专利名称：用于膀胱癌筛查的酶标液基细胞学染色试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及膀胱癌的检测试剂盒及其应用，更确切的说是利用酶标液基细胞学技术筛查膀胱肿瘤。该技术是利用酸性磷酸酶化学染色法对液基制片法制片的细胞样本进行处理，利用该特异性染色使异常细胞胞浆内形成鲜明的红色沉淀，使异常细胞带有明显标记的技术。
背景技术：
膀胱癌是我国最常见的泌尿系肿瘤，大约90%的膀胱癌为膀胱尿路上皮癌。膀胱癌的复发率很高，60% 70%的患者可能复发，11%复发的患者可进展为浸润性肿瘤。目前对于膀胱癌诊断及随访主要依赖于膀胱镜检查和尿细胞学检查。前者为诊断膀胱癌的金标准，但为侵入性的检查，患者依从性差，价格比较昂贵，不宜作为常规检查；后者虽然特异度高且无创，但对低度表浅性的肿瘤敏感性低，容易产生假阴性的结果。因此，寻找敏感度及特异度高的膀胱癌肿瘤标志物作为膀胱癌的早期诊断、监测以及预后评估受到越来越多的关注。尿细胞学的取样方法主要有自然留尿和膀胱灌洗两种，通常取中段尿或膀胱灌洗液的中间部分作为细胞学标本来源。Badalamen等指出膀胱灌洗标本细胞学检查的灵敏度为61%，而自然留尿的灵敏度为41% ；反复留尿三次灵敏度为60%，仍低于单次膀胱灌洗细胞学检查。尿细胞学制片分析方法主要有传统涂片和新近开展的液基细胞学技术，传统涂片读片时易被红细胞干扰，而液基细胞学技术可以去除干扰诊断的杂质制成背景清晰的液基细胞片，更好地保存细胞学形态，使得观察更为容易。液基细胞学包括液基薄层细胞学技术和液基沉降细胞学技术，前者是将采集的脱落细胞转移至含有保存液的特制小瓶中，通过过滤膜过滤将细胞和杂质分离，最终在玻片上制成直径为20mm的细胞薄层，固定后行巴氏染色，一次只能处理一份标本。后者是将脱落细胞和保存液通过比重液离心后，以自然沉淀的方法将标本中的可疑细胞与杂质分离，最终在玻片上制成直径为17-20mm的细胞薄层， 可同时处理多份标本。酶标液基细胞学主要用于膀胱肿瘤的筛查。该技术是利用酸性磷酸酶化学染色法对液基制片法制片的细胞样本进行处理，利用该特异性染色使异常细胞胞浆内形成鲜明的红色沉淀，使异常细胞带有明显标记的技术。该技术将酶组织化学染色用于临床分子水平诊断，具有敏感性高，假阴性率低等特点。该技术的运用能够帮助医生迅速找到异常细胞。酸性磷酸酶(Acid Phosphatase，ACP)是溶酶体的标志酶之一，其活性反应了细胞溶酶体的激活情况。在膀胱癌变细胞中，酸性磷酸酶表达丰富，而在正常细胞中则检测不到其表达。酶标液基细胞学技术是利用异常的上皮细胞内ACP活性增高的特点，通过检测ACP 活性来甄别正常与病变细胞。目前通行的HE染色方法是液基薄层细胞制片法以及传统涂片，上述方法单纯依靠医生根据细胞形态和细胞核形态给出检查结果，工作量大，主观性较强，假阴性率高。本发明在于提供一种利用酸性磷酸酶化学染色法对液基制片法制片的细胞样本进行处理筛查膀胱癌的方法，该技术的运用能够大大增加观察的可视性，提高诊断的准确性。并且操作简单，耗时短，灵敏度高。
发明内容
本发明以酸性磷酸酶催化的特异性反应所生成产物与偶氮付品红偶联生成的红色沉淀为标记，从分子生物学层次鉴定异常细胞，保证了诊断的准确性和灵敏度。同时够助医生迅速找到病变细胞，医生在诊断时只需针对染色阳性细胞进行核型分析，减少医生工作量。结合液基细胞制片技术和常规核染色，不仅最大程度上保留了细胞形态，也使异常细胞同时具有胞浆红染和核增大、核深染的特点，使细胞核质比例异常的形态更加清晰， 使细胞信息最大化，更易于判读。酶标液基细胞学技术利用在异常膀胱移行上皮中具有高活性的磷酸酶为特异性的标志物而开发，其核心原理是利用萘酚盐作为酸性磷酸酶的底物，利用偶氮化合物与硝酸盐作用形成的重氮盐作为偶联物在异常细胞内形成红色沉淀。最近的细胞分子实验研究结果提示，肿瘤细胞中P53相对于正常细胞显著减少或表现为失去正常功能的突变，这样解除P53对细胞自噬降解系统的抑制，从而增强该系统的活性。