专利名称：水稻种子谷蛋白GluD-1基因终止子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种水稻种子谷蛋白GluD-I基因终止子及其应用。
背景技术：
植物生物技术的最新发展不仅实现了传统农艺性状的改良(如提高作物产量，增强抗病、抗虫、抗除草剂特性，改良品质等)，而且使植物成为生物医药和工业产品的生物反应器。绝大多数禾本科作物具有产量高、生产成本低、耐储藏、生产规模容易控制、可直接食用等特点，并且其具备体内翻译后修饰的能力，因而成为第二代转基因产物的理想载体。近年来利用水稻种子生产具有保健作用的外源蛋白和可食性疫苗研究发展很快，且已经取得了巨大成功。如维生素A、具有降低血糖作用的大豆球蛋白(Glycinin)、具有预防和治疗缺铁性贫血和提高自身免疫功能的大豆铁蛋白(Ferritin)、具有刺激胰岛素分泌预防糖尿病发生功能的GLP、乙肝疫苗和花粉过敏症疫苗等均成功地在水稻中表达并高水平累积。然而，进一步实现外源基因的高效表达必须在转录和转录后水平同时提高基因表达。启动子主要在转录水平调控基因表达，终止子则在转录和转录后水平同时起调控作用。尽管目前广泛应用的终止子，如NOS、0cS，与异源启动子组合后可启动报告基因在植物中的高表达，能够满足生物化学、生理学以及细胞定位方面的研究需求。然而，对于其他能够提高基因表达的终止子研究较少。由于一些重要农艺性状以及植物次生代谢产物都是由多基因控制，提高单个基因的表达对于相关性状改良作用不明显。通过传统转化方法， 如重复转化或杂交来实现多基因转化却费时费力。近年来发展起来的多基因转化系统可以在一个表达载体中同时插入多个基因，为了避免转基因同源性过高引起的转基因沉默，这些基因需要由不同的启动子驱动表达，不同的终止子终止转录。
发明内容
本发明的一个目的是提供一个终止子，名称为tGluD-Ι，该终止子与nos终止子相比，可以提高外源基因的表达水平。本发明所提供的终止子，为如下1)或2)或3)的DNA分子1)由序列表中序列1所示的核苷酸序列组成的DNA分子；2)与1)限定的DNA的序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性的分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交的分子。所述严格条件可为如下50°C，在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0. 5M Na3PO4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50°C，2XSSC，0. SDS中漂洗；还可为50°C，在7% SDS、0. 5M Na3POjP ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50°C，1 X SSC，0. SDS中漂洗；还可为50°C，在 7% SDS,0. 5M Na3PO4禾口 ImM EDTA 的混合溶液中杂交，在 50°C，0. 5X SSC, 0. SDS 中漂洗； 还可为50°C，在 7% SDS,0. 5M Na3POjP ImM EDTA 的混合溶液中杂交，在 50°C，0. IX SSC,
30. 1% SDS中漂洗；还可为50°C，在7% SDS,0. 5M Na3PO4和ImM EDTA的混合溶液中杂交， 在65°C，0. 1XSSC，0. 1% SDS中漂洗；也可为在6XSSC，0. 5% SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用 2 X SSC, 0. 1% SDS 和 1XSSC，0. 1% SDS 各洗膜一次。其中，序列表中序列1由589个核苷酸组成。含有所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒也属于本发明的保护范围。可用现有的植物表达载体构建含有所述DNA分子的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pROKII、pBin438、 PCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391_Xa 或 pCAMBIA1391-Xb (CAMBIA公司)等。