专利名称：一种胃癌治疗疗效判断的方法、试剂盒及其使用方法
技术领域：
本发明涉及一种胃癌治疗疗效判断的方法、试剂盒及其使用方法。
背景技术：
胃癌是最高发的癌症之一，每年约有新发病例87万和死亡病例65万。胃癌早期治疗效果好，但诊断难；晚期易于诊断，但是治愈难度大。早期胃癌诊断率小于15%，多数胃癌一经诊断即为晚期。诊断胃癌常用的胃镜技术近年来有显著发展，如胃粘膜染色内镜使用的不吸收染料(如靛兰胭脂红)，胃癌组织着色率在90%以上，提高胃癌的检出率；放大胃镜(可以放大80倍)有助于在微血管水平评估胃部病变；红外线视频内镜的红外线可以穿透组织深部，获得组织的粘膜下特征；电子超声内镜能够清晰地显示正常胃壁的5层、7层或9层的声像，通过声像图形的改变，可具体辨别出肿瘤粘膜浸润程度，对早期胃癌诊断正确率可达 88-99%。然而胃镜检查价格较贵，同时也给患者带来不少痛苦，急需开发价廉、舒适、适合胃癌诊断的方法。基因诊断将是胃癌诊断突破口，现已发现癌基因ras、c-met、pl6、cerb、 p53、及端粒酶活性与胃癌有一定关系。但这些指标对胃癌缺乏特异性，目前有潜在临床应用价值血清学检测癌前病变或胃癌的方法正在摸索研究中。miRNA是一类非编码的长约20 22个核苷酸的RNA，是miRNA前体经过RNaseIII 酶Dicer加工形成的miRNA双链。双链中的一条与沉默复合体(RISC)连在一起，另一条被细胞内的核酸酶降解。miRNA-RISC复合体结合到特定mRNA目标，导致mRNA翻译抑制或裂解。因此，miRNA通过促进RNA降解，抑制mRNA翻译，或者影响转录来调节蛋白的表达。虽然miRNA介导的mRNA降解也发生在哺乳动物中，但大多数哺乳动物的miRNA被认为是通过 mRNA3'-非编码区不完善的碱基配对(3‘-非翻译区)在转录水平上抑制了目的基因的表达。这种形式的翻译调控诱导蛋白质合成的快速变化，而不需要mRNA加工过程中大量的转录激活和后续步骤，因此提供了对特定蛋白表达更精确、直接和节能的控制方式。此外， 基因表达的翻译控制有容易逆转的优势，为细胞应对各种压力提供了很大的灵活性。miRNA已被证实参与调控了包括时序发育、细胞凋亡脂肪代谢、神经元发育、细胞分化、激素分泌等在内的多种生理过程。此外，miRNA与癌症发生密切相关。癌症是由受损细胞增殖失控或不适当存活引起的。正常细胞已形成保护功能，以确保细胞的分裂、分化和死亡过程正确且协调地进行。当指导细胞增殖和分化的基因受到损伤时，癌症就发生了。而miRNA发挥类似致癌基因或抑癌基因的作用，参与癌症的发生、发展。(Micro RNAs genomics biogenesis mechanism, and funection[J]. Cell,2004,116 (2) :281-297)位于13ql4的miR-15以及miR_16在B细胞慢性淋巴白血病中表达水平下调；miR-143与 miR-145在直肠癌中表达水平下调；let27在肺癌样本中表达水平下调，并与预后正相关； miR-125b，miR-145, miR-155, miR-21在乳腺癌中表达水平明显下调。(姜洁纯，汤华.微小RNAs与肿瘤关系的研究进展.医学综述，2008，14 (07) :1005-1006)研究人员发现另有一些miRNA在肿瘤样本中表达水平上调，如由miR-17，miR-18，miR-19等在肺癌样本中表达水平上调，miR-155的前 Burkitt淋巴瘤表达水平上调。随着研究的深人，研究人员发现一些miRNA在细胞调控中扮演着“双刃剑”的作用，如miR-21在乳腺癌样本中表达水平明显下调，而在神经胶质瘤中表达水平明显上调(叶萍，于凤海.MicroRNAs与肝癌.第二军医大学学报，2008，四(05) :561-564.)MiRNA在不同的癌症细胞中具有特定的表达水平和模式，人们可以通过对人乳腺癌、肺癌、结直肠癌、颅脑肿瘤、甲状腺癌和淋巴瘤等组织中的miRNA表达谱与正常的组织表达谱进行对比分析，对不同癌症特定的miRNA水平进行鉴定，从而有助于癌症的临床管理。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于在于提供一种能判断胃癌治疗疗效的方法，准确判断患者是否能从治疗方案中获益，帮助判断使用何种治疗方法，从而避免对无应答患者的毒性、降低病人的医疗成本。