草酸降解菌njode1及其应用的制作方法

专利名称：草酸降解菌njode1及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种草酸降解菌NJODEl及其应用，具体涉及一种具有降解草酸、调节草酸代谢功能和防治草酸钙结石作用的菌株NJODEl，以及其在宠物食品、食品添加剂或药品生产中的应用。
背景技术：
尿结石在全球人口中发病率为6% 10%。且尿路结石中大约有70 % 80 %是草酸钙结石。并且到目前为止，由于草酸钙的低溶解性，所以治疗草酸钙结石的方法仍主要是以手术移除为主，这给患者带来了极大的痛苦。有研究报道在草酸钙结石的形成过程中， 草酸吸收和代谢异常所起的作用较钙大，它的轻微变化就能导致草酸钙结晶的产生。体内草酸的来源分为内源性和外源性两部分。内源性草酸主要是作为体内氨基酸、VC等物质代谢的终产物产生的，而外源性草酸主要是通过摄入含有草酸的食物获得的。由于脊椎动物不能利用草酸为碳源，故绝大多数草酸是经肾脏通过尿液排除的。因此食物中吸收的草酸为尿中草酸的重要来源。结肠是吸收外源性草酸的主要部位，正常情况下食物中只有3% 5%的草酸被结肠吸收。然而，一旦肠道吸收草酸的功能发生紊乱，肠道吸收的草酸就会增加，从而产生高草酸尿。尽管使用控制草酸摄入量的食谱可以降低尿液草酸浓度，但是在现实生活中，由于草酸存在于许多食物中，所以这种方法是无法实现的。对正常人来说，内源性草酸的代谢量一定，因此，减少肠道对草酸的吸收，便是预防草酸钙肾石病的发生较为可行的办法。据报道，1981年草酸钙结石发病率只占犬全部尿结石比例的5%，磷酸铵镁结石占到78%。到了 2007年，草酸钙结石发病率已升至41%，而磷酸铵镁结石的发病率则降至 40%。导致这一现象的原因是为了降低犬磷酸铵镁结石的发病率，商品粮中往往都会使用酸化剂来使动物尿液维持在PH6. 0-6. 4，酸化剂的主要成分就是草酸或草酸盐。和人类一样，食物中草酸含量的增加导致了成年健康犬尿草酸和草酸钙过饱和，从而增加了患草酸钙结石的风险。草酸是最简单的二元酸，低能量域、高还原性、酸性以及对某些酶的抑制性，这些化学性质使得大部分肠道细菌都不能利用草酸为碳源。然而，复杂的微生态环境中，也存在一些能够利用草酸的细菌。能够以草酸为唯一碳源的细菌，我们称其为“专一性”草酸降解菌；而只是将草酸作为碳源的一种的细菌，我们称其为“兼性”草酸降解菌，这类细菌能在环境恶劣的情况下利用草酸维持生命。Sidhu等人建立了利用细菌来减少尿草酸的小鼠模型，从而利用动物实验验证了产甲酸草酸杆菌的共生与草酸代谢之间的密切关系。Murphy和Weese分别从犬肠道内分离出能降解草酸的乳酸菌并进行了动物实验。Sanehlro Hokama也从大鼠的肠道中分离出能降解草酸的肠球菌，并在体外将其相关酶进行了提纯。这些实验证明，由于这些细菌能利用草酸作为能源，使肠道可吸收性草酸含量减低，所以有利于预防草酸钙结石的形成。目前有报道的能分解草酸的细菌，包括产甲酸草酸杆菌、乳酸杆菌、粪肠球菌、迟缓真杆菌、雷氏普罗威登斯菌等。虽然产甲酸草酸杆菌是唯一一株从动物肠道内分离出来的以草酸为唯一碳源的细菌，但是由于它是严格厌氧菌，对氧气特别敏感，置于空气中10分钟就会导致其死亡，一般实验室难以分离得到该菌。并且该细菌对胆盐和抗生素特别敏感，炎性肠道疾病、抗生素使用、胆囊纤维化(53% )都能导致肠道中该菌的死亡。一旦产甲酸草酸杆菌死亡，往往很难再将其在肠道定殖。因此，该菌目前只是处于研究阶段，难以大规模用于临床治疗。然而还有将近一半的胆囊纤维化患者，尽管肠道中没有定植产甲酸草酸杆菌，尿液草酸浓度仍维持正常，这说明肠道中还有其他可以利用草酸的细菌存在。因此，其他的 “兼性”菌，特别是肠道优势菌降解草酸的能力，逐渐引起科学家的关注。Murphy和Weese报道的乳酸菌，Sanehlro Hokama报道的肠球菌均有降解草酸的能力。肠球菌是人和动物肠道中的优势菌。较之其他乳酸菌，肠球菌更有耐胆盐、耐酸、 耐盐等优势。然而之前肠球菌一直被认作是致病菌。但是使用基因组重新分型后，以前的 “链球菌”属被划分为“链球菌”属，“乳球菌”属和“肠球菌”属，其中致病性的细菌仍归“链球菌”属。“肠球菌”属中的一些细菌，都已经作为益生菌成功用于人们的日常生活中。因此，从草酸钙结石发病率较低的犬中分离能够降解草酸的益生肠球菌，用于降解草酸、调节动物体内草酸代谢，不失为犬草酸钙结石的很好生物防治手段。