由此可见，肿瘤细胞可能可以通过溶酶体的活性来显示。酸性磷酸酶是溶酶体的标志酶之一，可以通过检测酸性磷酸酶的活性来反映溶酶体酶的激活情况。与我们推测一致的是，正常的移行上皮细胞中酸性磷酸酶为阴性，而异常上皮细胞酸性磷酸酶为阳性。而且，现在，也没有涉及在尿样中癌细胞酸性磷酸酶高表达检测的相关研究，更没有将尿样中酸性磷酸酶高表达与膀胱癌相联系的研究。本发明研究表明，只有泌尿系肿瘤(尤其是膀胱癌)才会在尿样中检测到异常移行上皮细胞中酸性磷酸酶的高表达，即尿样中该酶的高表达对膀胱癌是特异的。酶标液基细胞学技术是据酸性磷酸酶在异常上皮细胞特异性高表达的特点开发研究的膀胱异常细胞筛查技术。临床研究表明，与传统的HE染色方法相比，该技术具有快速和高敏感的特点，为膀胱异常移行上皮细胞的诊断与普查提供了一个方便可靠的方法。本发明涉及一种膀胱癌的检测试剂盒及其应用，所述试剂盒包括酶标液基细胞学染色试剂、酶标液基细胞学保存液和沉降缓冲液。染色试剂包括由固定液、染色液、盐酸品红、亚硝酸钠、醋酸钠溶液、苏木素复染液及滤纸组成。更优选由(1)固定液10%福尔马林；(2)酶标液基细胞学染色液2-30. 5g/l萘酚AS-BI磷酸盐溶于二甲基甲酰胺(即萘酚AS-BI磷酸盐的二甲基甲酰胺溶液)；(3)盐酸品红1-10%盐酸品红；(4)亚硝酸钠0. 1-0. 5M NaNO2 ；(5)醋酸钠溶液1. 5-4. 5M，pH 4. 5-5. 9 ；(6)苏木素复染液；(7)滤纸组成。
本发明的酶标液基细胞学保存液有防腐、除去杂质、溶解红细胞的功能，使用其配合本发明的沉降缓冲液进行所述制片、染色的效果要优于传统保存液和沉降缓冲液。本发明所述保存液组成如下所示(1)45% 甲醇(2) 0. 2-0. 5mM EDTA(3) 0. ImM NaCl(4) 0. IM 醋酸缓冲液，pH 4-6(5)dd H2O本发明的沉降缓冲液同样优于传统缓冲液，其制片、染色后得到的图像更加清晰， 便于观察。本发明的沉降缓冲液有以下两种配方配方a 0. 5XPBS, pH = 7. 0-7. 4，2_5mM EDTA ；配方b IOmM Tris-HCl pH = 7. 0-7. 4，2_5mM EDTA，0. 9% (m/v)NaCl。本发明还涉及所述酶标液基细胞学染色试剂在制备用于筛查诊断膀胱癌患者的试剂盒中的用途。本发明还涉及所述酶标液基细胞学染色试剂和保存液在制备用于筛查诊断膀胱癌患者的试剂盒中的用途。另外，本发明还涉及所述酶标液基细胞学染色试剂、保存液和沉降缓冲液在制备用于筛查诊断膀胱癌患者的试剂盒中的用途。
图1 酶标液基细胞学技术传统方法制片结果照片O00X)，染红的细胞为膀胱异常细胞，病理证实为上皮内瘤变，即病变的早期。图中\指示红细胞，而^>指示异常细胞团。图2 酶标液基细胞学技术传统方法制片结果照片，其中左图为为200X ；右图为 400X ；图中蓝色盘状小颗粒为红细胞。图中\指示正常尿路上皮细胞，&指示异常细胞。图3 液基细胞沉降制片染色结果左上图为200X。左下图为左上图中异常细胞放大图，可见胞质红染，提示ACP高表达；右上图为左上图中正常的上皮细胞放大图，无胞质染红；右下图为左上图中镜片切面样核的异常细胞的放大图，同样可以见到胞质红染。图4 阳性对照膀胱癌细胞株BIU-87 (购自中国典型培养物保藏中心，武汉)酶标液基细胞学染色G00X)。可见视野内癌细胞均有不同程度的红染，且红染随核异型性程度增高而加深。图5 将膀胱癌细胞株BIU-87分别在本发明所述的酶标液基细胞学保存液和传统保存液中保存7日后的染色结果。其中，图5A为BIU-87在保存液中保存一周后，在配方a 的沉降缓冲液中自然沉降制片，酶标液基细胞学染色结果GOOx)；图5B为BIU-87在本发明保存液中保存一周后，在配方b所述沉降缓冲液中自然沉降制片，酶标液基细胞学染色结果GOOx)；图5C为BIU-87在传统保存液中保存一周后，在配套的缓冲液中自然沉降制片，酶标液基细胞学染色结果GOOx)。具体实施例
实施例1
一、酶标液基细胞学染色试剂盒成分
