利用芽孢杆菌发酵生产鸟苷的方法

专利名称：利用芽孢杆菌发酵生产鸟苷的方法
技术领域：
本发明涉及一种生产鸟苷的方法。
背景技术：
鸟苷又称鸟嘌呤核苷，化学名称为9_β-D-呋喃核糖基鸟嘌呤，英文名称为 Guanosine,分子式CltlH13N5O5，分子量观3. 24，鸟苷为白色结晶粉末、无嗅、无味；水溶液的紫外吸收高峰在256 μ m，克分子消光系数12. 2 X IO3 ； 18°C下1320ml水中溶解1克；沸水浴中，33ml水中溶解1克；可溶于酸碱，不溶于有机溶剂；熔点237-M0°C。鸟苷属于核苷类小分子化合物，在工业上主要用于抗病毒、抗肿瘤药物合成的关键中间体，以及用于大规模合成食品添加剂5’ -鸟苷酸(GMP)的原料。5’ -鸟苷酸是强烈呈味剂，其鲜味是味精(谷氨酸钠)的160倍。少量的GMP与味精混合可以提高味精鲜味10倍以上。目前GMP已被各类食品厂家作为提升产品品质和增进产品风味的首选添加剂，是特鲜酱油、鸡精、鸡粉、特鲜味精、品质改良剂、风味剂等高级调味品的主要呈味成分之一。5’ -鸟苷酸的另一大用途是作为健康食品和婴儿配方乳粉的保健型添加剂。老年人和病人核酸制造能力下降，在膳食中适当添加核苷酸，可以减缓衰老，增强体质。目前市场上销售的国产奶粉和进口奶粉，几乎都添加了一定量的各种核苷酸(GMP是其中的一个重要组分)，主要是针对早产婴儿和低出生体重婴儿从头合成和补救合成核苷酸的不足，促进婴儿的生长发育。1991年欧共体规定每420KJ婴幼儿食品中核苷酸的添加上限为 CMP2. 5mg、UMP1. 75mg、AMP1. 5mg、GMPO. 5mg、IMP1. Omg。2005 年中国卫生部 15 号公布推荐的婴幼儿奶粉中的核苷酸总添加量为0. 2 0. 58g/kg。此外鸟苷本身也可用于生产抗寒食品、减肥食品等功能性食品，因此鸟苷在食品和保健品领域的需求量非常大。利用鸟苷可以合成利巴韦林(三氮唑核苷)和阿昔洛韦(无环鸟苷)等抗病毒药物。三氮唑核苷对DNA病毒和RNA病毒有明显的抑制作用，是一种广谱核苷类抗病毒药物。 无环鸟苷也是一种广谱抗病毒药物，对于体外和体内的疱疹病毒包括单纯疱疹病毒HSV-I 和HSV-2、水痘-带状疱疹病毒(VIV)、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)等有抑制作用。因此鸟苷在医药领域作为药物合成中间体具有广阔的发展前途。发酵法生产鸟苷具有产量大、周期短、控制容易等优点，因而被国内外广泛采用。 20世纪60年代日本首先采用枯草芽孢杆菌的核酸代谢突变株大规模发酵生产鸟苷。我国对鸟苷的发酵研究始于20世纪80年代，研究报道很多，但是一直进展不大，与国外先进水平相比仍有较大差距，使得鸟苷生产成本较高，已经成为限制国内呈味核苷酸工业与核苷酸类药物发展的重要瓶颈。原因之一是国内鸟苷菌种选育仍旧采用常规的物理化学诱变方法，使得菌种的原始产苷能力不高。而国外已在分子生物学平台上，采用基因工程技术选育鸟苷高产菌株。 例如CN1046558A报道，日本武田药品工业株式会社将芽孢杆菌属微生物染色体DNA的IMP脱氢酶基因的启动子用一个不同的可表达启动子取代，使该酶的基因表达得到增强，得到的枯草芽孢杆菌NA6242菌株能摇瓶发酵积累鸟苷0克/升。又例如CN101563448A报道，日本味之素株式会社将嘌呤结构类似物抗性基因yeaS引入产嘌呤核苷的解淀粉芽孢杆菌属细胞内，使修饰后的解淀粉芽孢杆菌AJ1991(pLF-YeaS)菌株的嘌呤核苷生物合成酶基因得到增强表达，提高了肌苷和鸟苷生产能力。