专利名称：以菊粉类生物质为原料的无酶添加生产高浓度乙醇的方法
以菊粉类生物质为原料的无酶添加生产高浓度乙醇的方法
技术领域：
本发明涉及燃料乙醇技术领域，具体地说，是一种以菊粉类生物质为原料，以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae DQl为发酵菌种，在不添加任何外源菊粉酶的条件下，利用酿酒酵母细胞自身产生的菊粉酶酶解菊粉类生物质中的聚果糖同时发酵水解后的单糖生产高浓度乙醇的方法。
背景技术：
燃料乙醇是当前世界范围内首选的石化汽油的可再生液体燃料替代品。2010年全世界燃料乙醇产业的生产能力已经接近I亿吨，所使用的原料基本都是玉米和蔗糖等粮食作物。中国2010年燃料乙醇产量约为170万吨，主要使用玉米和小麦等粮食原料。目前燃料乙醇产业的扩张已经严重影响了世界粮食市场的供给和价格。燃料乙醇的原料非粮化已经成为共识和趋势。菊芋是一种可以在干旱地、荒草地、盐碱地等边际性土地上生长的非粮 生物质，其块茎由高含量的果聚糖组成；菊芋产量高，价格低，因此在不与人争粮、不与粮争地大前提下，从菊芋块茎中发酵生产乙醇得到了广泛的关注。利用菊芋发酵生产乙醇主要是利用菊芋中大量存在的菊粉。菊粉是一种贮存性多糖，含量达菊芋块茎的干重的75-80%，是一种由呋喃构型的D-果糖经β (2— I)糖苷键脱水聚合而成的直链果聚糖混合物，其终端以α (I —2)糖苷键连接一分子葡萄糖，一般聚合度在2 60，分子量在342 9738之间。收获季节、气候、土壤以及储藏条件等都会对菊粉的平均分子量和聚合度产生重要影响。菊粉经菊粉酶水解后转化为主要是果糖，还有少量的葡萄糖，可以作为发酵和生物转化的碳源。菊粉酶是能够水解β _2，I-D-果聚糖果糖苷键的一类水解酶。很多微生物都能产生菊粉酶，如马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus、黑曲霉Aspergillus、葡萄球菌Staphylococcus和Xanthomonas等。菊粉酶有内切型和外切型。内切菊粉酶(Endoinulinase,EC3. 2. I. 7)随机地断开菊粉链内部的糖苷键，水解产物主要为低聚果糖；外切酶(Exoinulinase，EC3. 2. I. 80)作用于菊粉链的非还原性末端的糖苷键，逐一水解释放出果糖，以及聚果糖末端的一个葡萄糖分子。国内外对发酵菊芋生产乙醇进行了大量研究工作，先后报道了各种菊粉生产乙醇的工艺技术，包括先酸解或用黑曲霉等微生物产生的菊粉酶水解菊粉，再利用酿酒酵母发酵生产乙醇(分步糖化发酵法)，或者将菊粉酶和酵母细胞共同加入发酵体系后同步糖化与发酵生产乙醇(同步糖化发酵法)，或者直接利用产菊粉酶酵母发酵生产乙醇(一步法发酵)等。袁文杰等人(生物工程学报,2008,24 (11), 1931-1936)利用 Kluyveromycesmarxianus YXOl具有菊粉酶生产能力的特点,直接发酵菊芋生产乙醇。该菌株最适发酵温度为35°C。在菊粉浓度为235g/L时，发酵终点乙醇浓度达到92. 2g/L，为理论值的85. 5%。在此基础上，使用近海滩涂种植海水灌溉收获的菊芋为底物，以批式补料方式直接发酵菊芋干粉浓度为280g/L的底物，发酵终点乙醇浓度为84. Og/L，为理论值的80. 0%。
