专利名称：用于检测漆酶吸附特性的胶体金探针及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种胶体金探针及其制备方法。
背景技术：
木质素是农作物秸杆及城市生活垃圾中一种常见的、难降解的物质，处理不当会造成极大的资源浪费和环境污染。白腐菌是降解木质素一类有机污染物能力最强的微生物，它在分解木质素的过程中会产生氧化及分解木质素的酶系统，主要包括木质素过氧化 ^lJBl(Lignin Peroxidases)^1131^^.^61 (Manganese Perxidases)禾口(Laccase)0 它们决定着木质素降解的途径、速度和程度，因此木质素降解过程中微生物的酶解作用便成为关键。木质素的组成单位和空间结构决定了其酶解过程的复杂性，而酶在木质素表面的吸附是酶降解底物的第一步。木质素组成成分复杂，各成分对酶的吸附特性不一，在生产中，酶液与底物的合理比例关系就是依据酶在底物上的吸附特性而确定的，因而酶的吸附特性对工业化生产也具有指导作用，可为设计和选择生化反应器提供最优参数。这样通过实时监测不同基质条件变化下木质素降解酶的吸附作用位点来检测其吸附特性，对深入了解木质素降解酶的作用机制，促进木质素的酶解作用显得尤为重要。而木质素降解酶系统中漆酶和过氧化物酶相比具有更大的应用价值。首先，木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶是在既限碳，又限氮条件下产生的严格次级代谢产物，碳、氮源营养物的存在会限制细胞对酶的分泌；其次，由于木质素过氧化物酶和锰过氧化物在降解有机污染物时需要大量的H2A辅助剂，这在现实情况下很难实现，限制了其在实际生产中的应用；第三，漆酶具有780 mV氧化还原电位，能把分子氧直接还原为水，即使没有H2A 和其它次级代谢产物存在下，也可催化有机污染物的氧化。因此，漆酶的吸附特性检测更具实际意义。目前对于漆酶的吸附特性研究普遍停留在酶的吸附热力学、测定吸附等温线和建立吸附热力学模型以及测定和建立酶解动力学等基础工作上，因此研究一种通过微观定位酶的吸附作用位点来检测其吸附特性的方法，成为极需解决的的问题。胶体金探针是近年来发展迅速的新型标记技术，由于胶体金颗粒易与生物大分子结合，并且具有高电子密度， 在电子显微镜下有致密的电子层，即可对生物大分子进行定位检测，且制作方便，价格低廉、无放射性污染，显示出良好的应用前景。如何将胶体金探针应用到漆酶的吸附特性检测中，就成为本领域技术人员面临的一个新课题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术存在的问题，本发明提供一种成本低廉、结合稳定、漆酶活性强且能通过微观定位漆酶的吸附作用位点来检测漆酶吸附特性的胶体金探针；本发明还提供一种制备工艺简单、操作方便的用于检测漆酶吸附特性的胶体金探针的制备方法。为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案一种用于检测漆酶吸附特性的胶体金探针，其特征在于，所述胶体金探针包括漆酶，所述漆酶表面结合有胶体金颗粒。胶体金作为一种新型标记物在标记探针应用方面具有独特的优势，能与生物大分子之间通过非共价键的静电引力形成稳定的复合金纳米粒子，同时胶体金具有高电子密度的特征，可在不破坏生命物质结构和功能的前提下提供光电检测信号。作为本发明的胶体金探针的进一步改进
上述的胶体金探针中，所述胶体金颗粒的粒径优选为15 nm 20 nm, kta电位优选为-30. 5 mV -35. 5 mV。上述的胶体金探针中，所述胶体金探针的粒径优选为450 nm 500 nm。作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的胶体金探针的制备方法，包括以下步骤