原因之二是国内鸟苷发酵生产工艺水平落后，仅仅局限于培养基配方调整和补料分批发酵等以最佳工艺控制点为依据的静态操作法，忽略了发酵过程中细胞代谢流的时变性和代谢调控变化对发酵影响的重要性，使得发酵罐上的产苷水平不高，转化率低。国内仅有CN101487036A报道，采用保藏菌株枯草芽孢杆菌TA208-IMPD，在发酵过程中流加碎米水解糖液，发酵50-60小时，产苷达38克/升，但转化率只有20%。另有CN101492484A介绍了一种鸟嘌呤核苷的综合循环生产工艺，采用微滤膜、超滤膜和反渗透膜提取鸟苷结晶，将湿菌体作为饲料蛋白使用，将提取鸟苷后的母液作为溶晶水和透析水循环使用。目前国内有文献报道采用生物化工过程的多尺度理论和方法研究鸟苷的发酵工艺，通过发酵培养基中加入代谢调控剂，结合发酵参数的调整，抑制氨基酸、有机酸、铵离子的积累，阻止发酵后期鸟苷代谢流的迁移，让更多的碳源流向产鸟苷途径，提高鸟苷的发酵产率，但至今未见有关此方法的专利报道。随着人们对高档次食品调味剂的要求越来越高，由此对呈味核苷酸(I+G)等新型食品增鲜剂的市场需求量增加；此外，由鸟苷合成各种药物及前体物、功能性食品的市场前景也相当乐观。因此迫切需要提升我国鸟苷的整体发酵生产技术水平，增强我国鸟苷的市场竞争力，满足社会日益增长的需要。

发明内容
本发明的目的在于提供一种提高鸟苷的发酵产量和转化率的利用芽孢杆菌发酵生产鸟苷的方法。本发明的技术解决方案是一种利用芽孢杆菌发酵生产鸟苷的方法，其特征是依次包括下列步骤⑴菌体活化将枯草芽孢杆菌CGMCC No. 4587(分类命名枯草芽孢杆菌，拉丁文学名 Bacillus subtilis，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2011年1月27日)划线接种于营养肉汤琼脂试管斜面，然后划线转接于琼脂茄子瓶斜面培养成熟，准备移种；(2)种子培养将茄子瓶斜面上的成熟菌泥制备均勻的菌悬液，将菌悬液按1-10%的接种量接入种子罐进行种子培养；或直接挑取一环活化后的试管斜面菌体，接种于三角瓶，摇瓶培养；(3)发酵培养种子培养液接入三角瓶，摇瓶培养；或接入发酵罐进行发酵罐培养；(4)鸟苷提取鸟苷发酵液经过滤、浓缩、冷冻结晶得到鸟苷粗品。
鸟苷粗品经精制得到鸟苷精品。步骤(1)中营养肉汤琼脂试管斜面培养时的培养基和琼脂茄子瓶斜面培养时的培养基均为葡萄糖5g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、NaCl 5g/L、琼脂20g/L，pH 7. 0-7. 2，培养温度均勻32°C，培养时间均为M-48小时。步骤(2)种子培养时的培养基为葡萄糖10g/L、酵母膏5g/L、蛋白胨5g/L、牛肉膏5g/L ；氯化钠2g/L、RNAO. 25g/L，pH 7. 0-7. 2 ；摇瓶培养时培养条件为往复式摇床、振幅7cm，频率108转/分、34°C、10-18小时；种子罐培养时的培养条件为种子罐搅拌转速 150-180转/分、通气量l-2m3/小时、温度34°C、10-15小时。步骤C3)发酵培养时，培养基组成为葡萄糖100g/L、酵母膏4g/L、玉米浆4g/L、 K2HPO4 2g/L、MgSO4 0. 5g/L, MnCl2 0. 01g/L、FeSO4 0. 01g/L、KCl 2g/L、CaCO3 20g/L、NH4Cl 20g/L, pH7. 0-7. 2 ；摇瓶培养的培养条件为往复式摇床、振幅7cm，频率108转/分、36°C、 72小时；发酵罐培养的培养条件为发酵罐搅拌转速100-150转/分、通气量l-2m3/小时、 36°C、60-72小时；发酵培养时加入生长因子原料-RNA，摇瓶发酵培养时RNA的添加量为一次性添加相当于培养液总重量的0. 