专利名称：一种稀有人参皂甙ih-901结晶的简易生产方法
技术领域：
本发明涉及一种稀有人参皂甙IH-901结晶的简易生产方法。
背景技术：
20-0-β-D-吡喃葡萄糖苷-20 (S)-原人参二醇(稀有人参皂甙ΙΗ-901，也称为Ml 或Compound K)，在天然的人参中不存在，是天然的二醇组人参皂甙在人肠道内的降解代谢产物。近年来诸多研究表明人参的许多生物学活性都是由该化合物引起的，特别是在抗肿瘤、抗衰老、抗炎症等方面都体现良好的药效。IH-901将是一个很有前途的抗肿瘤药物，未来将相继以保健品及国家新药形式陆续上市，稀有人参皂甙项目在21世纪生物医药及生物健康品具有前瞻性、稀缺性以及需求巨大性，国际国内市场对其需求有着巨大的潜力。目前稀有人参皂甙IH-901由于其价格昂贵，市场上含量在99%以上价格达1000万元/公斤，而人参皂甙仅800元/公斤，难以被肿瘤病人使用，因此稀有人参皂甙IH-901的生产方法备受关注。由于人参皂甙四环三萜母核结构上3位和20位糖苷键的特异性，决定了 IH-901 只能由温和的生物转化方法获得，而常用的酸或碱水解方法是行不通的。目前，生物转化方法通常包括微生物发酵和酶转化两种主要方法。微生物发酵法制备所用的微生物主要是肠道厌氧菌，而其他微生物的研究比较少。肠道厌氧菌发酵最初是以人排泄物中的总菌物进行发酵，后来研究筛选单一肠道菌来转化，如采用肠道乳酸菌转化二醇型皂苷制备CK，发现运用Bifidobacterium minimum KK-I和B. choerinum KK-2共发酵转化Rbl时效果最好，转化率达到41 %左右，但肠道菌多为厌氧菌，培养条件苛刻，培养基成本高。另有研究筛选原始土壤微生物来降解人参皂苷， 但酶解能力低下，目的产物收率不高，须通过优化发酵条件和菌种诱变等方法来提高转化能力。中科院大连化学物理研究所申请发明专利用黑曲霉酶解人参皂甙制备稀有低极性人参皂苷的方法，所用黑曲霉菌是将各种来源的黑曲霉菌转入含有人参皂甙的培养基中，经传代培养、驯化、筛选得到的能够酵解产生稀有人参皂甙及甙元的菌株。目前在微生物发酵制备方面并没有适用大规模制备的成熟的方法或工艺。而参照肠内菌代谢原理，酶转化法制备是利用酶作为催化剂实现化学转化的过程，是酶制剂对外源性底物进行结构性修饰所发生的化学反应。国内学者利用葡萄糖苷酶对三七茎叶总皂苷进行转化，取得较好的转化效果。也有从具有转化活性的菌株中分离专一性更强的转化酶，如从食用微生物Bifidobacterium sp. Int57和Bifidobacterium sp. SJ32中提取的粗酶，可转化Rb2和Rc成Rd和F2,进而转化成终产物人参皂甙IH-901， 从人肠道菌FusodcAacterium K-60分离纯化的葡萄糖苷酶，亦能直接转化Rb1生成稀有人参皂甙IH-901。酶转化法选择性强，工艺研究控制方便，更有利于规模化制备。目前制约稀有人参皂甙IH-901生产的关键在于采用廉价而高效的工业酶制剂以及简单的分离纯化方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种稀有人参皂甙IH-901结晶的简易生产方法。本发明的技术方案是这样的稀有人参皂甙IH-901结晶的简易生产方法，通过如下方案实现将1单位质量单体人参皂甙Rbl、0. 1 0. 3单位质量国产的蜗牛酶粗酶和1 单位体积pH = 3 5的磷酸柠檬酸缓冲液混合均勻，于35 50°C下保温10 20小时之后，终止反应；加入0. 5单位质量乙醇进行萃取，离心收集乙醇层，将收集得到的乙醇层减压浓缩后上硅胶柱，以CHCl3-AcOEt-MeOH-H2O下层为洗脱剂，洗脱0. 8单位体积之后，开始收集洗脱液，将收集得到的洗脱液减压浓缩后溶解于体积比为100 70的乙醇和水的混合溶液中，室温过夜，即可获得纯度达95%以上的IH-901结晶。采用上述方案后，本发明的稀有人参皂甙IH-901结晶的简易生产方法，以单体人参皂甙Rbl为反应底物，反应的酶为廉价的国产蜗牛酶粗酶，产物分离纯化非常简单。而且，本发明的生产方法，由于采用单一底物和廉价的国产蜗牛酶粗酶，具有酶的来源丰富、 原料成本低，以及产物提取简单等优点。
