专利名称：与黄瓜黄、绿色子叶连锁的基因片段及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物基因工程技术领域，涉及黄瓜常规杂交育种、分子标记辅助育种的方法与技术，特别涉及与黄瓜子叶颜色连锁的基因片段及用途。
背景技术：
植物叶色突变是自然界比较普遍的突变现象，主要来源于自发突变、人工诱发突变、插入突变和基因沉默突变等。叶色突变性状作为一种指示性标记在遗传育种中具有重要的利用价值，可以用于简化良种繁育和杂交种生产，具有特殊优良性状的突变体还可为作物遗传育种提供优秀的种质资源。作者于2007年和2008年在华北类型黄瓜B180亲本自交系群体中先后发现若干株突变类型单株，子叶黄色，边缘渐渐转绿至斑驳状，真叶绿色，第一真叶比正常子叶绿色植株生长缓慢。将突变的黄色子叶类型植株全部自交，后代一致，无分离现象。以往对于黄瓜真叶叶色突变性状的生理学、遗传学等方面研究较多，对于黄瓜子叶颜色的研究则较少， 对黄瓜叶色突变性状的分子机制研究也少有报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供与黄瓜黄色子叶连锁的基因片段。本发明的第二个目的是提供与黄瓜绿色子叶连锁的基因片段。本发明的第三个目的是提供与黄瓜黄色子叶连锁的基因片段和与黄瓜绿色子叶连锁的基因片段的用途。本发明的技术方案概述如下与黄瓜黄色子叶连锁的基因片段，是SEQ ID No. 1所述的核苷酸序列。与黄瓜绿色子叶连锁的基因片段，是SEQ ID No. 2所述的核苷酸序列。用与黄瓜黄色子叶连锁的基因片段和与黄瓜绿色子叶连锁的基因片段进行黄瓜分子标记辅助育种。利用本发明的与黄瓜黄色子叶连锁的基因片段和与黄瓜绿色子叶连锁的基因片段对构建的F2代分离群体和黄瓜种质资源进行子叶颜色鉴定，其结果与人工接种鉴定符合率达96. 77% (数据见表1)，与黄瓜子叶颜色相关基因的连锁遗传距离为3. 2cM。具有快速、准确、不受环境条件影响等优点，本发明在黄瓜育种中进行资源筛选和纯度检测具有很大的应用价值。
图1是与黄瓜绿色子叶和黄色子叶连锁的特异DNA片段的获得图谱其中A(M)为 DNA标准；B(P1)为父本Q12绿色子叶连锁的基因片段，C(P2)为母本B180H黄色子叶连锁的基因片段；1 5为绿色子叶单株；6 10为黄色子叶单株。图2是B180HXQ12杂交后代&代部分单株分离情况图谱其中A(M)为DNA标准；B(P1)为父本Q12绿色子叶连锁的基因片段，C (P2)为母本B180H黄色子叶连锁的基因片段； 4、7、10、12、14 16、20、沘、33、；35为绿色子叶单株，17、22、25、四、31、；34、36、37为黄色子叶单株；1 3、5、6、8、9、11、13、18、19、21、23、24、26、27、30、32、38 为杂合类型单株(表型为绿色)，纯合绿色子叶株仅有257bp基因片段，纯合黄色子叶株仅有258bp基因片段，杂合类型单株同时具有257bp和258bp基因片段。图3是与绿色子叶和黄色子叶连锁的基因片段对比图H为与黄色子叶连锁的基因片段；L为与绿色子叶连锁的基因片段；阴影部分为差异片段；下划线标注为所用引物 E-AGA/M-AAG 的序列。
具体实施例方式本发明是在对黄色子叶亲本B180H自交，后代一致无分离现象的基础上，采用BSA 方法和AFLP技术分离与黄瓜黄色子叶连锁的基因片段和与黄瓜绿色子叶连锁的基因片段，进行序列同源性分析，为优良种质资源的筛选、种子纯度鉴定、分子标记辅助育种奠定 ■石出。为了实现以上目的，本发明采用AFLP(Amplified fragment length polymorphism)分子标记技术结合BSA (Bulked segregant analysis，混合分离分析)法对黄瓜黄色子叶材料B180H的黄色子叶连锁的相关基因和黄瓜绿色子叶材料Q12的绿色子叶连锁的相关基因进行了分子标记研究。获得与黄瓜黄色子叶连锁的DNA基因片段1个，获得与黄瓜绿色子叶连锁的DNA基因片段1个，对这些片段测序后，其大小分别为258bp(SEQ ID No. 1所述的核苷酸序列)、257bp(SEQ ID No. 2所述的核苷酸序列)。具体操作步骤如下1. FpF2及BC1群体的构建及表型鉴定以黄瓜黄色子叶材料B180H和绿色子叶材料Q12及其76株F1,124株F2、85株BC1H 和68株BC1L分离群体为试材，田间种植各世代群体，正常管理。待子叶出土至展平期、第一真叶期进行子叶颜色鉴定。2. DNA提取及AFLP分析体系剪取F2群体黄瓜幼嫩小叶，采用CTAB法单株提取DNA，_20°C保存。利用BSA法各取5个黄色子叶和绿色子叶单株DNA，构建成黄色子叶组和绿色子叶组用于AFLP引物的多态性筛选。AFLP yMfrWM^M Vos (a new technique for DNA fingerprinting [J]. Nucleic Acids Res, 1995,23(21) :4407-4414.)