为解决上述技术问题，本发明提供了一种判断胃癌治疗疗效的方法检测胃癌组织中miR-21和/或miR-18Ib表达水平。将实际测得的miR-21和/或HiiR-ISlb表达水平与治疗前相比，如果降低明显，表明治疗方案有效，如果升高或者降低不明显，表明治疗方案对病人效果不明显，需要考虑更换治疗方案。实施例1试验表明，胃癌组织中miR-21和miR-lSlb有着显著的表达，治疗后低水平miR-21和miR-181b表达的患者生存率更高。本发明提供的试剂盒由三个独立包装或组合包装的试剂盒组成RNA提取试剂盒、RT-PCR反应试剂盒、实时定量PCR反应试剂盒，依次使用三个试剂盒能检测出胃癌组织中miR-21和miR-181b的含量。作为优选RNA提取试剂盒，含有Trizol试剂、氯仿、异丙醇、显色剂、乙醇、无核酸酶水。显色剂为糖原衍生的蓝色染料。作为优选RNA提取试剂盒中，含有Trizol试剂0. 8-1. ^il、氯仿500_700ul、异丙醇 400-600ul、显色剂 0. 5-2ul、75% 乙醇 0. 5_2ml、无核酸酶水 5_20ul。作为优选RNA提取试剂盒中，含有1Trizol试剂1. 05ml、氯仿600ul、异丙醇500ul、 显色剂lul、75%乙醇1ml、无核酸酶水10ul。作为优选RT-PCR试剂盒，含有dNTPs，逆转录酶，逆转录缓冲液，RNA酶抑制剂， miR-21和/或miR-18Ib特异性逆转录引物、无核酸酶水。作为优选RT-PCR试剂盒中，含有10 mM dNTPs 0. 15ul，50U/ul逆转录酶lul，10倍浓度PH7. 5的逆转录缓冲液1. 5ul，20U/ul RNA酶抑制剂0. 19ul，购自Applied Biosystem 的5倍浓度miR-21和/或miR-18Ib特异性逆转录引物!3ul、无核酸酶水4. 16ul。作为优选实时定量PCR反应试剂盒，含有通用PCR总混合物、无核酸酶水、miR-21 和/或miR-181b特异性PCR引物。通用PCR总混合物(Universal PCRMasterMix，购自 TaqMan)中含有DNA聚合酶、UNG酶、含dUTP的dNTPs、内参、缓冲液。作为优选实时定量PCR反应试剂盒，含有TaqMan2倍浓度通用PCR总混合物(TaqMan 2x Universal PCR Master Mix) 10ul、无核酸酶水 7. 67ul、购自 AppliedBiosystem的20倍浓度miR-21和/或miR_181b特异性PCR引物Iul。本发明提供了 RNA试剂盒的使用方法1)、用移液器将样本反复吹打混勻，各吸取样本350ul到两个1. 5ml离心管中，向其中一管加入Ing的RNA作为阳性对照；2)、加入1.05ml Trizol，振荡5min，混勻，分为两管;3)、各加入600ul氯仿再振荡5min ；4)、室温静置5min，13200rpm离心lOmin，取800ul上层有机相到新的离心管；5)、加入500ul异丙醇和Iul显色剂，上下颠倒管子，_20°C冰浴2h ；6)、2h后，取出冰浴样本，4°C，13200rpm离心lOmin，弃上清，可见离心管底有蓝色
沉淀；7)、加Iml 75%乙醇，上下颠倒离心管，13200rpm离心5min弃上清；8)、再离心1 min，用枪头吸去上清；9)、放通风柜，晾干；10) UOul无核酸酶水溶解，-80°C保存。本发明提供了 RT-PCR试剂盒的使用方法1)、将IOmM dNTPsO. 15ul，逆转录酶Iul，10倍浓度PH7. 5的逆转录缓冲液1. 5ul， 20U/ulRNA 酶抑制剂 0. 19ul，购自 Applied Biosystem 的 5 倍浓度 miR-21 和 / 或 miR_181b 特异性逆转录引物Ml、无核酸酶水4. 16ul、5ul RNA试剂盒提取的样品混勻瞬离，分装，加入对应的模板混勻，再加入无核酸酶水至总体系为15ul ；2)、将步骤1的材料在普通PCR仪上进行逆转录，16 V保持30min，42 V保持 30min，85°C保持 5min，4°C保持过夜；3)、取步骤2中的材料20ul，继续在普通PCR仪上反应，a) 95°C保持10min，b)55°C 保持 2min，c) 72°C保持 2min，d) 95°C保持 15 秒，e) 60°C保持 4min, f)重复步骤 d)、e) 12 次， g)99. 