具体实施例方式实施例一本发明的稀有人参皂甙IH-901结晶的简易生产方法，通过如下步骤实现①反应精密称取人参皂甙Rb1IOOOmg,加入pH4. 0磷酸柠檬酸缓冲液IOOOmL,加入蜗牛酶150mg，42°C水浴15h。②产物萃取和浓缩终止反应，加入500mL乙醇进行萃取浸提Mh，离心，收集乙醇提取液；将收集得到的乙醇提取液于旋转蒸发仪上减压浓缩，得浸膏；浸膏用氯仿溶解，加入水萃取，取氯仿层，氯仿层浓缩得上柱样品800mg。③过柱介质为硅胶G(200 目-300 目)，以 CHCl3-AcOEt-MeOH-H2O (2 :4:1: 1，下层)为洗脱剂，将步骤②所得的800mg上柱样品洗脱800毫升后开始收集洗脱液，收集的洗脱液于旋转蒸发仪上减压浓缩，得到浓缩浸膏。④结晶将步骤③所得的浓缩浸膏溶解于体积比为100 70的乙醇和水混合液中，室温下，过夜，获得结晶350mg。⑤鉴定采用高效液相法(HPLC)测定结晶的纯度为95%以上；采用核磁共振波谱 (NMR)检测鉴定结晶为IH-901 ；采用MTT法测定结晶对人肺腺癌细胞A549和人肝癌细胞 HepG-2具有强烈的抑制作用。实施例二本发明的稀有人参皂甙IH-901结晶的简易生产方法，通过如下步骤实现①反应精密称取人参皂甙Rb1IOOOmg,加入pH4. 0磷酸柠檬酸缓冲液IOOOmL,加入蜗牛酶300mg，;35°C水浴10h。②产物萃取和浓缩终止反应，加入500mL乙醇进行萃取浸提Mh，离心，收集乙醇提取液；将收集得到的乙醇提取液于旋转蒸发仪上减压浓缩，得浸膏；浸膏用氯仿溶解，加入水萃取，取氯仿层，氯仿层浓缩得上柱样品800mg。③过柱介质为硅胶G(200 目-300 目)，以 CHCl3-AcOEt-MeOH-H2O (2 :4:1: 1，下层)为洗脱剂，将步骤②所得的800mg上柱样品洗脱800毫升后开始收集洗脱液，收集的洗脱液于旋转蒸发仪上减压浓缩，得到浓缩浸膏。④结晶将步骤③所得的浓缩浸膏溶解于体积比为100 70的乙醇和水混合液中，室温下，过夜，获得结晶350mg。⑤鉴定采用高效液相法(HPLC)测定结晶的纯度为95%以上；采用核磁共振波谱 (NMR)检测鉴定结晶为IH-901 ；采用MTT法测定结晶对人肺腺癌细胞A549和人肝癌细胞 HepG-2具有强烈的抑制作用。实施例三本发明的稀有人参皂甙IH-901结晶的简易生产方法，通过如下步骤实现①反应精密称取人参皂甙Rb1IOOOmg,加入pH4. 0磷酸柠檬酸缓冲液IOOOmL,加入蜗牛酶100mg，50°C水浴20h。②产物萃取和浓缩终止反应，加入500mL乙醇进行萃取浸提Mh，离心，收集乙醇提取液；将收集得到的乙醇提取液于旋转蒸发仪上减压浓缩，得浸膏；浸膏用氯仿溶解，加入水萃取，取氯仿层，氯仿层浓缩得上柱样品800mg。③过柱介质为硅胶以200目-300 目)，以 CHCl3-Ac0Et-Me0H-H2(K2 4 1 1， 下层)为洗脱剂，将步骤②所得的SOOmg上柱样品洗脱800毫升后开始收集洗脱液，收集的洗脱液于旋转蒸发仪上减压浓缩，得到浓缩浸膏。④结晶将步骤③所得的浓缩浸膏溶解于体积比为100 70的乙醇和水混合液中，室温下，过夜，获得结晶350mg。⑤鉴定采用高效液相法(HPLC)测定结晶的纯度为95%以上；采用核磁共振波谱 (NMR)检测鉴定结晶为IH-901 ；采用MTT法测定结晶对人肺腺癌细胞A549和人肝癌细胞 HepG-2具有强烈的抑制作用。
权利要求
1. 一种稀有人参皂甙IH-901结晶的简易生产方法，其特征在于通过如下方案实现 将1单位质量单体人参皂甙Rbl、0. 1 0. 3单位质量国产的蜗牛酶粗酶和1单位体积PH = 3 5的磷酸柠檬酸缓冲液混合均勻，于35 50°C下保温10 20小时之后，终止反应；加入0. 5单位质量乙醇进行萃取，离心收集乙醇层，将收集得到的乙醇层减压浓缩后上硅胶柱，以CHCl3-AcOEt-MeOH-H2O下层为洗脱剂，洗脱0. 8单位体积之后，开始收集洗脱液，将收集得到的洗脱液减压浓缩后溶解于体积比为100 70的乙醇和水的混合液中，室温过夜， 即可获得纯度达95%以上的IH-901结晶。
全文摘要
本发明公开了一种稀有人参皂甙IH-901结晶的简易生产方法，通过如下方案实现将1单位质量单体人参皂甙Rb1、0.1～0.3单位质量国产的蜗牛酶粗酶和1单位体积pH＝3～5的磷酸柠檬酸缓冲液混合均匀，于35～50℃下保温10～20小时之后，终止反应；加入0.5单位质量乙醇进行萃取，离心收集乙醇层，减压浓缩后上硅胶柱，以CHCl3-AcOEt-MeOH-H2O下层为洗脱剂，洗脱0.8单位体积之后，开始收集洗脱液，减压浓缩后溶解于体积比为100∶70的乙醇和水的混合液中，室温过夜，即可获得纯度达95％以上的IH-901结晶。本发明以单体人参皂甙Rb1为反应底物，反应的酶为廉价的国产蜗牛酶粗酶，产物分离纯化非常简单，而且，由于采用单一底物和廉价的国产蜗牛酶粗酶，具有酶的来源丰富、原料成本低，以及产物提取简单等优点。
文档编号C12P33/00GK102251009SQ20111015431
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月9日 优先权日2011年6月9日
发明者林毅 申请人:华侨大学