发明内容
本发明的目的在于提供一种草酸降解菌NJ0DE1，该菌株具有具有降解草酸、调节草酸代谢的功能和防治宠物草酸钙结石的作用，以期进一步开发利用。本发明的另一目的在于提供一种草酸降解菌NJODEl的筛选方法。本发明的又一目的在于提供所述草酸降解菌NJODEl在制备具有调节草酸代谢功能的宠物食品、食品添加剂或药品中的应用。本发明的目的可以通过以下技术方案实现一种草酸降解菌NJODE1，该菌株分类命名为屎肠球菌(Enterococcus Faecium)，于2011年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，菌种保藏号为CGMCC NO. 4581。本发明的草酸降解菌NJ0DE1，该菌株具有优异的降解草酸能力、调节草酸代谢作用、耐酸和胆盐能力、对抗生素敏感、对小白鼠无毒性、并具有良好的体内定殖作用的安全的肠球菌；通过细菌形态学、生理学和培养特征，结合法国梅里埃公司VITEK compact 2 鉴定和16srDNA序列测定并进行比对分析，最终确定该菌株为屎肠球菌(Enterococcus Faecium)。该草酸降解菌屎肠球菌NJ0DE1在Pfizer肠球菌选择性培养基上为酱紫色扁平菌落，直径1 2毫米，边缘起，表面光滑。主要生物学特性为G+，菌体为球形，大小约0. 5 0. 8 μ m，成单或双存在、无芽孢；该菌株16S rDNA的Genbank登陆号为JF895185。上述草酸降解菌NJ0DE1的筛选方法，包括以下步骤(1)从较少患草酸钙结石品种的犬的粪便中分离出肠球菌；( 通过体外检测菌株降解草酸能力，筛选出具有降草酸能力的肠球菌；C3)通过体外检测菌株耐酸、耐胆盐能力、抗生素敏感性及对小鼠的安全性并证明该菌株能够在犬体内定殖；(4)通过体内检测菌株具有降解草酸能力即为NJ0DE1。所述的草酸降解菌NJODEl在制备具有调节草酸代谢功能的宠物食品、食品添加剂或药品中的应用。上述的应用为草酸降解菌NJODEl在制备具有调节草酸代谢功能的宠物酸奶、发酵乳中的应用。具有辅助治疗或预防高草酸尿的作用。经动物实验，本发明所筛选的菌株NJODEl具有良好的耐酸和胆盐能力、良好的定殖能力，通过动物实验，进一步证实本发明的菌株对实验小鼠无毒性作用，具有明显降低尿液草酸浓度的作用。无论制成品为宠物食品、食品添加剂或药品都具有辅助治疗或预防高草酸尿的作用。微生态学研究正常微生物群与其宿主的相互关系，微生态疗法作用特异、直接、长久，无明显毒副作用。微生态调节剂——益生菌通过提高某些有利于健康的细菌的数量和活性，重建菌群平衡而对宿主起有益作用。常见的益生菌主要包括乳杆菌、乳酸链球菌、双歧杆菌、屎肠球菌等，这些细菌是健康人和动物胃肠道的正常菌群。本发明所提供的屎肠球菌NJ0DE1，具有优异的耐酸耐胆盐性、对大部分抗生素无抗生素耐药性；通过体外和动物实验证实具有很强的降解草酸能力。本发明的有益效果本发明所筛选的草酸降解菌NJODEl能在含有草酸的MRS琼脂培养基上生长。用草酸降解菌NJODEl发酵含草酸MRS发酵培养基，草酸降解率为40. 75%。本发明还提供了草酸降解菌NJODEl的扩大培养方法，产品中的菌体数量达到3. 5X 109CFU/mL。试验表明，本发明所筛选的的草酸降解菌NJODEl对酸和胆盐都有良好的耐受性。按照NCCLS的标准选择抗生素，做屎肠球菌NJODEl的耐药性试验，结果表明屎肠球菌 NJODEl对大部分抗生素无抗生素耐药性。进一步的小白鼠体内急性毒性试验证明，屎肠球菌NJODEl对小白鼠无急性毒性。 并且能够在犬体内定殖。本发明进一步用屎肠球菌NJODEl对高草酸尿的模型犬进行体内治疗研究，研究发现本发明的益生菌屎肠球菌NJODEl能减少胃肠道对食物中草酸的吸收，从而降低尿液中草酸的含量，进而降低犬草酸钙结石的发病率。