吕跃钢等人(食品与发酵工业，2003，29 (5)，66-68)将酿酒酵母细胞与菊粉酶共同固定在载体上，以菊芋为原料发酵生产乙醇。温度为30°C，pH值为5. 5，发酵液糖浓度为20 %，在发酵24h时乙醇转化率达98. 5 %，发酵醪中乙醇含量达11. 98 %。Yuan 等人(Journal of Applied Microbiology,2008,105,2076-2083)利用Kluyveromyces marxianus ATCC8544对近海滩涂种植海水和淡水混合灌溉收获的菊芋进行了发酵生产乙醇，最优的酵母生长和菊粉酶生产温度为38°C，而最优的乙醇发酵温度为350C。用干的菊芋粉分别在三个固体浓度200，225和250g/L下进行发酵，在200g/L可以得到最高的乙醇得率91. 5%，相应的乙醇和残留的总糖浓度分别为60. 9g/L和22. 2g/L。Szambelan 等(Biotechnology Letters, 2004, 26,845-848)用运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis和酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae与产菊粉酶菌种脆壁克鲁维酵母Kluyveromyces fragilis混合发酵菊芋来提高乙醇的生产。同利用菊粉酶和乙醇发酵菌种同步糖化与发酵相比，菊粉酶生产菌种和乙醇发酵菌种混合发酵的乙醇得率提高了
2-12%.利用Z. mobilis和K. fragilis混合发酵得到了最高的乙醇浓度9. 9%，相应的乙醇得率为94%。Zhang 等人(Bioresource Technology, 2010,101,8166-8170)利用重组酵母Saccharomyces sp. WO发酵菊芋生产乙醇。实验表明用于菊粉水解的最适菊粉酶活为38. 2U/g菊粉。发酵进行120h终止，最高乙醇浓度为12. 5%，相应的得率为O. 319g乙醇/
g单糖。许勤虎等(中国专利CN1952163)对菊芋块茎及茎叶进行低温蒸煮，然后加入纤维素酶，半纤维素酶和木质素酶等多种复合酶进行酶解，随后加入脆壁克鲁维酵母和乙醇活 性干酵母，或脆壁克鲁维酵母和葡萄酒活性干酵母等进行复合酵母乙醇发酵，但该专利未报道出乙醇的产量，但该专利未报道出乙醇的产量。刘建平等(中国专利CN101265485)利用克鲁维酵母所分泌产生的菊粉酶直接水解糖化菊芋原料中的多聚果糖，并同时进行发酵，产物乙醇浓度达到12% (v/v) 0鲍杰等(中国专利CN101886038A)报道了一种新型高固体含量木质纤维素原料发酵生产乙醇的反应器，该生物反应器可以对高固体含量木质纤维素原料进行搅拌，保证罐体内物料各物系充分混合、传质和传热，使酶解和发酵效率增加。考虑到燃料乙醇相对化石燃料较高的市场价格，要想实际应用，就必须降低成本。在燃料乙醇的生产中，菊粉酶的费用在燃料乙醇的成本中占据了相当大的比例，因此必须寻找便宜的菊粉酶源或者利用可产菊粉的发酵菌种，减少或者消除菊粉酶的费用。乙醇的精馏成本是燃料乙醇成本中的另一个重要方面，精馏能耗是工业生产中能耗最大的单元操作之一，一般占工厂总能耗的50% -90%。乙醇浓度的每一个百分点的提高都会伴随着精馏能耗的显著降低。达到较高乙醇浓度的先决条件是在发酵体系中加入尽可能高的菊粉类生物质固体原料，然而，发酵体系中的固体含量变大时会出现很多问题。在菌种方面，常用的可产菊粉酶的乙醇生产酵母克鲁维酵母Kluyveromyces往往不能够耐受较高的乙醇浓度。在发酵体系混合和传质方面,菊粉类生物质固体中有很多不溶性固体,如菊粉类生物质细胞壁中的果胶和纤维素，因此，当菊粉类生物质固含量增大时，固体物料和液体组分的混合就会恶化。当固体物料全部加入到反应器后，发酵醪的表观粘度也会变得很大。另外，随着发酵的进行和二氧化碳的产生，发酵醪中会形成一个复杂的固-液-气多相体系，这个多相体系会导致传质和传热效率降低，菊粉水解和乙醇发酵的效率也随之降低。因此，混合是用高固含量菊粉类生物质发酵生产高浓度乙醇过程中的一个主要障碍。