi 双重PCR分子检测方法，能将T. fusca和T. bromi区别开来。该方法不仅能够检测菌丝基因组DNA，而且可以利用冬孢子双重套式扩增实现对两种腥黑粉菌冬孢子的同时检测，节约了试剂和时间，检测快速、可靠，整个过程在一个工作日内完成，可有效在口岸检测中推广应用。实验涉及的材料包括Tilletia属的2个近似种共计7个菌株(见表1，主要为菌丝和冬孢子)，来源于天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心植检实验室，ZaoU Zao2、 ZaoL, Poa5、Poa6为美国进境早熟禾上截获，LMC307和LMC312为交流的标本，所有菌株均由冬孢子培养出菌丝。
具体技术方案如下
本发明的目的之一是提供一种检测禾草腥黑粉菌U. fusca)和雀麦腥黑粉菌(7 知菌丝基因组DNA的双重特异PCR方法和冬孢子的双重套式PCR方法，既能对菌丝基因组DNA实现双重特异PCR检测，又能对冬孢子实现双重套式PCR检测，所设计的引物和用途如下
(1)设计腥黑粉菌属通用引物，序列如下
通用外套引物IGSUFl =GGA TGC ATT CTG GGG ACG T IGSURl :GTA GCC TTG TTG CTA CGA TCT G 通用内套引物:NIGSUF1 :CAC CGC CCA AGC ACG TAC NIGSUR1 :GAC CTT TTG GGG TCA AAC TTC TC
通用外套引物用于腥黑粉菌属菌丝基因组DNA或冬孢子套式扩增，扩增片段约为 900bp，通用内套引物用于冬孢子的套式扩增，扩增片段约为700bp，这两套引物用于腥黑粉菌属扩增过程质量监测，检查所抽提的菌丝基因组DNA质量和冬孢子的挑取和破碎，避免检测过程中的假阴性；
(2)设计禾草腥黑粉菌和雀麦腥黑粉菌各自的外套引物和特异引物，序列如下 禾草腥黑粉菌的外套引物:IGSUF2 :GAG CGA TAC CTT TGC ATT CTG ACG T IGSUR2 :CAC TGC ATT CTG GGG ACG TAC
禾草腥黑粉菌的特异引物PFSF =GAC TCG CGT CAA GCG A PFSR :GCG AAG GGA AAG TTC GAC，
特异引物的扩增片段约为140bp，这两套引物用于禾草腥黑粉菌的菌丝基因组DNA特异PCR扩增和冬孢子套式PCR的扩增。雀麦腥黑粉菌外套引物tubF=GAA GAC GTA TGC GTT GAG GA tubR :AGG AGG ATG CCG AGC GAG A
雀麦腥黑粉菌特异引物PNSF:CTC AAC CCT TCC CTC TAT TCC PNSR :CGA TAC GGA TTC TGC ATT CC
特异引物的扩增片段约为420bp，这两套引物用于雀麦腥黑粉菌的菌丝基因组DNA特异PCR扩增和冬孢子套式PCR的扩增。本发明的目的之二是为检测禾草腥黑粉菌和雀麦腥黑粉菌的方法提供下列步骤
(1)实验材料冬孢子的萌发和菌丝的培养；
(2)菌丝基因组DNA的提取；
(3)冬孢子的挑取与破碎；
(4)菌丝基因组DNA双重PCR检测； (5 )冬孢子双重套式PCR检测。本发明的目的之三是运用双重PCR引物检测禾草腥黑粉菌和雀麦腥黑粉菌的方法以及所设计的6套引物在检测禾草腥黑粉菌和雀麦腥黑粉菌方面的应用。本发明设计合成了 6套引物，包括通用外套引物、通用内套引物、T. fusca和T. brotni的外套引物和特异引物。通用外套引物用于菌丝基因组DNA或冬孢子的套式扩增， 通用内套引物用于冬孢子的套式扩增，这两套引物用于扩增过程质量监测，检查所抽提的
5菌丝基因组DNA质量和冬孢子的挑取和破碎，避免检测过程中的假阴性。Τ. ⑵和7 知的外套引物和特异引物用于两种菌的菌丝基因组DNA双重特异PCR扩增，各自的外套引物与特异引物用于它们的冬孢子DNA的双重套式PCR特异扩增。与现有技术相比，本发明的有益效果是本发明建立了快速简便、特异性强、灵敏度高、准确可靠的T. fusca和T. bromi的双重PCR分子检测方法，能将T. fusca和T. 知区别开来。采用通用引物监测实验过程，避免假阴性。该方法不仅能够检测菌丝基因组DNA，而且可以利用冬孢子双重套式扩增实现对两种腥黑粉菌冬孢子的同时检测，节约了试剂和时间，检测快速、可靠，整个过程在一个工作日内完成，可有效在口岸检测中推广应用。下面结合附图与具体实施方式
对本发明作进一步详细描述。