0°C 保持 IOmin。本发明提供了实时定量PCR试剂盒的使用方法1)将 IOul TaqMan2 倍浓度通用 PCR 总混合物(iTaciMan 2x Universal PCR Master Mix)、7. 67ul 无核酸酶水、Iul 购自 Applied Biosystem 的 20 倍浓度 miR-21 和 / 或miR-lSlb特异性PCR引物、RT-PCR试剂盒获得的miRNA逆转录产物稀释5倍后的产物 1. 33ul 混勻；2)在普通PCR仪上反应，a) 95°C保持lOmin，b) 95°C保持15秒，c) 60°C保持60秒， d)重复步骤b)、c)45次，g)4°C保存待检测。本发明的有益效果是RNA提取试剂盒使用的样本为病人胃癌组织或者胃癌石蜡组织切片，正确按照上述方法依次使用RNA提取试剂盒、RT-PCR反应试剂盒、实时定量PCR 反应试剂盒后，能检测出胃癌组织中miR-21和miR-lSlb的含量。试验结果表明胃癌组织中miR-21和miR-181b有着显著的表达，治疗后低水平miR-21和miR_181b表达的患者生存率更高。将实际测得的miR-21和/或miR-lSlb表达水平与治疗前相比，如果降低明显， 表明治疗方案有效，如果升高或者降低不明显，表明治疗方案对病人效果不明显，需要考虑更换治疗方案。这将协助胃癌的临床管理，有助于筛选哪些胃癌患者将从治疗中获益，从而避免对无应答患者的毒性、降低病人的医疗成本。
图1 :miR-140、miR-192、miR-200c、let_7g在正常组织和胃癌组织中的表达水平图2 :miR-21、miR-181b在正常组织和胃癌组织中的表达水平图3 =S-I/奥沙利钼、去氧氟尿苷/奥沙利钼治疗患者的Kaplan-Meier总生存曲线与miR-21表达水平的关系图4 =S-I/奥沙利钼、去氧氟尿苷/奥沙利钼治疗患者的Kaplan-Meier总生存曲线与miR-181b表达水平的关系
具体实施例方式实施例1候选基因分析1.病人与组织样本收集KPS > 70的胃癌III和IV期患者，去氧氟尿苷/奥沙利钼组每天服用去氧氟尿苷两次，每次400mg，静脉奥沙利钼第一天130mg/平米，四周一疗程。s_l/奥沙利钼组每天服用S-I两次，每次40mg，静脉奥沙利钼第一天130mg/平米，四周一疗程。这些病人的特征见表1。取上述患者的胃癌组织，福尔马林固定制作石蜡标本，用于后续的RNA提取。表1.去氧氟尿苷/奥沙利钼或S-I/奥沙利钼治疗的胃癌患者的临床和病理参数
权利要求
1.一种判断胃癌治疗疗效的方法检测胃癌组织中miR-21和/或miR-lSlb表达水平。
2.一种判断胃癌治疗疗效的试剂盒，其特征在于由三个独立包装或组合包装的试剂盒组成RNA提取试剂盒、RT-PCR反应试剂盒和实时定量PCR反应试剂盒，依次使用三个试剂盒能检测出胃癌组织中miR-21和miR-181b的含量。
3.权利要求2的判断胃癌治疗疗效的试剂盒，其特征在于RNA提取试剂盒含有Trizol 试剂、氯仿、异丙醇、显色剂、乙醇和无核酸酶水。
4.权利要求2的判断胃癌治疗疗效的试剂盒，其特征在于RNA提取试剂盒含有Trizol 试剂 0. 8-1. 2ml、氯仿 500-700ul、异丙醇 400_600ul、显色剂 0. 5_2ul、75% 乙醇 0. 5_2ml 和无核酸酶水5-20ul。
5.权利要求2的判断胃癌治疗疗效的试剂盒，其特征在于RNA提取试剂盒含有Trizol 试剂1. 05ml、氯仿600ul、异丙醇500ul、显色剂lul、75%乙醇Iml和无核酸酶水IOul0
6.权利要求2的判断胃癌治疗疗效的试剂盒，其特征在于RT-PCR试剂盒含有dNTPs， 逆转录酶，逆转录缓冲液，RNA酶抑制剂，miR-21和/或miR-181b特异性逆转录引物和无核酸酶水。