图1为屎肠球菌NJODEl的形态图(革兰氏染色，400X)。图2为屎肠球菌NJODEl的16srDNA的电泳鉴定图。其中，M为 DNAmarker (2000bp)；泳道 2 为 NJODEl 的 PCR 产物。图3为0. 5%草酸造模组的肾脏切片(HE染色，400X)。图4为0. 5%草酸+NJODEl组的肾脏切片(HE染色，400X)。
具体实施例方式本发明筛选的草酸降解菌NJODEl能在含有草酸的MRS琼脂培养基上生长。用草酸降解菌NJODEl发酵含草酸MRS发酵培养基，草酸降解率为40. 75%。本发明还提供了草酸降解菌NJODEl的扩大培养方法，产品中的菌体数量达到3. 5X109CFU/mL。
5
进一步的体外模拟胃十二指肠环境抗性研究发现，屎肠球菌NJODEl接种到pH 为2.0的酸性环境培养120min后细菌量为105CFU/mL，接种到pH为3. 0的酸性环境培养 MOmin后细菌量为106CFU/mL，表明屎肠球菌NJODEl对强酸性环境耐受良好；同时，屎肠球菌NJODEl在含0. 3%胆盐的MRS液体培养基中培养24h后细菌量为105CFU/mL，在含1 %胆盐的MRS液体培养基中培养24h后细菌量为104CFU/mL，表明屎肠球菌NJODEl对胆盐耐受良好。表明本发明的屎肠球菌NJODEl对酸和胆盐都有良好的耐受性。按照NCCLS(美国临床实验室标准化委员会)的标准选择抗生素，做屎肠球菌 NJODEl的耐药性试验，结果表明屎肠球菌NJODEl对大部分抗生素无抗生素耐药性。进一步的小白鼠体内急性毒性试验证明，屎肠球菌NJODEl对小白鼠无急性毒性。 并且能够在犬体内定殖。本发明进一步用屎肠球菌NJODEl对高草酸尿的模型犬进行体内治疗研究，研究发现本发明的益生菌屎肠球菌NJODEl能减少胃肠道对食物中草酸的吸收，从而降低尿液中草酸的含量，进而降低犬草酸钙结石的发病率。本发明的草酸降解菌NJODEl可采用现有技术的常规方法制备成药物组合物。该药物组合物含有药学有效剂量的屎肠球菌NJODEl的活菌形式。此外，所述药物组合物还可以含有合适的药物载体。所述的药物组合物可以为胶囊、溶液或可饮用悬浮液、袋装粉剂等形式，每一单一剂量一般含有屎肠球菌NJODEl约为IO9 IO11细菌量。本发明所筛选的菌株NJODEl采用现有技术的常规方法制成的药物组合物可用于宠物高草酸尿和草酸钙结石的预防和治疗，利用高效菌株代谢动物体内多余的草酸，不仅可以减少体内草酸的吸收，还可以调节体内肠道菌群，且具有很好的应用前景。本发明的屎肠球菌NJODEl还可以采用常规方法制备食品、保健品或食品添加剂， 这些食品、保健品或食品添加剂可用于宠物高草酸尿和草酸钙结石的预防和治疗。所述的食品可以是含有本发明屎肠球菌NJODEl活菌的饮料的形式，也可以是含有该活菌的乳制品、发酵乳等形式。下面通过具体的实例对本发明做进一步详细的描述。实施例1 屎肠球菌的分离与鉴定1、培养基的配制Pfizer肠球菌选择性固体培养基配方为，IL蒸馏水中含蛋白胨20. 0g，酵母浸膏 5. Og,牛胆汁物10. Og,氯化钠5. Og,柠檬酸钠1. Og,柠檬酸铁铵0. 5g，叠氮化钠0. 25g，七叶苷1. Og,琼脂15. Og,调节pH = 7. 0 7. 3 ； 121°C，高压蒸汽灭菌15min，备用。