使用所述DNA分子构建重组植物表达载体时，在外源基因转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子(如花椰菜花叶病毒(CAMV) 35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin))、组成型启动子或组织特异表达启动子(如种子特异表达的启动子)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的DNA分子构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个外源基因序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工， 如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptll基因， 赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对 methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。所述重组载体具体可为pGluB-3-tGluD-l。所述pGluB-3-tGluD-l是将 pGluB-3-nos中的nos终止子替换为序列表中序列1所示的tGluD_l终止子得到的重组载体。所述表达盒是指由启动子、由所述启动子启动转录的目的基因和位于所述目的基因下游的所述DNA分子组成的。其中，所述启动子可为组成型启动子或组织特异表达启动子(如胚乳特异性启动子)。所述目的基因可为蛋白编码基因和/或非蛋白编码基因；所述蛋白编码基因优选为品质改良基因；所述非蛋白编码基因为正义RNA基因和/或反义RNA 基因。本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。本发明所提供的培育转基因植物的方法，是将含有所述DNA分子的表达盒导入目的植物中，得到所述目的基因表达水平高于将如下表达盒导入所述目的植物的转基因植物将所述的表达盒中的所述DNA分子替换为胭脂碱合成酶的nos终止子得到的表达盒。所述目的植物具体可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体可为水稻，小麦，玉米，高粱或大麦，所述双子叶植物具体可为大豆，油菜，棉花，烟草，马铃薯，甘薯或油桐。所述转基因植物理解为不仅包含将所述含有所述DNA分子的表达盒转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该含有所述DNA分子的表达盒，也可用常规育种技术将该含有所述DNA分子的表达盒转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述DNA分子在培育转基因植物中的应用或作为终止子的应用也在本发明的保护范围内。利用本发明的终止子与不同的启动子配合，可提高外源基因在目的植物中的表达和累积水平，可改良种子品质、将具有生理活性的蛋白或短肽导入种子中创制保健型功能新品种、利用种子作生物反应器生产有用外源蛋白或可食性疫苗，增加农产品科技附加值等。本发明的终止子及其应用为利用生物技术改良种子品质、分子医药农场等研究奠定了基础，具有极大的应用前景。
图1为从水稻基因组DNA中PCR扩增谷蛋白GluD-I基因终止子(tGluD_l)的电泳图谱。其中1为DNA分子量标准，2为GluD-I终止子的片段。其中，标准分子量大小由下至上依次为0. Ikb, 0. 2kb,0. 3kb,0. 4kb，0. 5kb，0. 6kb，0. 7kb,0. 8kb,0. 9kb, 1. Okb, 1. 2kb,
1.5kb，2. 0kb，3. 0kb，4. 0kb，5. 0kb，6. 0kb，8. Okb, 10. Okb。图2为载体pMD-tGluD-1经Sac I和EcoR I的双酶切鉴定图谱。其中1为DNA 分子量标准，2为pMD-tGluD-1的酶切片段。其中，标准分子量大小由下至上依次为100bp， 250bp, 500bp, 750bp, IOOObp, 2000bp, 3000bp, 5000bp,酶切片段由下至上依次为tGluD_l， 589bp ；pMD-tGluD-1 载体框架片段，2700bp。图 3 为载体 pGluB-3-tGluD-l 的结构示意图。GluD-ΙΤ 代表 tGluD-1。图4为载体pGluB-3-tGluD-l经Sal I和EcoR I双酶切的鉴定图谱。其中1为 DNA分子量标准，2为pGluB-3-tGluD-l的酶切片段。其中，标准分子量大小由下至上依次为0. Ikb, 0. 2kb,0. 3kb, 0. 4kb，0. 5kb, 0. 6kb，0. 7kb, 0. 8kb，0. 9kb, 1. Okb, 1. 2kb, 1. 5kb,