而足够的混合能力、低的能量消耗和对酵母的低的剪切力是用高固含量菊粉类生物质发酵生产高浓度乙醇时反应器设计应该考虑的关键因素。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种以菊粉类生物质为原料的无外源菊粉酶添加的生产高浓度乙醇的方法，其中菊粉酶由酿酒酵母在进行乙醇发酵的同时产生，用于将菊粉类生物质中的菊粉水解为果糖，从而实现了同步产酶、糖化、乙醇发酵的过程集成。本发明的构思使用酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae DQl作为发酵菌种，同时完成菊粉酶生产、菊粉酶催化菊粉生成单糖和单糖发酵生产乙醇的高度过程集成；使用能够处理高固体含量的新型螺带桨反应器，在高固体含量菊粉类生物质原料的条件下进行高浓度的乙醇发酵。 本发明具体通过以下技术方案来实现一种以菊粉类生物质为原料的无酶添加生产高浓度乙醇的方法，其具体步骤为一、菊粉类生物质原料的处理利用菊粉类生物质发酵生产乙醇时有不同的生物质使用形式，可以是新鲜生物质，也可以是风干或烘干的块茎或切片；(I)前处理菊粉类生物质，是指将新鲜菊粉类生物质去除杂质，洗净并浙干表面水分；(2)干燥菊粉类生物质，是指用适当的切削工具将其处理成O. I 10. Ocm直径的片状或粒状形状，在通风良好的空间自然风干，或在烘干设备中烘干，以降低菊芋生物质中的水分，便于储存，防止霉烂；(3)粉碎菊粉类生物质，是指用研磨或粉碎机械将前处理过的菊粉类生物质处理成液浆状，至无明显块状存在；或将风干或烘干的生物质粉碎，粉碎后颗粒的直径不超过Icm,最佳范围为20 100目/平方英寸；二、酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae DQl 种子液的培养种子培养的菌种来源于菌种保藏平板、保藏斜面或冷冻甘油保藏管；种子培养所用培养基为酵母提取物I 30g/L,蛋白胨3 50g/L,葡萄糖5 50g/L,优选为酵母提取物10 15g/L，蛋白胨15 25g/L，葡萄糖15 25g/L ;培养条件为培养温度25 45°C，转速50 500rpm，优选为培养温度27 37°C，转速100 200rpm，种子培养时间为10 30h，OD600 值达 6 16 ;三、酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae DQl对菊粉类生物质的直接发酵发酵在新型螺带桨反应器中进行，发酵时先加入营养盐，营养盐的浓度分别是酵母提取物O. I 10. Og/L，硫酸铵O. I 10. Og/L，七水合硫酸镁O. I 10. Og/L，磷酸二氢钾O. I 20. Og/L，优选为酵母提取物I. O 2. Og/L，硫酸铵I. O 2. 0g/L，七水合硫酸镁
I.O 2. 0g/L，磷酸二氢钾2. O 4. 0g/L ;随后加入菊粉类生物质，菊粉类生物质的固体含量为15% 45% (质量百分含量)，优选为25% 35% ;种子液以I 30% (质量百分比)接入螺带搅拌桨反应器。发酵条件为发酵温度20 45°C，pH为3. O 8. 0，搅拌转速50 500rpm ;优选发酵条件为发酵温度27 34°C，pH为4. 5 5. 5，搅拌转速100 200rpm ;整个发酵体系处于无菌状态。四、操作过程将营养盐母液加入螺带桨反应器，随后加入菊粉类生物质，使其混匀，调节发酵体系的PH为3. O 8. 0，最优pH控制范围为4. 5 5. 5，加入种子液，过程取样。采用高效液相色谱法测定发酵液中的葡萄糖、果糖和乙醇的浓度。在以上方案中，所述菊粉类生物质是指含菊粉为主的聚果糖生物质，包括菊芋、菊苣、耶路撒冷洋蓟、大丽花块茎、大蒜等。进行发酵时，菊粉类生物质原料可以是研磨或粉碎机械处理的新鲜生物质，也可以磨碎的干燥生物质，也可以用纤维素酶，半纤维素酶或果胶酶处理过的菊粉类生物质。