的方法。PCR反应体系为20 μ 1，黄瓜基因组DNA预扩增产物2. 5ng、引物各50ng、 dNTPO. 4mM、Mg2+L 5mM、1倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶1. 0单位；反应条件为94°C预变性180秒，94°C变性30秒，65°C退火30秒，72°C延伸120秒，每个循环退火温度降低0. 7°C， 13个循环后，退火温度降至56°C，再进行23个循环的扩增94°C变性30秒，56°C退火30秒， 再72°C延伸120秒。3.引物筛选和验证在黄色/绿色子叶亲本间筛选IOM对AFLP选择性扩增引物，在双亲间产生多态性的引物Iio对，根据特异DNA片段在F2代分离群体中的表现情况，对照以上对各世代的苗期人工表型鉴定结果，发现引物E-AG/M-AAG在两亲本以及F2黄色/绿色子叶组单株进行PCR扩增，获得了一个共显性AFLP标记，进一步用E+3引物进行筛选，获得与黄瓜子叶色基因紧密连锁的AFLP标记E-AGA/M-AAG以及与黄瓜黄色子叶连锁的DNA基因片段(SEQ ID No. 1所示)和与黄瓜绿色子叶连锁的DNA基因片段(SEQ ID No. 2所示)。用该引物组合对组外的其它F2单株进行扩增，进一步确认所筛选到的标记。结果表明黄色子叶亲本和黄色子叶组单株只有258bp的特异片段，绿色子叶亲本只有257bp的特异片段，而绿色子叶组单株或者只有257bp的特异片段，或者同时具有258和257bp的特异片段，进一步说明黄瓜绿色子叶相对于黄色子叶为显性。经连锁值测定，所筛选到的标记与目标基因——黄瓜子叶色相关基因紧密连锁，遗传距离为3. 2cM。所用AFLP引物E-AGA/M-AAG的碱基序列为E-AGA 5' -GACTGCGTAC CAATTCAGA-3‘ (SEQ ID No.3)M-AAG 5' -GATGAGTCCT GAGTAAAAG-3‘ (SEQ ID No. 4)4. PCR产物的回收和测序将扩增产物采用5%变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离；在扩增产物中加入变性凝胶上样缓冲液，于95°C变性300秒，上样于经30分钟预电泳的变性聚丙烯胺凝胶上，IOOff 恒功率电泳至溴酚兰刚刚到达凝胶的另一端，凝胶经硝酸银染色后在可见光下观察。5.序列分析采用煮沸法将两个目的片段从银染胶上回收、扩增，送至北京三博远志生物工程公司进行测序。根据测序结果，与黄瓜黄色子叶连锁的特异片段有258个碱基(SEQ ID No. 1所示)，与绿色子叶连锁的特异片段有257个碱基(SEQ ID No. 2所示)，二者的差异在于1个碱基“A”的插入和缺失以及两个“A<=i>G”的碱基突变(图3)。实施例2利用获得的与黄瓜黄色子叶连锁的基因片段和与黄瓜绿色子叶连锁的基因片段， 进行黄瓜分子标记辅助育种的方法，即对黄瓜种质资源或杂交种进行纯度检测或鉴定。用天津科润黄瓜研究所育种一室育成的商品化品种，津优3、津优12、津优30、津优32、津优38以及一些黄瓜种质资源W17-2-1、A13、P53、P54、P60_l、66、Q21等，采用苗期人工表型鉴定的方法对以上材料进行子叶色鉴定。根据实施例1获得的与黄瓜子叶色基因紧密连锁的AFLP特异引物E-AGA/M-AAG，对上述黄瓜材料基因组DNA进行PCR扩增，凡扩增产物出现258bp的特异片段的材料，为黄色子叶资源；凡扩增产物只出现257bp的特异片段的材料，为绿色子叶资源；凡同时扩增出该两个特异片段的材料，为不纯合材料。表1 F2群体单株的表型及标记分离统计
权利要求
1.与黄瓜黄色子叶连锁的基因片段，其特征是SEQID No. 1所述的核苷酸序列。
2.与黄瓜绿色子叶连锁的基因片段，其特征是SEQID No. 2所述的核苷酸序列。
3.用权利要求1所述的与黄瓜黄色子叶连锁的基因片段和权利要求2所述的与黄瓜绿色子叶连锁的基因片段进行黄瓜分子标记辅助育种。
全文摘要
本发明公开了与黄瓜黄、绿色子叶连锁的基因片段及用途，与黄瓜黄色子叶连锁的基因片段是SEQ ID No.1所述的核苷酸序列；与黄瓜绿色子叶连锁的基因片段是SEQ ID No.2所述的核苷酸序列。利用与黄瓜黄色子叶连锁的基因片段和与黄瓜绿色子叶连锁的基因片段对构建的F2代分离群体及黄瓜种质资源进行检测，其结果与人工表型鉴定符合率达96.77％，与黄瓜子叶颜色相关基因的连锁遗传距离为3.2cM。本发明具有快速、准确、不受环境条件影响等优点，对进行黄瓜分子标记辅助育种具有很大的应用价值。
文档编号C12Q1/68GK102242130SQ201110161299
公开日2011年11月16日 申请日期2011年6月16日 优先权日2011年6月16日
发明者李淑菊, 杨瑞环, 王惠哲, 管炜 申请人:天津科润农业科技股份有限公司