2.Okb, 3. Okb, 4. Okb, 5. Okb, 6. Okb, 8. Okb, 10. Okb,酶切片段由下至上依次为tGluD_l 与 GUS 融合后片段 2. 5kb, pGluB-3-tGluD-l 去除 tGluD-Ι 与 GUS 后片段，14. 7kb。图5为部分转pGluB-3-tGluD-l载体Ttl代水稻植株嵌合引物PCR扩增电泳图谱。 1为DNA分子量标准，2为以pGluB-3-tGluD-l为模板的阳性对照，3为以未转化株系为模板的阴性对照，4 15为转pGluB-3-tGluD-l植物表达载体的再生植株。图6为未转基因的野生型水稻Kitaake植株⑶S染色结果。其中，1、2、3、4分别为未转基因的野生型水稻Kitaake植株根、茎、叶及种子的染色结果。图7为Ttl代转基因水稻Kitaake/pGluB-3-nos植株GUS染色结果。其中，1、2、3、 4分别为转pGluB-3-nos植株根、茎、叶及种子的染色结果。图8为TO代转基因水稻Kitaake/pGluB-3-tGluD-l植株⑶S染色结果。其中，1、 2、3、4分别为转pGluB-3-tGluD-l植株根、茎、叶及种子的染色结果。图9为Ttl代转基因水稻Kitaake/pGluB-3-tGluD-l所结种子的⑶S荧光活性测
定结果。图10为T1代转基因水稻Kitaake/pGluB-3-tGluD-l所结种子的⑶S荧光活性测
定结果。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、水稻种子谷蛋白GluD-I基因终止子(tGluD-Ι)的获得根据水稻谷蛋白GluD-I基因的cDNA序列(GenBank号为AY429650)，从GenBank 中查找谷蛋白GluD-I基因的基因组DNA序列，终止密码子后589bp的序列即为本发明的水稻种子谷蛋白GluD-I基因终止子(tGluD-Ι)，设计引物扩增tGluD-Ι。为便于载体构建，在引物上分别添加酶切位点(下划线所示)。tGluD-Ι的正向引物为tGluD-1 SacF 5' -AAG AGCTCAACTTATAGATTATGAGTAC-3‘ (Sac I)，反向引物为 tGluD-1 EcoR 5' -AGMTTCGTGACG TATCTCTCTTT-3‘ (EcoR I)。CTAB 法从野生型水稻 Kitaake (文献 Qu et al.，J. Exp. Bot. 2008,59 2417-2424) 叶片中小量提取基因组DNA，以其为模板，以tGluD-1 SacF和tGluD-1 EcoR为引物，PCR扩增 tGluD-Ι 序列。反应程序为94°C预变性 5min,然后 94°C 30sec, 55°C 30sec, 72°C lmin, 30 个循环，最后72°C IOmin0 PCR扩增得到589bp的目的条带，如图1所示。回收扩增产物，直接连接到PMD18-T载体(购自TaKaRa公司)上，进行测序，结果表明，扩增得到的tGluD-1 序列大小为589bp，具有序列表中序列1的核苷酸序列。将测序检测表明含有tGluD-Ι片段的重组载体命名为pMD-tGluD-1。pMD-tGluD-1经Sac I和EcoR I的双酶切鉴定图谱如图 2所示。实施例2、水稻种子谷蛋白GluD-I基因终止子(tGluD_l)的稳定表达载体构建1、tGluD-Ι融合⑶S基因的植物稳定表达载体构建用Sac I和EcoR I双酶切pMD_GluD_l质粒，回收tGluD-Ι的589bp酶切片段，将该片段插入到含有GluB-3启动子的pGluB-3-nos的SacI和EcoR I双酶切识别位点之间构建稳定转化载体pGluB-3-tGluD-l (其结构示意图如图3所示)。pGluB-3-nos按照文献 Qu et al.，J.Exp. Bot. 2008,59 :2417_2424所述的方法构建以水稻台中65的基因组DNA 为模板，以GluB-3正向引物5， -CCCAAGCTTATTTTACTTGTACTGTTTAACC-3‘ (HindIII)禾口GluB-3 反向引物 5，AAACCCGGGAGCTTTCTGTATATGCTAATG-3‘ (SmaI)为引物，PCR扩增得到GluB-3启动子，将GluB_3启动子用HindIII和SmaI双酶切，插入到 pGPTV-35S-HPT(Qu et al.，J. Exp. Bot. 2008,59 2417-2424)的 GUS 上游的 HindIII 和 SmaI位点，得到的重组载体即为pGluB-3-nos。pGPTV-35S_HPT以⑶S为外源基因，nos为终止子。将得到的重组载体pGluB-3-tGluD-l在PCR鉴定的基础上利用Sal I和EcoR I 进行双酶切鉴定，如图4所示。2、转pGluB-3-tGluD-l水稻的获得及pGluB-3_nos水稻再生植株的获得构建完成的pGluB-3-GluD-l表达载体构建经过酶切与测序验证其正确性后， 利用冻融法分别导入农杆菌EHA105中，具体方法如下吸取7μ1表达载体质粒加入 ΙΟΟμ 1ΕΗΑ105农杆菌感受态细胞中，轻弹混勻后置于液氮中冷冻7min，之后转入37°C水浴中静置3min，然后加入800ulYEB液体培养基于28°C静置恢复培养3h 5h，取400 μ 1菌液涂布于YEB抗性平板上(卡那霉素50mg/L，利福平Rif 50mg/L)，于28°C倒置培养2 3 天。