本发明中所述菌株为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae DQl,但本发明所涉及的菌种不限于所提供的菌种，还包括能够产生菊粉酶并发酵生产乙醇的其他菌种，如Kluyveromyces marxianus, Kluyveromyces fragilis 等，以及通过诱变、基因工程等操作改造的上述菌株或其他菌株；其中，诱变筛选的菌株是指通过化学，物理以及射线等诱变改造的菌株；基因工程操作的菌株是指通过转入质粒，同源重组及改善代谢路径的菌株；此夕卜，还包括产菊粉酶的菌株和乙醇发酵菌株的共培养的情况。本发明所述的新型螺带搅拌桨生物反应器由罐体、加料口、放料口、无菌空气入口、气体分散器、PH电极、溶氧电极、温度电极、功率测定仪和一个新型螺带式搅拌桨组成，所述的螺带搅拌桨包含搅拌轴、螺带式搅拌桨、涡轮/翼型搅拌桨和刮底桨四部分；螺带式搅拌桨通过支撑杆固定在搅拌轴上，并自上而下盘旋在搅拌轴周边，构成框体；涡轮/翼型搅拌桨置于螺带式搅拌桨形成的框体内，固定在螺带式搅拌桨的上下两个端部之间的搅拌轴上；底桨固定在搅拌轴底部。本发明中所指0D_值是指含有菌体的溶液在600nm波长处的吸光值。本发明中的菌种是在粉碎过的菊粉类生物质原料加入反应器后立即加入的，没有对粉碎过的菊粉类生物质提前进行蒸煮、酸解、酶解等预处理，实现了产酶、糖化和乙醇发酵的高度过程集成。与现有技术相比，本发明的其积极效果是(I)本发明使用了一种可以产生菊粉酶的酿酒酵母，不需要向发酵体系中额外添加菊粉酶，降低了乙醇的生产成本，并且自身产生的酶的水解条件和发酵条件具有更大的一致性，便于发酵条件优化。(2)本发明在同一生物反应器中完成菊粉酶的产酶发酵、菊芋生物质的酶水解糖化和水解果糖的乙醇发酵,是一种典型整合生物加工技术(consolidated bioprocessingtechnology, CBP technology),简化了工艺过程,减少了工艺设备,缩短了发酵时间,解除了因菊粉降解产物-果糖的积累对菊粉酶生产与酶活的抑制和对酵母发酵的不利影响，利于提高菊粉水解得率、乙醇得率和乙醇浓度。(3)本发明使用了一种新型螺带桨反应器，有效解决了高粘度多相体系的混合和传递问题，为在高固含量下发酵菊粉类生物质原料生产高浓度乙醇提供了保障，进而降低了精馏工段的成本。
具体实施方式下面结合实施例对本发明一种以菊粉类生物质为原料的无酶添加生产高浓度乙醇的方法进行更详细的说明。实施例I在摇瓶中加入250mL种子培养基，营养成分浓度为酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L,把冷冻甘油保藏管中的2mL酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae DQl的菌种接入，培养温度37°C，摇床转速150rpm，培养时间18h。将一定量的无菌去离子水和营养盐母液、酿酒酵母种子液250mL和600g 60目筛分的烘干菊芋粉末加入5L螺带桨反应器，菊芋固体含量为25% (质量百分含量)，营养盐的浓度分别为磷酸二氢钾2g/L，七水合硫酸镁lg/L，硫酸铵lg/L，酵母提取物lg/L，发酵温度为37°C，pH 5. 5，搅拌转速150rpm，发酵时间72h，最终乙醇浓度92. 2g/L，得率92. I %。