3%，发酵罐培养时RNA的添加总量为相当于培养液总重量的0. 3 %，发酵0小时添加0. 03 %，其余0. 27 %在设定K值后，按F (t) = F (0) X e(kt) 计算出每小时添加的量进行添加，其中的第一次添加时间控制在整个发酵过程中菌体生长 OD660为最高数的1/5时添加，以后每小时添加一次，直至添加完毕；发酵罐培养过程中加入起消泡作用的豆油或泡敌。枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis JSIM-G518是一株嘌呤核苷酸代谢突变株，对腺嘌呤等嘌呤核苷酸有特殊的营养要求，必须在不明显抑制菌体生长的范围内，尽量降低发酵培养基中腺嘌呤的浓度。通过限制腺嘌呤的添加量，使细胞内的主要控制因子腺嘌呤类核苷酸的浓度保持在不能引起反馈调节的浓度，从而有利于鸟苷的积累。这个浓度是随着培养时间而变化，细胞繁殖增多，添加物的浓度随着变大。核酸RNA是细胞最易吸收利用的生长因子原料。本发明的优点本发明采用了一株枯草芽孢杆菌的嘌呤核苷酸代谢突变株Bacillus subtilis JSIM-G518进行鸟苷的发酵生产。该菌株的遗传性状稳定，关于鸟苷生物合成途径的关键酶已被阻断和加强，发酵产物单一，不积累其他核苷酸类物质。本发明依据核酸生物合成途径的代谢调控理论，针对Bacillussubtilis JSIM-G518的特殊营养需求，在种子培养阶段加入核酸RNA作为细胞生长促进剂，提高了种子培养的生物量，有利于后续发酵培养的产物积累。本发明依据代谢工程理论，在发酵培养阶段以积累产物为主要目的，采用指数函数模型F(t) =F(O)exp (kt) (k兴0)，{F(t) =F(0)Xe(kt)}进行关键生长因子核酸RNA的精细补料，这种补料方式是时变性的，在细胞生长和产物积累之间维持着动态平衡，从而最大限度地解除了鸟苷生物合成的代谢调控作用，显著提高了鸟苷发酵产量和转化率。鸟苷发酵液中含有大量菌体和蛋白等物质，会妨碍鸟苷的提取，影响鸟苷的纯度、 色泽、结晶速度，降低提取收率。离心沉降法设备昂贵，且能耗很大；膜过滤是近年来发展很快的一项分离技术，菌体和蛋白去除率高，但是目前超滤膜和反渗透膜因为材料昂贵、再生困难、过滤速率慢、易发生堵塞，而无法大规模工业化应用。陶瓷膜孔径大于超滤膜和反渗
5透膜，操作简单，使用成本低廉、易于推广。本发明将板框过滤除菌体、絮凝沉降除蛋白、陶瓷膜过滤除杂、减压浓缩与冷冻结晶等分离提取技术结合起来，并通过工序的合理组合设计，从发酵液中高收率地提取出鸟苷精品。下面结合实施例对本发明作进一步说明。枯草芽孢杆菌CGMCC No. 4587 (分类命名枯草芽孢杆菌，拉丁文学名=Bacillus subtilis，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2011年1月27日)。
具体实施例方式实施例1 (1)菌体活化将枯草芽孢杆菌CGMCC No. 4587划线接种于营养肉汤琼脂试管斜面，然后划线转接于琼脂茄子瓶斜面培养成熟，准备移种；营养肉汤琼脂试管斜面培养时的培养基和琼脂茄子瓶斜面培养时的培养基均为葡萄糖5g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、NaCl 5g/L、琼脂20g/L, pH 7. 0-7. 2，培养温度均勻32°C，培养时间均为24-48小时。(2)种子培养枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis JSIM-G518的斜面冷藏菌种，划线接种于营养肉汤琼脂试管斜面，斜面培养基组成为葡萄糖5g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、NaCl 5g/L、琼脂20g/L, pH 7.2, 32°C培养48小时，即为成熟。