制备胶体金溶液并将其PH值调节为4. 5 5，向胶体金溶液中加入质量浓度不小于 0.9 mg/mL的漆酶溶液，在搅拌条件下加入质量浓度为5 mg/mL 10 mg/mL的PEG-20000溶液，所述胶体金溶液、漆酶溶液与PEG-20000溶液的体积比为5 (1. 1 1. 15) (0. 6 0.65)，充分反应后，用1000 r/min 1200 r/min的转速进行第一次离心，去除聚集物，再以13000 r/min 15000 r/min的转速进行第二次离心，吸弃上清液，将沉淀重溶于柠檬酸钠缓冲溶液，定容，制得所述用于检测漆酶吸附特性的胶体金探针。作为本发明的制备方法的进一步改进
上述的制备方法中，所述胶体金优选是由柠檬酸三钠法制得的，具体包括以下步骤 取HAuCIvK溶液于恒温磁力搅拌器上加热至沸腾并保持至少2 min,在搅拌条件下，快速加入柠檬酸三钠溶液；保持温度与转速，至溶液颜色转为清亮橘红色后停止加热并继续搅拌，室温冷却后，定容，制得胶体金溶液。上述的制备方法中，所述漆酶溶液的pH值优选为4. 5 4. 75。上述的制备方法中，所述柠檬酸钠缓冲溶液中含有浓度为0.2 mg/mL的 PEG-20000。与现有技术相比，本发明的优点在于
1、本发明的用于检测漆酶吸附特性的胶体金探针，漆酶与胶体金之间结合稳定，能适用不同基质条件变化，在不影响漆酶活性的前提下，通过电镜水平的漆酶吸附作用位点的微观定位，来检测其吸附特性；本发明的胶体金探针拓宽了漆酶吸附、传输特性的检测方法的选择范围，为深入了解酶的作用机制，促进木质素的酶解作用提供了可能。2、本发明的胶体金探针的制备方法，制备工艺简单、操作方便，制备成本低廉；优选的配比和PH值控制使胶体金和漆酶能更好地结合，并能保持漆酶的高活性。
图1是本发明实施例2的胶体金探针的扫描电镜图谱；
图2是本发明实施例2中的胶体金与胶体金探针的可见光吸收图谱比较示意图； 图3是本发明实施例2中的胶体金探针吸附于碱木质素上的扫描电镜图谱。
具体实施例方式
4
以下将结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。实施例1
本发明的一种用于检测漆酶吸附特性的胶体金探针，包括漆酶，漆酶表面结合有胶体金颗粒。胶体金颗粒的粒径为15 nm 20 nm, Zeta电位为-30. 5 mV -35. 5 mV。胶体金探针的粒径为450 nm 500 nm。本实施例的用于检测漆酶吸附特性的胶体金探针，是通过以下步骤制备得到的 (1)制备胶体金溶液
取质量浓度为0.01 %的HAuCl4水溶液100 mL于恒温磁力搅拌器上加热至沸腾并保持2 min，在1000 r/min的转速的搅拌条件下，快速加入质量浓度为10 g/L的柠檬酸三钠溶液6 mL ；保持温度与转速，至溶液颜色转为清亮橘红色后停止加热，继续搅拌15 min，室温冷却后，用去离子水将溶液调节到原体积，制得胶体金溶液。(2)胶体金探针的制备
用浓度为0. 1 M的乙酸将制备的胶体金溶液的pH值调节为5. 0，逐滴加入浓度为0. 9 mg/mL的漆酶溶液并混合均勻。在搅拌条件下，向20 mL的上述混合溶液中逐滴加入10 mg/ mL的PEG-20000溶液2 mL，胶体金溶液、漆酶溶液和PEG-20000溶液的三者的体积比为5 1. 1 0. 61。搅拌标记20 min后，先按1200 r/min的转速离心20 min并去除聚集物，再以 15000 r/min的转速离心1 h，轻吸弃去上清液，将所得沉淀重溶于22 mL的浓度为0. 1 M 的柠檬酸钠缓冲溶液中，该柠檬酸钠缓冲溶液中含有浓度为0. 2 mg/mL的PEG-20000，完成标记过程，制得彻底去除未结合蛋白质的胶体金探针。上述步骤中，胶体金探针的制备前，可用下述方法确定最佳的制备条件 a.确定胶体金与漆酶结合最佳pH值