1)固定液10%福尔马林；
2)酶标液基细胞学染色液2-30.5g/l萘酚AS-BI磷酸盐溶于:
3)盐酸品红1-10%盐酸品红；
4)亚硝酸钠0.1-0. 5M NaNO2 ；
5)醋酸钠溶液1.5-4. 5M，pH 4. 5-5. 9 ；
6)苏木素复染液；
7)滤纸
二、保存液成分
1)45%甲醇；
2)0. 2-0. 5mM EDTA ；
3)0.ImM NaCl ；
4)0.IM醋酸缓冲液，pH 4-6 ；
.甲基甲酰胺(5)dd H2O。三、沉降缓冲液成分配方a 0. 5XPBS, pH = 7. 0-7. 4，2_5mM EDTA ；配方b IOmM Tris-HCl pH = 7. 0-7. 4，2_5mM EDTA，0. 9% (m/v)NaCl.三、取样及操作A.常规制片依常规留取清晨清洁中段尿15mL，4000rpm离心5min，倾去液体。采用传统常规方法制片细胞取出后置于两张载玻片之间，稍加压力反向拉开，即成两张厚薄均勻的涂片。 15mL尿样可制2-4张涂片。待细胞干燥后用10%福尔马林固定(试剂A) lmin，之后按照染色步骤染色。B.液基自然沉降法制片依常规留取清晨中段尿15mL，4000rpm离心5min，倾去液体。用保存液重悬细胞， 在保存液中细胞可以保存一至四周。制片时将保存液离心，倾去液体，用沉降缓冲液重悬细胞。自然沉降方法制片，10%福尔马林固定(试剂A) lmin。专用保存液有防腐、除去杂质、 溶解红细胞的功能。同时，以膀胱癌细胞株BIU-87 (购自中国典型培养物保藏中心，武汉)酶标液基细胞学染色作为阳性对照。三、染色步骤1.将固定后的涂片用水充分洗净2.将涂片放入酶标液基细胞学染色液中置于25_37°C染色20-30分钟3.用水充分洗净
4.将涂片放入苏木素复染液5分钟，流水冲洗5分钟6.封片，镜检四、染色结果图1和图2为酶标液基细胞学技术传统方法制片结果照片；图3和图4为液基细胞沉降制片染色结果。由上述图1-3中可以看到，异常上皮细胞胞质均被染红，而正常细胞无着色现象；而且液基细胞沉降制片染色结果优于传统方法制片，且结果更为明显，更加易于观察。同时，在阳性对照膀胱癌细胞株BIU-87酶标液基细胞学染色中可见视野内癌细胞均有不同程度的红染，且红染随核异型性程度增高而加深。实施例2选取临床上已经被鉴定为膀胱癌、肝癌、肺癌、大肠癌、胃癌、宫颈癌患者及健康人各3例，按照实施例1的方法取尿样，并进行酶标液基细胞学染色。结果显示，3例膀胱癌患者均出现了图1-3中的胞质染红，而在其余癌症患者尿样及健康人尿样中均无胞质染红出现。上述试验结果表明，在尿样中检测到酸性磷酸酶的高表达对膀胱癌是具有较高特异性的，本申请的方法和试剂盒能够用于筛查诊断或辅助筛查诊断膀胱癌患者。实施例3酶标液基细胞学保存液和沉降缓冲液的效果试验将膀胱癌细胞株BIU-87分别在本申请所述的酶标液基细胞学保存液和已有某保存液(购自厦门迈威生物科技有限公司)中保存7日后，配合沉降缓冲液进行制片和染色， 得到的结果如附图5所示，在本发明的酶标液基细胞学保存液和沉降缓冲液中进行的制片和染色效果(图5A、5B)效果明显好于对照组细胞保存液和沉降缓冲液(厦门迈威生物科技有限公司，图5C)。其具体比较结果如下表所示(“ + ”多表示效果更优)
权利要求
1.一种用于筛查诊断或辅助筛查诊断膀胱癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由酶标液基细胞学染色试剂、酶标液基细胞学保存液和沉降缓冲液组成。
2.权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述染色试剂由固定液、染色液、盐酸品红、 亚硝酸钠、醋酸钠溶液、苏木素复染液及滤纸组成。
3.权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的酶标液基细胞学染色试剂的具体组成如下所示(1)固定液10%福尔马林；(2)染色液2-30.5g/l萘酚AS-BI磷酸盐溶于二甲基甲酰胺；(3)盐酸品红1-10%盐酸品红；(4)亚硝酸钠0.1-0. 5M NaNO2 ；(5)醋酸钠溶液1.5-4. 5M，pH 4. 5-5. 9 ；(6)苏木素复染液；(7)滤纸。