在无菌室的操净台上，挑取一环活化后的试管斜面菌体，接种于灭好菌的种子培养基内(500ml三角瓶，装液量30ml)。种子培养基组成为葡萄糖10g/L、酵母膏5g/L、蛋白胨5g/L、牛肉膏5g/L、氯化钠2g/L、RNAO. 25g/L, pH 7. 2，121°C、1公斤压力、灭菌15分钟。种子培养条件为往复式摇床、振幅7cm，频率108转/分、34°C、10小时。当生长 OD66tl达到0.7时，即移种。(3)发酵培养种子培养液以体积比10% (或1%、5% )的接种量接入灭好菌的发酵培养基中 (500ml三角瓶，装液量20ml)。发酵培养基组成为葡萄糖100g/L、酵母膏4g/L、玉米浆 4g/L、K2HPO4 2g/L、MgSO4 0. 5g/L、MnCl2 0. 01g/L、FeSO4 0. 01g/L、KCl 2g/L、CaCO3 20g/ L、NH4Cl 20g/L, pH 7. 2，121 °C、1公斤压力、灭菌10分钟；发酵培养时加入生长因子原料-RNA，RNA的添加量为一次性添加相当于培养液总重量的0. 3%。摇瓶发酵培养条件为往复式摇床、振幅7cm，频率108转/分、36°C、72小时。发酵结束后，电泳法测定培养液中的鸟苷产量达20. 10g/L，转化率20. 10%。实施例2 步骤(1)同实施例1。步骤⑵种子培养枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis JSIM-G518的斜面冷藏菌种，划线接种于营养肉汤琼脂试管斜面，斜面培养基组成为葡萄糖5g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、NaCl 5g/L、琼脂20g/L，pH 7.2，32°C培养48小时。然后划线转接于琼脂茄子瓶斜面(培养基组成与试管斜面相同)，32°C培养48小时，即为成熟。准备一个内装玻璃珠的无菌三角瓶，用无菌水将茄子瓶斜面上的成熟菌泥刮洗下来，装入三角瓶，振荡分散菌泥，获得均勻的菌悬液；将菌悬液按10%的接种量接入100升种子罐，种子罐的装量系数为70% (V/V)。种子培养基组成为葡萄糖10g/L、酵母膏5g/L、 蛋白胨5g/L、牛肉膏5g/L ；氯化钠2g/L、RNA0. 25g/L，pH 7. 2，121°C、1公斤压力、灭菌15分钟。种子罐培养条件为搅拌转速180转/分、通气量ail3/小时、温度34°C、15小时。 当生长OD66tl达到0.7时，即移种。(3)发酵培养种子培养液以体积比10%的接种量接入100立升发酵罐，发酵罐的装量系数为 70% (V/V) ο发酵罐培养条件为搅拌转速100 150转/分、通气量1 2m3/小时、36°C、65 小时。发酵罐培养过程中加入发酵液体积0.001 %的泡敌(V/V)。发酵培养基组成为葡萄糖 100g/L、酵母膏 4g/L、玉米浆 4g/L、K2HPO4 2g/L、MgS04 0. 5g/L, MnCl2 0. 01g/L, FeSO4 0. 01g/L、KCl 2g/L、CaCO3 20g/L、NH4Cl 20g/L, pH 7. 2，121°C、1 公斤压力、灭菌 10 分钟。发酵培养过程中RNA的添加总量为相当于培养液总重量的0. 3%，发酵0小时添加 0. 03%,其余0. 27%在设定K值=0. 12后，按F(t) = F(O) Xe(kt)计算出每小时添加的量， 并列于下表1中。第一次添加时间为发酵8小时后添加，以后每小时按表1规定的量添加一次，直至添加完毕。表IK = 0. 12时的核酸RNA补料时间表