用浓度为0.1 M的乙酸将胶体金溶液的pH值调节为4.0、4. 5、5.0……7. 0共7组样品，分别取0. 5 mL上述不同pH值的胶体金溶液加入小试管中，每管分别加入浓度为ang/mL 的漆酶溶液30 μ 1，混勻后室温静置5 min ；再分别向各管中加入浓度为10%的NaCl溶液 0. 1 mL,混勻后室温静置10 min。由试验结果可知，胶体金溶液的pH值为4. 5及5. 0的两管制得的混合溶液保持红色，说明胶体金与漆酶结合的最佳pH值为4. 5 5. 0。b.确定漆酶溶液的浓度
用浓度为0. 1 M的柠檬酸钠缓冲溶液稀释漆酶蛋白，调节其浓度梯度为0. 5,0. 6、 0. 7……2. 0 mg/mL共16组，pH值调节在4. 5 4. 75范围内，依次将0. ImL上述不同浓度的漆酶溶液加入到小试管中。用浓度为0.1 M乙酸调节胶体金溶液pH值为5.0，向上述各试管中加入0.5 mL胶体金，室温下静置15 min后，再向每个试管中加入浓度为10% NaCl 溶液0.1 mL，混勻后静置2 h。漆酶浓度为0.9 mg/mL及以上的试管中制得的混合溶液保持红色，说明稳定该比例胶体金的最小漆酶蛋白量为0. 9 mg/mL。使用激光颗粒分析仪检测上述制得的胶体金探针可知，本实施例的胶体金探针平均粒径为472 nm，有94. 7%分布在宽度为69. 6 nm的主峰内，粒径分布比较集中；以ABTS2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐为底物测定所制备的胶体金探针活力为 157. 71 U/L。实施例2
本发明的一种用于检测漆酶吸附特性的胶体金探针，包括漆酶，漆酶表面结合有胶体金颗粒。胶体金颗粒的粒径为15 nm 20 nm, Zeta电位为-30. 5 mV -35. 5 mV。胶体金探针的粒径为450 nm 500 nm。本实施例的用于检测漆酶吸附特性的胶体金探针，是通过以下步骤制备得到的
(1)用实施例1的方法制备胶体金溶液；
(2)胶体金探针的制备
用浓度为0. 1 M的乙酸将制得的胶体金溶液得pH值调节为5. 0，逐滴加入浓度为0. 9 mg/mL漆酶溶液并混合均勻。在搅拌条件下，向20 mL的上述混合溶液中逐滴加入10 mg/ mL的PEG-20000溶液2 mL,胶体金溶液、漆酶溶液和PEG-20000溶液的三者的体积比为5 1. 15 0. 615。搅拌标记20 min后，先按1200 r/min的转速离心20 min并去除聚集物，再以15000 r/min的转速离心1 h，轻吸弃去上清液，将所得沉淀重溶于22 mL的浓度为0. 1 M柠檬酸钠缓冲溶液，该柠檬酸钠缓冲溶液中含有浓度为0. 2 mg/mL的PEG-20000，完成标记过程，制得彻底去除未结合蛋白质的胶体金探针。使用激光颗粒分析仪检测本实施例制得的胶体金探针，其平均粒径为482 nm,有 89. 7%分布在宽度为127 nm的主峰内，粒径分布比较集中。以ABTS为底物测定所制备的胶体金探针活力为164. 17 U/L。将本实施例的胶体金探针进行电镜扫描，扫面结果如图1所示，由图可知，胶体金探针呈规则的球形，其粒径大小与激光颗粒分析仪检测结果吻合，而且比较均勻、分散性较好。分别将上述步骤制得的胶体金溶液与胶体金探针进行可见光吸收图谱分析，结果如图2所示，胶体金溶液在500nm 550 nm之间有强的吸收峰，对比制备的胶体金探针，吸收曲线在520 nm处的吸光度开始降低，由此可以推测漆酶与胶体金发生了相互作用。同时胶体金探针的吸收曲线最大峰值发生了红移及峰形展宽的现象，由此进一步判定漆酶与胶体金相互结合。结合胶体金探针扫描电镜图谱，及以ABTS为底物测定的胶体金探针活力结果，表明本发明制备的胶体金探针结合稳定且不影响漆酶活性，能实现通过电镜水平的漆酶吸附作用位点的微观定位，来检测其吸附特性的目的。应用实例
