专利名称：一种产蛋白酶的寡营养细菌分离筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种产蛋白酶菌株的分离筛选方法，特别是产蛋白酶的寡营养细菌的分离筛选方法。
背景技术：
蛋白酶是当今世界上产销量最大的商业酶，广泛应用于食品、酿造、医药、纺织、皮革、洗涤剂和饲料等行业，对国民经济发展起着重要的作用。该酶类广泛分布于动物、植物、 微生物中。微生物由于生产周期短、提取工艺简单日益成为工业酶制剂的主要来源。产生蛋白酶的微生物种类繁多，目前用于蛋白酶工业生产主要的微生物菌株是芽孢杆菌。我国的蛋白酶研究近20年取得了很大的进展，目前，产酶菌株的筛选、育种、发酵、酶的纯化与制备技术日趋成熟。但是，与国外相比，我国蛋白酶研究还存在许多问题，产酶微生物资源开发不足，蛋白酶种类较少，酶制剂品种单一，价格昂贵，产量低生产成本高，应用面还不够广泛等。因此，一些产生高温、低温等酶类特殊环境微生物的研究也越来越受到关注，例如。 耐热酶与中温酶相比较，它的重要性在于热稳定性好，使用时不易因温度的生高而失活，而且在较高的温度下作用可抑制有害微生物的生长，使用耐热酶比中温酶更容易控制条件。寡营养细菌是一类在营养物质浓度很低环境条件生长的微生物，通常定义为第一次培养时能够在含碳l_15mg/L培养基上生长的细菌，该类菌具有稳定的特殊机能和遗传基因，在生物地球化学循环中起重要作用，但其分泌蛋白酶方面的生理功能还未被发现报道。新疆古尔班通古特沙漠、库姆塔格沙漠、吐鲁番火焰山是干旱、土壤贫瘠、温度高， 盐碱性大的特殊生态环境，为寡营养、耐高温等微生物生长繁殖提供了有利自然条件。因此，从该特殊环境下分离筛选营养需求低的蛋白酶高产菌株，由于其具备寡营养特点，对于提高特殊环境微生物资源的开发及利用，降低生产成本，促进酶制剂产业发展具有重要的
眉、ο
发明内容
本发明目的在于，为了解决目前存在的不足，提供一种产蛋白酶的寡营养细菌的分离筛选方法，该方法分离的样品采自新疆古尔班通古特沙漠贫瘠土壤环境，采用低营养配方，分离纯化出的36株菌均具寡营养性。通过采用明胶液化法初筛和以酪蛋白为底物复筛，从中筛选出一株产蛋白酶能力强的菌株，菌体杆状、菌落圆形。生长所需最适碳量为 15mg碳/L培养基，最适生长温度为37°C，pH6. 0，野生菌产酶活力为3000单位，所产生的酶在55°C和pH 7. 0的条件下稳定性最好。该方法选择性强，效率高，所获得的菌株营养需求低，产酶能力强，耐高温，应用于酶制剂生产将可降低成本。将可能成为一种具有重大应用前景的蛋白酶产生菌。本发明所述的一种产蛋白酶的寡营养细菌分离筛选方法，按下列步骤进行a、采样取新疆古尔班通古特沙漠0-5cm处土壤样品装入采样袋备用；
b、菌株的分离采用平板稀释分离法，将样品涂布于无机氮培养平板，温度37°C 培养48小时，获得单个菌落后，再通过划线法纯化获取纯菌株，其中无机氮培养基为 (NH4)2SO4 0.5，KH2PO4 lg, MgSO4O. 2g, NaCl 5g，CaCO3 5g，葡萄糖用量为每升培养基中含碳量为 15mg，琼脂粉 llg，蒸馏水 1000ml, pH 7. 0-7. 2 ；C、初筛将步骤b分离获得的纯菌株通过穿刺的方式接种于明胶培养基上，温度 37°C培养48小时，选取液化明胶能力强的菌株，其中明胶培养基为牛肉膏3g，蛋白胨5g， 明胶 120g，蒸馏水 1000ml, ρΗ7· 0-7. 2 ；d、复筛将步骤c初筛获得的菌株，接种于豆饼粉液体培养基中，培养基装液量 35mL/250mL三角瓶，温度37°C摇瓶振荡培养48小时，摇瓶转速200r/min，以酪蛋白为底物测酶活后筛选酶活力高的菌株即可，其中豆饼粉培养基为玉米粉20g，豆饼粉15g，麸皮 20g, Na2HPO4 0. 3g, NaH2PO4 0. 2g, MgSO4 0. 2g, CaCl2 0. 2g，蒸馏水 1000ml, pH 7-7. 2。