图1 菌丝基因组DNA外套通用引物的扩增； 图2 菌丝基因组DNA特异引物的双重扩增；
图3 冬孢子通用引物套式PCR的扩增； 图4 冬孢子特异引物双重套式PCR的扩增。
具体实施例方式实施例1 实验材料冬孢子的萌发和菌丝的培养
实验涉及的材料包括Tilletia属的2种近似种共计7个菌株(主要为菌丝和冬孢子) 来源于天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心植检实验室，Za0l、^i02、Za0L、P0a5、 Poa6为美国进境早熟禾上截获，LMC307和LMC312为交流的标本，所有菌株均由冬孢子培养出菌丝，供试材料的相关信息见表1。
权利要求
1.一种运用双重PCR引物检测禾草腥黑粉菌和雀麦腥黑粉菌的方法，既能对菌丝基因组DNA实现双重特异PCR检测，又能对冬孢子实现双重套式PCR检测，其特征在于，所设计的引物和用途如下(1)设计腥黑粉菌属通用引物，序列如下通用外套引物IGSUFl =GGA TGC ATT CTG GGG ACG T IGSURl :GTA GCC TTG TTG CTA CGA TCT G 通用内套引物:NIGSUF1 :CAC CGC CCA AGC ACG TAC NIGSUR1 :GAC CTT TTG GGG TCA AAC TTC TC通用外套引物用于腥黑粉菌属菌丝基因组DNA或冬孢子套式扩增，扩增片段约为 900bp，通用内套引物用于冬孢子的套式扩增，扩增片段约为700bp，这两套引物用于腥黑粉菌属扩增过程质量监测，检查所抽提的菌丝基因组DNA质量和冬孢子的挑取和破碎，避免检测过程中的假阴性；(2)设计禾草腥黑粉菌和雀麦腥黑粉菌各自的外套引物和特异引物，序列如下 禾草腥黑粉菌的外套引物:IGSUF2 :GAG CGA TAC CTT TGC ATT CTG ACG T IGSUR2 :CAC TGC ATT CTG GGG ACG TAC禾草腥黑粉菌的特异引物PFSF =GAC TCG CGT CAA GCG A PFSR :GCG AAG GGA AAG TTC GAC,特异引物的扩增片段约为140bp，这两套引物用于禾草腥黑粉菌的菌丝基因组DNA特异PCR扩增和冬孢子套式PCR的扩增，雀麦腥黑粉菌外套引物:tubF =GAA GAC GTA TGC GTT GAG GA tubR :AGG AGG ATG CCG AGC GAG A雀麦腥黑粉菌特异引物PNSF :CTC AAC CCT TCC CTC TAT TCC PNSR :CGA TAC GGA TTC TGC ATT CC特异引物的扩增片段约为420bp，这两套引物用于雀麦腥黑粉菌的菌丝基因组DNA特异PCR扩增和冬孢子套式PCR的扩增。
2.根据权利要求1所述的一种运用双重PCR引物检测禾草腥黑粉菌和雀麦腥黑粉菌的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)实验材料冬孢子的萌发和菌丝的培养；(2)菌丝基因组DNA的提取；(3)冬孢子的挑取与破碎；(4)菌丝基因组DNA双重PCR检测； (5 )冬孢子双重套式PCR检测。
3.权利要求1和2所述的一种运用双重PCR引物检测禾草腥黑粉菌和雀麦腥黑粉菌的方法以及所设计的6套引物在检测禾草腥黑粉菌和雀麦腥黑粉菌方面的应用。
全文摘要
本发明涉及使用PCR扩增技术检测禾草腥黑粉菌(TilletiafuscaEⅡ&EⅤ)和雀麦腥黑粉菌[T.bromi(Brockm.)Brockm]的方法，属于禾本科草种腥黑粉菌检测领域。本发明设计了6套引物，即通用外套引物、通用内套引物、T.fusca的外套引物和特异引物、T.bromi的外套引物和特异引物。通用外套引物用于菌丝基因组DNA或冬孢子的套式扩增，通用内套引物用于冬孢子的套式扩增，这两套引物用于扩增过程质量监测，检查所抽提的菌丝基因组DNA质量和冬孢子的挑取和破碎，避免检测过程中的假阴性。T.fusca和T.bromi的外套引物和特异引物可用于两种菌的菌丝基因组DNA双重特异PCR扩增，各自的外套引物与特异引物用于双重套式PCR特异扩增冬孢子DNA。
文档编号C12Q1/04GK102229998SQ20111014561
公开日2011年11月2日 申请日期2011年6月1日 优先权日2011年6月1日
发明者刘跃庭, 刘鹏, 廖芳, 张裕君, 罗加凤, 黄国明 申请人:天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心