MRS液体培养基的配方为，IL蒸馏水中含蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，牛肉膏 IOg,乙酸钠 5g，柠檬酸三铵 2g，吐温 80 ImL, MgSO4 · 7H20 0. 58g，MnSO4 · 4H20 0. 05g, K2HPO4 2g，调节pH = 6. 2 6. 4;121°C，高压蒸汽灭菌15min，备用。2、样品来源在某犬场挑选不易患犬尿石症的3个品种的犬，每品种的犬各八条，公母各半。所有的犬均是饲喂商品犬粮(福斯犬粮，南京警犬研究所科技开发中心动物食品厂)。所选取的犬均无改变犬粮的历史，并且三个月内没有使用抗生素并且没有发生过腹泻。3、样品采集和分离无菌采取上述犬的粪便。在送至实验室之前，将采取的粪便4°C保存，4小时内完成细菌的分离。0. 5g粪便加入装有4. 5mL灭菌生理盐水的试管中，用涡旋仪充分震荡5分钟，制成ΙΟ—1的稀释液，再稀释得到ΙΟ"2, ΙΟ"3, ΙΟ"4, ΙΟ"5, ΙΟ"6, ΙΟ"7的稀释液。将各粪便稀释液分别取200 μ L涂布在肠球菌选择性培养基平板上，每样重复3个平皿。置于37°C厌氧培养4 后，挑取紫红色、表面光滑凸起、周边整齐、直径1. 0 1. 5mm 的菌落进行涂片、革兰氏染色、镜检，选取革兰氏染色阳性、圆形或卵圆形、单个、成对或短链状排列的菌，分别接种于MRS基础斜面上进行纯培养直至长菌落形态一致，革兰氏染色镜检形态一致确定已分纯。分纯的各株细菌可添加防冻剂后于_70°C冰箱低温保存备用。4、屎肠球菌NJODEl的鉴定(1)生化鉴定使用法国梅里埃VITEK compact 2进行生化鉴定。糖发酵结果见表1，经过分析， 表明本发明所筛选的菌株99%为屎肠球菌。表1本发明菌株的糖发酵结果
权利要求
1.一种草酸降解菌NJODEl，该菌株分类命名为屎肠球菌(Enterococcus Faecium)， 于2011年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为 CGMCC NO. 4581。
2.如权利要求1所述的草酸降解菌NJODEl的筛选方法，其特征在于包括以下步骤(1)从较少患草酸钙结石品种的犬的粪便中分离出肠球菌；(2)通过体外检测菌株降解草酸能力，筛选出具有降草酸能力的肠球菌；(3)通过体外检测菌株耐酸、耐胆盐能力、抗生素敏感性及对小鼠的安全性并证明该菌株能够在犬体内定殖；(4)通过体内检测菌株降解草酸能力即为NJ0DE1。
3.权利要求1所述的草酸降解菌NJODEl在制备具有调节草酸代谢功能的宠物食品、食品添加剂或药品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用为草酸降解菌NJODEl在制备具有调节草酸代谢功能的宠物酸奶、发酵乳中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种草酸降解菌NJODE1及其应用，分类命名为屎肠球菌(Enterococcus Faecium)，保藏号为CGMCC NO.4581。草酸降解菌NJODE1对酸和胆盐有良好的耐受性，对大部分抗生素无抗生素耐药性，对小鼠的安全，能够在犬体内定殖。NJODE1能减少胃肠道对食物中草酸的吸收，从而降低尿液中草酸的含量，进而降低犬草酸钙结石的发病率。该菌株无论制成品为食品或药品或酸奶、发酵乳都具有良好的耐酸、胆汁酸盐能力、并具有安全肠球菌，具有明显降低尿液草酸、防治宠物草酸钙结石的作用，具有广阔的应用前景。
文档编号A23L1/30GK102250799SQ20111016937
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月22日 优先权日2011年6月22日
发明者任志华, 蒋鲁岩, 陈兴祥, 黄克和 申请人:南京农业大学