本发明所述的一种产蛋白酶的寡营养细菌分离筛选方法，该方法包括以下步骤采样样品采自细菌新疆古尔班通古特沙漠；菌株分离纯化采用了低碳的培养基配方，平板稀释分离法获得单个菌落；初筛以明胶培养基上穿刺进行初筛，获取液化量大的菌株进行复选；复选对初选菌株进行发酵验证，通过摇瓶振荡培养后，发酵液的上清液通过紫外分光测定以酪蛋白为底物测得酶活，获取野生菌酶活在3000单位以上的菌株G-16(图1)， 将该菌接种于斜面培养基上，经培养后保存于4°C冰箱中；寡营养细菌G-16基本特性观察了所选寡营养细菌G-16的形态(见图2)、培养特征，营养需求(图3)，生长温度(图4)、pH生长温度(图5)。寡营养细菌产酶发酵液的制备将复选得到的斜面菌种G-16接种于摇瓶液体培养基中37°C摇床振荡培养48小时，获得粗酶液。酶热稳定性和pH稳定性分析通过在不同温度和不同PH条件下测定培养液(粗酶液)中的酶活，分析了酶的热稳定性(图6)和pH稳定性(图7)。
图1为本发明筛选出的液化明胶能力极强的G-16菌株。图2为本发明菌株G-16的个体形态(X 1000)。图3为本发明菌株G-16的营养需求。图4为本发明菌株G-16生长对温度的需求。图5为本发明菌株G-16生长对pH的需求。图6为本发明酶的热稳定性。图7为本发明酶的pH稳定性。
具体实施例方式下面结合说明书附图和具体实施方式
对本发明作进一步说明，并非对本发明的限制。本发明的样品取自于新疆古尔班通古特沙漠0-5cm处土壤采样，根据寡营养细菌的生理需求确定分离培养的培养基的配方，经过分离纯化获得单个菌落，以明胶和酪蛋白
4为底物进行初选和复选，最终得到1株高温蛋白酶的寡营养菌种。实施例1培养基的制备分离培养基斜面/ 平板培养基(NH4)2SO4 0. 5，KH2PO4 lg, MgSO4O. 2g，NaCl 5g， CaCO3 5g，葡萄糖(每升培养基中含碳量为15mg)，琼脂粉Ilg(液体培养基不加)；蒸馏水 1000ml, ρΗ7· 0-7. 2 ；初选培养基明胶培养基为牛肉膏3g，蛋白胨5g，明胶120g，pH7. 0-7. 2 ；复选培养基/摇瓶培养基玉米粉20g，豆饼粉15g，麸皮20g，Na2HPO4 0. 3g， NaH2PO4 0. 2g, MgSO4 0. 2g, CaCl2 0. 2g，蒸溜水 1000ml，pH 7-7. 2 ；采样取新疆古尔班通古特沙漠0-5cm处土壤样品装入采样袋备用；菌株的分离将样品采用平板稀释分离法，涂布于分离培养基(无机氮培养基)平板，温度37°C培养48小时，获得单个菌落后，再通过划线法纯化获取纯菌株，通过此方法分离出36株寡营养细菌，将其编号为Gl-36，此菌株供初选产蛋白酶用；初筛将分离获得的纯菌株分别通过穿刺的方式接种于灭菌后明胶培养基上 (5mL培养基/管)，温度37°C培养48小时，观察液化情况，选取其中2株具有液化明胶能力强的菌株；复筛将复筛培养基配制成液体培养基，取50mL培养基装入250mL三角瓶中，经 IKg压力灭菌30min后，冷却，分别将5mL初筛获得的两株菌株的菌悬液(取一环斜面菌种放入5mL无菌水中摇勻为菌悬液)，接种于液体培养基中，温度37°C摇瓶振荡培养48小时， 摇瓶转速200r/min，以酪蛋白为底物测酶活后筛选酶活力高的菌株即可。结果表明G-16的酶活为3000单位(图1- ，将该菌接种于斜面培养基上温度4°C保存。通过本发明所述的方法获得的菌株G-16的基本特性观察形态和培养特性观察取温度37°C培养48小时的斜面菌种在光学显微镜下观察， 结果表明菌株G-16为杆状(见图2)；菌落圆形，湿润，隆起明显，边缘整齐，淡土黄色。不同碳量对菌株G-16生长的影响以分离培养基= (NH4)2SO4 0. 5，KH2PO4 Ig, MgSO4 0. 2g，NaCl 5g，CaCO3 5g，葡萄糖，蒸馏水1000ml，pH7. 0-7. 2配制成液体培养基，分别制备使得每升培养基中的含碳量分别为lmg、5mg、10mg、15mg或20mg的培养基，接种后温度37°C培养48天，菌体生长以Du 800型分光光度计680nm处所测定的光密度值大小表示， 结果表明G-16生长的最适碳量为15mg/L培养基，进一步表明了其寡营养性。