挑取少许农杆菌单菌落进行目标基因的菌落PCR检测后将阳性菌落在YEB抗性平板上划线扩繁培养，利用农杆菌侵染法转化水稻品种kitaake的愈伤组织，用潮霉素筛选抗性愈伤，并进一步培养分化成幼苗后移栽温室。利用潮霉素筛选方法(按照文献Hiei et al.，Plant J. 1994，6 :271_282所述方法进行)，获得14株Ttl代转pGluB-3-tGluD-l水稻植株。利用PCR方法对上述筛选得到的部分转pGluB-3-tGluD-l水稻进行PCR分子检测，PCR引物为tGluD_l和⑶S基因序列的嵌合引物，即tGluD-l 序列反向引物 tGluD-1 EcoR 5' -AGAATTCGTGACGTATCTCTCTTT-3‘ 和GUS序列内部的正向引物⑶SF185 -TCGTCGGTGAACAGGTATGG-3‘。PCR反应程序为 94°C预变性 5min，然后 94°C 30sec,55°C 30sec,72°C lmin，30 个循环，最后 72°C IOmin0 PCR 扩增得到770bp的目的条带即为检测阳性。结果表明PCR检测的14株转pGluB-3-tGluD-l 植株(表示为Kitaake/pGluB-3-tGluD-l)均呈阳性(如图5所示)。按照上述方法，将pGluB-3-nos转入野生型水稻Kitaake，得到9株转pGluB-3-nos 的阳性转pGluB-3-nos水稻植株(表示为Kitaake/pGluB-3-nos)。转pGluB-3-nos水稻植株的 PCR 检测方法以 tnos 序列反向引物 tnosR 5' -GATCTAGTAACATAGATGAC-3‘和 GUS 序列内部的正向引物GUSF185 5 ‘ -TCGTCGGTGAACAGGTATGG-3 ‘为引物，扩增tnos和GUS 基因的嵌合序列，得到500bp的目的条带即为阳性转化株。T0代转基因植株所结的种子和由该种子长成的植株为T1代，依此类推，T2、T3分别表示转基因植株第2代和第3代。实施例3、水稻种子谷蛋白GluD-I基因终止子(tGluD_l)的功能验证1、T0代转基因水稻Kitaake/pGluB-3-tGluD-l的⑶S组织化学检测对PCR检测为阳性的转基因水稻Kitaake/pGluB-3-nos和Kitaake/ pGluB-3-tGluD-l的Ttl代植株进行组织化学染色，以未转基因的野生型水稻Kitaake植株为对照。具体步骤为将转基因水稻 Kitaake/pGluB-3-nos 和 Kitaake/pGluB-3-tGluD-lT。 代植株和未转基因的野生型水稻Kitaake植株的部分叶片、根、茎杆组织切成小块；将开花后17天的灌浆期种子用解剖刀从中部纵切开。将处理好的样品浸泡于GUS染色反应液(0. IM磷酸钠缓冲液(pH 7. 0)，IOmM Na2-EDTA (pH7. 0)，5mM铁氰化钾，5mM亚铁氰化钾， 1. OmM X-Gluc, 0. 1% Triton X-100)，37°C反应 0. 5-4 小时。70% 乙醇中保存、观察。体视镜下观察并拍照。结果如图6、图7、图8所示未转基因的野生型水稻Kitaake植株的根、叶片、茎杆和开花后17天的种子的糊粉层和亚糊粉层均未观察到⑶S表达；Ttl代转基因水稻 Kitaake/pGluB-3-nos 和 Kitaake/pGluB-3-tGluD-l 植株的根、叶片、茎杆均未观察到 GUS 表达，而开花后17天的种子的糊粉层和亚糊粉层均有⑶S表达。结果表明pGluB-3-tGluD-l 与pGluB-3-nos在胚乳中表达强度相似，tGluD_l和nos终止子均未改变胚乳特异性表达。2、T0及T1代转基因水稻Kitaake/pGluB-3-tGluD-l的GUS荧光活性测定对PCR检测为阳性的转基因水稻Kitaake/pGluB-3-nos和Kitaake/ pGluB-3-tGluD-l的Ttl代及T1代植株开花后17天的灌浆期种子进行⑶S定量分析。方法按照 Jefferson 等的荧光检测方法(Jefferson, Plant Mol. Biol. Report, 1987,5 :387_405) 进行。具体为每株取3粒种子，分别置于3个1.5ml印pendorf管中，用研棒将种子碾碎， 加入200 μ 1抽提液(50mM磷酸钠缓冲溶液(ρΗ7· 0)，IOmM β -巯基乙醇，IOmM Na2EDTA (pH