权利要求
1.一种利用芽孢杆菌发酵生产鸟苷的方法，其特征是依次包括下列步骤(1)菌体活化将枯草芽孢杆菌CGMCC No. 4587划线接种于营养肉汤琼脂试管斜面，然后划线转接于琼脂茄子瓶斜面培养成熟，准备移种；(2)种子培养将茄子瓶斜面上的成熟菌泥制备均勻的菌悬液，将菌悬液按1-10%的接种量接入种子罐进行种子培养；或直接挑取一环活化后的试管斜面菌体，接种于三角瓶，摇瓶培养；(3)发酵培养种子培养液接入三角瓶，摇瓶培养；或接入发酵罐进行发酵罐培养；(4)鸟苷提取鸟苷发酵液经过滤、浓缩、冷冻结晶得到鸟苷粗品。
2.根据权利要求1所述的利用芽孢杆菌发酵生产鸟苷的方法，其特征是鸟苷粗品经精制得到鸟苷精品。
3.根据权利要求1或2所述的利用芽孢杆菌发酵生产鸟苷的方法，其特征是步骤(1) 中营养肉汤琼脂试管斜面培养时的培养基和琼脂茄子瓶斜面培养时的培养基均为葡萄糖5g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、NaCl 5g/L、琼脂20g/L, pH 7. 0-7. 2，培养温度均勻 32°C，培养时间均为M-48小时。
4.根据权利要求1或2所述的利用芽孢杆菌发酵生产鸟苷的方法，其特征是步骤(2) 种子培养时的培养基为葡萄糖10g/L、酵母膏5g/L、蛋白胨5g/L、牛肉膏5g/L ；氯化钠2g/ L、RNAO. 25g/L，pH 7. 0-7. 2 ；摇瓶培养时培养条件为往复式摇床、振幅7cm，频率108转/ 分、34°C、10-18小时；种子罐培养时的培养条件为种子罐搅拌转速150-180转/分、通气量l-2m3/小时、温度34°C、10-15小时。
5.根据权利要求1或2所述的利用芽孢杆菌发酵生产鸟苷的方法，其特征是步骤(3) 发酵培养时，培养基组成为葡萄糖100g/L、酵母膏4 g/L、玉米浆4 g/L、K2HPO4 2 g/L、 MgSO4 0.5 g/L、MnCl2 0. 01 g/L、FeSO4 0. 01 g/L、KCl 2 g/L、CaCO3 20 g/L、NH4Cl 20 g/ L，pH7.0- 7. 2 ；摇瓶培养的培养条件为往复式摇床、振幅7cm，频率108转/分、36°C、72小时；发酵罐培养的培养条件为发酵罐搅拌转速100-150转/分、通气量l-2m3/小时、36°C、 60-72小时；发酵培养时加入生长因子原料-RNA，摇瓶发酵培养时RNA的添加量为一次性添加相当于培养液总重量的0. 3%，发酵罐培养时RNA的添加总量为相当于培养液总重量的 0. 3%，发酵0小时添加0. 03%，其余0. 27%在设定K值后，按F (t) =F(O) Xe(kt)计算出每小时添加的量进行添加，其中的第一次添加时间控制在整个发酵过程中菌体生长OD66tl为最高数的1/5时添加，以后每小时添加一次，直至添加完毕；发酵罐培养过程中加入起消泡作用的豆油或泡敌。
全文摘要
本发明公开了一种利用芽孢杆菌发酵生产鸟苷的方法，依次包括菌体活化、种子培养、发酵培养、鸟苷提取精制等步骤。菌种采用枯草芽孢杆菌CGMCCNo.4587。本发明提高鸟苷的发酵产量和转化率。
文档编号C12P19/40GK102250989SQ201110171900
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月23日 优先权日2011年6月23日
发明者何寅琛, 匡群, 华洵璐, 叶进, 孙梅, 张一平, 诸建国, 郑惠华 申请人:江苏安惠生物科技有限公司, 江苏省苏微微生物研究有限公司