4.权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标液基细胞学保存液的具体组成如下所示(1)45%甲醇；(2)0. 2-0. 5mM EDTA ；(3)0.ImM NaCl ；(4)0.IM醋酸缓冲液，pH 4-6 ；(5)ddH20。
5.权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的沉降缓冲液有配方a和配方b两种， 其具体组成分别为配方 a :0. 5XPBS, pH = 7. 0-7. 4，2_5mM EDTA ；配方 b: IOmM Tris-HCl pH = 7. 0-7. 4，2_5mM EDTA,0. 9% (m/v) NaCl
6.酶标液基细胞学染色试剂在制备筛查诊断或辅助筛查诊断膀胱癌患者的试剂盒中的用途，其特征在于，所述染色试剂由固定液、染色液、盐酸品红、亚硝酸钠、醋酸钠溶液、苏木素复染液及滤纸组成。
7.权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的酶标液基细胞学染色试剂的具体组成如下所示(1)固定液10%福尔马林；(2)染色液2-30.5g/l萘酚AS-BI磷酸盐溶于二甲基甲酰胺；(3)盐酸品红1-10%盐酸品红；(4)亚硝酸钠0.1-0. 5M NaNO2 ；(5)醋酸钠溶液1.5-4. 5M，pH 4. 5-5. 9 ；(6)苏木素复染液；(7)滤纸。
8.一种酶标液基细胞学保存液，其特征在于，所述保存液的具体组成如下所示(1)45%甲醇；(2)0. 2-0. 5mM EDTA ；(3)0.ImM NaCl ；(4)0.IM醋酸缓冲液，pH 4-6 ；(5)ddH20。
9.权利要求8所述的酶标液基细胞学保存液在制备筛查诊断或辅助筛查诊断膀胱癌患者的试剂盒中的用途。
10.一种沉降缓冲液，其特征在于，所述沉降缓冲液的组成如配方a或配方b所示配方 a :0. 5XPBS, pH = 7. 0-7. 4，2_5mM EDTA ；配方 b =IOmM Tris-HCl pH = 7. 0-7. 4，2_5mM EDTA,0. 9% (m/v) NaCl
11.权利要求10的沉降缓冲液在制备筛查诊断或辅助筛查诊断膀胱癌患者的试剂盒中的用途。
12.酶标液基细胞学染色试剂、权利要求8所述的酶标液基细胞学保存液和权利要求 11所述的沉降缓冲液在制备用于筛查诊断或辅助筛查诊断膀胱癌患者的试剂盒中的用途， 其特征在于，所述酶标液基细胞学染色试剂由固定液、染色液、盐酸品红、亚硝酸钠、醋酸钠溶液、苏木素复染液及滤纸组成。
13.权利要求12所述的用途，其特征在于，所述的酶标液基细胞学染色试剂的具体组成如下所示(1)固定液10%福尔马林；(2)染色液2-30.5g/l萘酚AS-BI磷酸盐溶于二甲基甲酰胺；(3)盐酸品红1-10%盐酸品红；(4)亚硝酸钠0·1-0. 5M NaNO2 ；(5)醋酸钠溶液1.5-4. 5M，pH 4. 5-5. 9 ；(6)苏木素复染液；(7)滤纸。
全文摘要
本发明涉及利用酶标液基细胞学技术筛查膀胱肿瘤，该技术是利用酸性磷酸酶化学染色法对液基制片法制片的细胞样本进行处理，利用该特异性染色使异常细胞胞浆内形成鲜明的红色沉淀，使异常细胞带有明显标记的技术。本发明提供用于上述检测的试剂盒，试剂盒主要由酶标液基细胞学染色试剂、酶标液基细胞学保存液和沉降缓冲液组成，能够提供良好的检测特异性和良好的染色效果。
文档编号C12Q1/04GK102260731SQ20111017804
公开日2011年11月30日 申请日期2011年6月28日 优先权日2011年6月28日
发明者李俊, 沈玉先, 王阳, 田添 申请人:合肥安旸生物医药有限公司