78. 0) ,0. 1% SDS, 0. 1 % Triton X-100)，振荡混勻。4°C 13，OOOrpm 离心 5min,取上清于新管中。10 μ 1上清，加入90 μ 1反应液(ImM 4-MUG溶于GUS抽提液)，37°C反应60分钟，加入 900 μ 1终止液(0. 2Μ Na2CO3)，室温终止反应。以4-MU做标准曲线，用F-4500 (日立)型荧光分光光度计在360nm激发波长和460nm吸收波长下检测相对4-MU含量。以牛血清白蛋白为对照，利用BIO-Rad Protein Assay Kit II (购自美国伯乐公司，编号GPR6611)测定蛋白质含量。对转基因株系Ttl代所结种子进行⑶S活性测定结果如图9所示。在14个Kitaake/ pGluB-3-tGluD-l的Ttl株系中，GUS活性最高值为37. 88pmol 4-MU mirT1 μ 蛋白，最低值为 1.81pmol 4-MU mirT1 μ 蛋白，平均值为 14. 5士 11. 2pmol 4-MU mirr^g—蛋白。而 9 个 Kitaake/pGluB-3-nos 的对照 T0 株系中，GUS 活性最高值为 17. 38pmol 4-MU mirT1 μ
蛋白，最低值为 2. 39pmol 4-MU mirT1 μ 蛋白，平均值为 11. 2士5. Opmol 4-MU mirT1 μ 蛋白。转pGluB-3-tGluD-l载体最大值是后者最大值的2. 18倍，是其最小值的15. 84倍， 平均值为对照平均值的1. 3倍。对转基因株系部分的T1代所结种子进行GUS活性测定结果如图10所示。3个 Kitaake/pGluB-3-tGluD-l 的 T1 株系 GUS 活性最高值为 20. 33pmol 4-MU mirT1 μ g4 蛋白， 最低值为 9. 42pmol 4-MU mirT1 μ 蛋白，平均值为 14. 7士5. 5pmol 4-MU min-1 μ ^ 白。而7个对照Kitaake/pGluB-3-nos的T1株系中，则GUS活性最高值为21. 52pmol 4-MU mirT1 μ g—1 蛋白，最低值为 2. 82pmol 4-M-U mirT1 μ g—1 蛋白，平均值为 9. 9 士 5. 8pmol 4-MU mirT、g—1蛋白。前者平均值为对照的1.47倍。结果表明，tGluD-Ι与nos终止子相比增强了外源基因在水稻胚乳中的表达水平。
权利要求
1.DNA分子，其特征在于所述DNA分子为如下1)或2)或3)的分子1)由序列表中序列1所示的核苷酸序列组成的DNA分子；2)与1)限定的DNA的序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性的分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交的分子。
2.含有权利要求1所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病
3.根据权利要求2所述的表达盒，其特征在于所述表达盒由启动子、由所述启动子启动转录的目的基因和位于所述目的基因下游的权利要求1所述的DNA分子组成。
4.根据权利要求3所述的表达盒，其特征在于所述启动子为组成型启动子或组织特异表达启动子，所述组织特异表达启动子为胚乳特异性表达启动子。
5.根据权利要求3或4所述的表达盒，其特征在于所述目的基因为蛋白编码基因和/ 或非蛋白编码基因；所述蛋白编码基因优选为品质改良基因；所述非蛋白编码基因为正义 RNA基因和/或反义RNA基因。
6.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求3-5中任一所述的表达盒导入目的植物中，得到所述目的基因表达水平高于将如下表达盒导入所述目的植物的转基因植物将权利要求3所述的表达盒中的权利要求1所述的DNA分子替换为nos终止子得到的表达盒。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述单子叶植物为水稻，小麦，玉米，高粱或大麦，所述双子叶植物为大豆，油菜，棉花，烟草，马铃薯，甘薯或油桐。
9.权利要求1所述的DNA分子在培育转基因植物中的应用。
10.权利要求1所述的DNA分子作为终止子的应用。
全文摘要
本发明公开了一种水稻谷蛋白GluD-1基因终止子及其应用。该终止子为一种DNA分子，为如下1)或2)或3)的分子1)由序列表中序列1所示的核苷酸序列组成的DNA分子；2)与1)限定的DNA的序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性的分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交的分子。利用本发明的终止子与不同的启动子配合，可提高外源基因在目的植物中的表达和累积水平，为利用生物技术改良种子品质、分子医药农场等研究奠定了基础，具有极大的应用前景。
文档编号C12N5/10GK102250906SQ201110197678
公开日2011年11月23日 申请日期2011年7月15日 优先权日2011年7月15日
发明者曲乐庆, 李文静 申请人:中国科学院植物研究所