7.权利要求2的判断胃癌治疗疗效的试剂盒，其特征在于RT-PCR试剂盒含有 IOmMdNTPs 0. 15ul，50U/ul 逆转录酶 Iul，10 倍浓度 PH7. 5 的逆转录缓冲液 1. 5ul，20U/ul RNA酶抑制剂0. 19ul，购自Applied Biosystem的5倍浓度miR-21和/或miR_181b特异性逆转录引物3ul和无核酸酶水4. 16ul。
8.权利要求2的判断胃癌治疗疗效的试剂盒，其特征在于实时定量PCR反应试剂盒含有I1aqMan通用PCR总混合物、无核酸酶水和miR-21和/或miR_181b特异性PCR引物， TaqMan通用PCR总混合物中含有DNA聚合酶、UNG酶、含dUTP的dNTPs、内参、缓冲液。
9.权利要求2的判断胃癌治疗疗效的试剂盒，其特征在于实时定量PCR反应试剂盒含有TaqMan 2倍浓度通用PCR总混合物10ul、无核酸酶水7. 67ul和购自Applied Biosystem 的20倍浓度miR-21和/或miR-181b特异性PCR引物Iul。
10.权利要求2的试剂盒的使用方法a、使用RNA提取试剂盒1)、用移液器将样本反复吹打混勻，各吸取样本350ul到两个1.5ml离心管中，向其中一管加入Ing的RNA作为阳性对照；2)、加入1.05mlTrizol，振荡5min，混勻，分为两管；3)、各加入600ul氯仿再振荡5min；4)、室温静置5min，13200rpm离心lOmin，取800ul上层有机相到新的离心管；5)、加入500ul异丙醇和Iul显色剂，上下颠倒管子，-20°C冰浴浊；6),2h后，取出冰浴样本，4°C，13200rpm离心lOmin，弃上清，可见离心管底有蓝色沉淀；7)、加Iml75%乙醇，上下颠倒离心管，13200rpm离心5min弃上清；8)、再离心lmin，用枪头吸去上清；9)、放通风柜，晾干；10)UOul无核酸酶水溶解，_80°C保存；b、使用RT-PCR试剂盒1)、将IOmMdNTPsO. 15ul，逆转录酶Iul，10倍浓度PH7. 5的逆转录缓冲液1. 5ul，20U/ uIRNA 酶抑制剂 0. 19ul，购自 Applied Biosystem 的 5 倍浓度 miR-21 和 / 或 miR_181b 特异性逆转录引物:3ul、无核酸酶水4. 16ul、5ul RNA试剂盒提取的样品混勻瞬离，分装，加入对应的模板混勻，再加入无核酸酶水至总体系为15ul ；2)、将步骤1的材料在普通PCR仪上进行逆转录，16°C保持30min，42°C保持30min， 85°C保持5min，4°C保持过夜；3)、取步骤2中的材料20ul，继续在普通PCR仪上反应，a)95°C保持lOmin，b)55°C保持 2min，c)72°C保持 2min，d)95°C保持 15 秒，e)60°C保持 4min, f)重复步骤 d)、e) 12 次， g)99. 0°C 保持 IOmin ；C、使用实时定量PCR试剂盒1)将IOulTaqMan2倍浓度通用PCR总混合物、7. 67ul无核酸酶水、Iul购自 AppliedBiosystem 的 20 倍浓度 miR-21 和 / 或 miR_181b 特异性 PCR 引物、RT-PCR 试剂盒获得的miRNA逆转录产物稀释5倍后的产物1. 33ul混勻；2)在普通PCR仪上反应，a)95°C保持lOmin，b)95°C保持15秒，c)60°C保持60秒，d) 重复步骤b)、c) 45次，g) 4°C保存待检测。
全文摘要
本发明涉及一种胃癌治疗疗效判断的方法、试剂盒及其使用方法。通过检测胃癌组织中miR-21和/或miR-181b表达水平可以判断治疗方案是否合理。试剂盒由三个独立包装或组合包装的试剂盒组成RNA提取试剂盒、RT-PCR反应试剂盒、实时定量PCR反应试剂盒，依次使用三个试剂盒最终能检测出胃癌石蜡组织或者胃癌组织中miR-21和miR-181b的含量。该试剂盒的的使用将协助胃癌的临床管理，有助于筛选哪些胃癌患者将从治疗中获益，从而避免对无应答胃癌患者的毒性、降低病人的医疗成本。
文档编号C12Q1/68GK102230006SQ20111015637
公开日2011年11月2日 申请日期2011年6月10日 优先权日2011年6月10日
发明者吴昌平, 蒋敬庭, 郑晓, 鞠景芳 申请人:吴昌平, 蒋敬庭, 郑晓, 鞠景芳