不同温度对菌株G-16生长的影响在斜面/平板培养基的液体培养基中，接种后置温度10°C、20°C、30°C、37°C、40°C、45°C、50 V、60°C或70 V培养48小时，菌体的生长量以 Du 800型分光光度计680nm处所测定的光密度值的大小表示，结果表明该菌的最适生长温度为37°C。不同pH值对菌株G-16生长的影响在斜面/平板培养基的液体培养基中，分别调 PH值为5、6、7、8、9、10或11，接种后温度37°C培养48小时，菌体的生长量以Du 800型分光光度计680nm处所测定的光密度值的大小表示，结果表明该菌的最适生长pH为6. O。粗酶液的制备和酶活力测定粗酶液的制备按照摇瓶培养基配方配制培养液，摇瓶培养基玉米粉20g，豆饼粉 1 ，麸皮 20g, Na2HPO4 0. 3g, NaH2PO4g 0. 2g, MgSO4O. 2g, CaCl2 0. 2g，蒸馏水 1000ml，pH7-7. 2，培养基装量为50πι ν250ιΛ，Ikg压力灭菌30min，冷却后，保存于4°C冰箱中，从斜面菌种取一环接种于250毫升的三角瓶中，200转/分，温度37°C振荡培养60小时获得菌株 G-16产酶发酵液，发酵液经lOOOr/min离心25分钟，上清液即为粗酶液。蛋白酶活力测定采用福林酚法，在温度60°C下每分钟水解酪素产生1微克酪氨酸定义为一个酶活力单位，采用乳酸缓冲液系统。酶热、pH稳定性分析酶热稳定性酶的热稳定性以酪蛋白为底物，取酶液在温度55-90°C测得酶活力结果(图6)表明，该酶在温度55°C，1小时活力在90%以上，温度60°C，1小时酶活力是原来的65%，经温度90°C，1小时酶活力未完全丧失，证明菌株G-16产生的酶热稳定性能较好为耐热酶。酶的pH稳定性酶液用不同pH的乳酸缓冲液稀释100倍，于温度37°C保持48小时，测定酶活力结果(图7)表明，以酪蛋白为底物时，该酶在pH6. 0-8. O比较稳定，酶活均在96%以上，7. O最稳定，酶活为原来的100%。
权利要求
1. 一种产蛋白酶的寡营养细菌分离筛选方法，其特征在于按下列步骤进行a、采样取新疆古尔班通古特沙漠0-5cm处土壤样品装入采样袋备用；b、菌株的分离采用平板稀释分离法，将样品涂布于无机氮培养平板，温度37°C培养 48小时，获得单个菌落后，再通过划线法纯化获取纯菌株，其中无机氮培养基为(NH4)2SO4 0.5，KH2PO4 IgjMgSO4O. 2g, NaCl 5g，CaCO3 5g，葡萄糖用量为每升培养基中含碳量为15mg， 琼脂粉 llg，蒸馏水 1000ml，pH 7. 0-7. 2 ；c、初筛将步骤b分离获得的纯菌株通过穿刺的方式接种于明胶培养基上，温度37°C 培养48小时，选取液化明胶能力强的菌株，其中明胶培养基为牛肉膏3g，蛋白胨5g，明胶 120g，蒸馏水 1000ml，pH7. 0-7. 2 ；d、复筛将步骤c初筛获得的菌株，接种于豆饼粉液体培养基中，培养基装液量 35mL/250mL三角瓶，温度37°C摇瓶振荡培养48小时，摇瓶转速200r/min，以酪蛋白为底物测酶活后筛选酶活力高的菌株即可，其中豆饼粉培养基为玉米粉20g，豆饼粉15g，麸皮 20g, Na2HPO4 0. 3g, NaH2PO4 0. 2g, MgSO4 0. 2g, CaCl2 0. 2g，蒸馏水 1000ml, pH 7-7. 2。
全文摘要
本发明涉及一种产蛋白酶的寡营养细菌分离筛选方法，该方法分离的样品采自新疆古尔班通古特沙漠贫瘠土壤环境，采用低营养配方，分离纯化出的36株菌均具寡营养性。通过采用明胶液化法初筛和以酪蛋白为底物复筛，从中筛选出一株产蛋白酶能力强的菌株，菌体杆状、菌落圆形。该方法选择性强，效率高，所获得的菌株营养需求低，产酶能力强，耐高温，应用于酶制剂生产将可降低成本。将可能成为一种具有重大应用前景的蛋白酶产生菌。
文档编号C12R1/01GK102268392SQ20111019409
公开日2011年12月7日 申请日期2011年7月12日 优先权日2011年7月12日
发明者吴楠, 张元明, 潘惠霞, 牟书勇, 程争鸣, 齐晓玲 申请人:中国科学院新疆生态与地理研究所