实施例2在摇瓶中加入250mL种子培养基，营养成分浓度为酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L,把冷冻甘油保藏管中的2mL酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae DQl菌种接入，培养温度30°C,摇床转速150rpm,培养时间18h。将一定量的无菌去离子水和营养盐母液、酿酒酵母种子液250mL和700g 60目筛分的烘干菊芋粉末加入5L螺带桨反应器，菊芋固体含量为30% (质量百分含量)，营养盐的浓度分别为磷酸二氢钾2g/L，七水合硫酸镁lg/L，硫酸铵lg/L，酵母提取物3g/L，发酵温度为30°C，pH 5. 0，搅拌转速150rpm，发酵时间72h，最终乙醇浓度113. 8g/L，得率87. 5%。实施例3在摇瓶中加入250mL种子培养基，营养成分浓度为酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L,把冷冻甘油保藏管中的2mL酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae DQl菌种接入，培养温度30°C,摇床转速150rpm,培养时间18h。将一定量的无菌去离子水和营养盐母液、酿酒酵母种子液250mL和700g 60目筛分的烘干菊芋粉末加入5L螺带桨反应器，菊芋固体含量为30% (质量百分含量)，营养盐的浓度分别为磷酸二氢钾2g/L，七水合硫酸镁lg/L，硫酸铵lg/L，酵母提取物lg/L，发酵温度为27°C，pH 5. 5，搅拌转速200rpm，发酵时间72h，最终乙醇浓度110. 8g/L，得率85. 9%。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。
权利要求
1.一种以菊粉类生物质为原料的无酶添加生产高浓度乙醇的方法，其特征在于，具体步骤为， 一、菊粉类生物质原料的前处理 利用菊粉类生物质发酵生产乙醇时有不同的使用形式，为新鲜生物质，或者是风干或烘干的块茎或切片； 二、酿酒酵母Saccharomycescerevisiae DQ I种子液的培养 种子液培养的菌种来源于菌种保藏平板、保藏斜面或冷冻甘油保藏管；种子培养所用培养基为酵母提取物I 30g/L，蛋白胨3 50g/L，葡萄糖5 50g/L ;培养条件为温度25 45°C，转速 50 500rpm，时间 10 30h，0D600 值 6 16 ; 三、酿酒酵母Saccharomycescerevisiae DQl对菊粉类生物质的直接发酵 发酵在新型螺带桨反应器中进行，发酵时先加入营养盐，营养盐的浓度分别是酵母提取物O. I 10g/L，硫酸铵O. I 10g/L，七水合硫酸镁O. I 10g/L，磷酸二氢钾O. I 20g/L，随后加入菊粉类生物质，菊粉类生物质的固体含量为15 45% (质量百分含量)；种子液以I 30% (质量百分比)接入螺带搅拌桨反应器；发酵条件为发酵温度20 45°C，pH为3. O 8. O,搅拌转速50 500rpm ;整个发酵体系处于无菌状态；过程周期取样。
2.如权利要求I所述的以菊粉类生物质为原料的无酶添加生产高浓度乙醇的方法，其特征在于，在所述的步骤一中，所述的菊粉类生物质是指含菊粉为主的聚果糖生物质，包括菊芋、菊苣、耶路撒冷洋蓟、大丽花块茎、大蒜等。菊粉类生物质为粉碎的新鲜生物质、磨碎的干燥生物质，用纤维素酶，半纤维素酶或果胶酶处理过的菊粉类生物质或者菊粉类生物质的提取液，优选为菊芋和菊粉。
3.如权利要求I所述的以菊粉类生物质为原料的无酶添加生产高浓度乙醇的方法，其特征在于，在所述的步骤二中，种子培养所用培养基为酵母提取物I 30g/L，蛋白胨3 50g/L,葡萄糖 5 50g/L。