将上述制得的胶体金探针用于检测碱木质素酶解过程中漆酶的吸附特性取100 mL 的300 mg/L的碱木质素溶液，调节制得的胶体金探针的酶活性浓度，并加入6 mL上述制得的胶体金探针及ABTS于碱木质素溶液中，调节最终碱木质素溶液中胶体金探针的酶活性浓度为30 U/g，并调节体系的pH值为4. 0、ABTS浓度为10 mg/L ；温度控制在30°C 40°C 振荡(摇床转速为150 r/min)培养4 6天后，于转速为9000 r/min、温度为4°C条件下离心10 min，取上清液并真空冷冻干燥后，用电镜水平检测胶体金探针的吸附位点及吸附量， 得到如图3所示的电镜扫描照片。图3中，箭头所标异于碱木质素结构处为检测到的胶体金探针，由此可清晰地判断漆酶的吸附位点及数量。因此，利用本发明的胶体金探针可用于检测碱木质素酶解过程中漆酶的吸附特性，简单直观，操作方便。以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例， 与本发明构思无实质性差异的各种工艺方案均在本发明的保护范围内。
权利要求
1.一种用于检测漆酶吸附特性的胶体金探针，其特征在于，所述胶体金探针包括漆酶，所述漆酶表面结合有胶体金颗粒。
2.根据权利要求1所述的用于检测漆酶吸附特性的胶体金探针，其特征在于，所述胶体金颗粒的粒径为15 nm 20 nm, Zeta电位为-30. 5 mV -35. 5 mV。
3.根据权利要求1或2所述的用于检测漆酶吸附特性的胶体金探针，其特征在于，所述胶体金探针的粒径为450 nm 500 nm。
4.一种如权利要求1 3中任一项所述的胶体金探针的制备方法，包括以下步骤制备胶体金溶液并将其PH值调节为4. 5 5，向胶体金溶液中加入质量浓度不小于0.9 mg/mL的漆酶溶液，在搅拌条件下加入质量浓度为5 mg/mL 10 mg/mL的PEG-20000溶液，所述胶体金溶液、漆酶溶液与PEG-20000溶液的体积比为5 (1. 1 1. 15) (0. 6 0.65)，充分反应后，用1000 r/min 1200 r/min的转速进行第一次离心，去除聚集物，再以13000 r/min 15000 r/min的转速进行第二次离心，吸弃上清液，将沉淀重溶于柠檬酸钠缓冲溶液，定容，制得所述用于检测漆酶吸附特性的胶体金探针。
5.根据权利要求4所述的胶体金探针的制备方法，其特征在于，所述胶体金是由柠檬酸三钠法制得的，具体包括以下步骤取HAuClvK溶液于恒温磁力搅拌器上加热至沸腾并保持至少2 min,在搅拌条件下，快速加入柠檬酸三钠溶液；保持温度与转速，至溶液颜色转为清亮橘红色后停止加热并继续搅拌，室温冷却后，定容，制得胶体金溶液。
6.根据权利要求4或5所述的胶体金探针的制备方法，其特征在于，所述漆酶溶液的 PH 值为 4. 5 4. 75。
7.根据权利要求4或5所述的胶体金探针的制备方法，其特征在于，所述柠檬酸钠缓冲溶液中含有浓度为0. 2 mg/mL的PEG-20000。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测漆酶吸附特性的胶体金探针及其制备方法，所述胶体金探针包括漆酶，漆酶表面结合有胶体金颗粒。所述制备方法具体包括步骤制备胶体金溶液并将其pH 值调节为4.5～5，向胶体金溶液中加入漆酶溶液，在搅拌条件下加入PEG-20000溶液，所述胶体金溶液、漆酶溶液与PEG-20000溶液的体积比为5∶(1.1～1.15)∶(0.6～0.65)，充分反应后，进行第一次离心，去除聚集物，再进行第二次离心，吸弃上清液，将沉淀重溶于柠檬酸钠缓冲溶液，即得产品。本发明具有成本低廉、结合稳定、漆酶活性强、制备工艺简单且操作方便的优点。
文档编号C12Q1/26GK102251020SQ20111016583
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月20日 优先权日2011年6月20日
发明者冯冲凌, 危臻, 曾光明, 李宁杰, 许飘, 赖萃, 赵美花, 陈亮, 黄丹莲, 黄超 申请人:湖南大学