4.如权利要求I所述的以菊粉类生物质为原料的无酶添加生产高浓度乙醇的方法，其特征在于，在所述的步骤二中，所述的发酵菌种为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiaeDQ1，该菌种为诱变突变株，其自身可产生水解菊粉生成果糖的菊粉酶，利用此菌种发酵菊粉类生物质原料生产乙醇的过程中不需额外添加菊粉酶,实现了产酶、糖化和乙醇发酵的高度过程集成。
5.如权利要求4所述的以菊粉类生物质为原料的无酶添加生产高浓度乙醇的方法，其特征在于，所述的菌株为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae DQl,但本发明所涉及的菌种不限于所提供的菌种，还包括能够产生菊粉酶并发酵生产乙醇的其他菌种，如Kluyveromyces marxianus, Kluyveromyces fragilis 等，以及通过诱变、基因工程等操作改造的上述菌株或其他菌株；此外，还包括产菊粉酶的菌株和乙醇发酵菌株的共培养的情况。
6.如权利要求I所述的以菊粉类生物质为原料的无酶添加生产高浓度乙醇的方法，其特征在于，在所述的步骤三中，所述的新型螺带桨反应器由罐体、加料口、放料口、无菌空气入口、气体分散器、pH电极、溶氧电极、温度电极、功率测定仪和一个新型螺带式搅拌桨组成。
7.如权利要求6所述的以菊粉类生物质为原料的无酶添加生产高浓度乙醇的方法，其特征在于，所述的新型螺带搅拌桨包含搅拌轴、螺带式搅拌桨、涡轮/翼型搅拌桨和刮底桨四部分；螺带式搅拌桨通过支撑杆固定在搅拌轴上，并自上而下盘旋在搅拌轴周边，构成框体；涡轮/翼型搅拌桨置于螺带式搅拌桨形成的框体内，固定在螺带式搅拌桨的上下两个端部之间的搅拌轴上；底桨固定在搅拌轴底部。
8.如权利要求I所述的以菊粉类生物质为原料的无酶添加生产高浓度乙醇的方法，其特征在于，在所述的步骤二中，培养条件为培养温度25 45°C，转速50 500rpm。
9.如权利要求I所述的以菊粉类生物质为原料的无酶添加生产高浓度乙醇的方法，其特征在于，在所述的步骤三中，营养盐的浓度分别是酵母提取物O. I 10g/L，硫酸铵O. I 10g/L，七水合硫酸镁O. I 10g/L，磷酸二氢钾O. I 20g/L ;菊粉类生物质的固体含量为15 45%。
10.如权利要求I所述的以菊粉类生物质为原料的无酶添加生产高浓度乙醇的方法，其特征在于，在所述的步骤三中，发酵条件为发酵温度20 45°C，pH为3. O 8. 0，搅拌转速 50 500rpm。
全文摘要
本发明涉及以菊粉类生物质为原料的无酶添加生产高浓度乙醇的方法，使用酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae DQ1作为发酵菌种，在同一生物反应器内同时进行菊粉酶生产、菊粉酶催化菊粉生成单糖和单糖发酵生产乙醇，实现过程高度集成；使用能够处理高固体含量的新型螺带桨反应器，在高固体含量菊粉类生物质原料的条件下进行产酶、糖化和高浓度乙醇发酵。本发明的优点使用了一种可直接发酵菊粉类生物质生产乙醇的酿酒酵母，实现同步产酶、糖化和乙醇发酵的过程集成，免除了外源菊粉酶的添加，降低了乙醇的生产成本；使用了一种新型的螺带搅拌桨生物反应器，能够处理高固体含量、高粘度的物系，提高了发酵液中的乙醇浓度，降低了乙醇的蒸馏能耗和生产成本。
文档编号C12R1/865GK102864174SQ201110184748
公开日2013年1月9日 申请日期2011年7月4日 优先权日2011年7月4日 公开号201110184748.8
发明者鲍杰, 国立浩, 楚德强, 张建, 胡凤仙 申请人:华东理工大学