专利名称：仔猪水肿病灭活疫苗的制备方法及其产品的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种灭活疫苗的制备方法，尤其涉及仔猪水肿病灭活疫苗的制备方法以及由该制备方法得到的灭活疫苗产品，属于仔猪水肿病灭活疫苗的生产领域。
背景技术：
仔猪水肿病(Edema disease,ED)病原属于肠杆菌科埃希菌属大肠埃希菌种，产类志贺毒素大肠杆菌。研究证明，有％个0抗原血清型与仔猪水肿病发生有关，其中主要有 0 2,0 8,0 138,0 139,0 141等0抗原血清型，这些菌株多具有溶血性，其中，C83684属于 0 139的一个种属。在临床上，该病主要引起仔猪眼睑水肿和神经症状，部分仔猪伴有腹泻症状，剖检可见眼睑、胃壁、肠系膜水肿，组织病变为器官浆液性炎症及广泛性小动脉炎症。 仔猪水肿病主要发生在断乳后1-2周的仔猪，尤其在发育良好的仔猪群，造成很大的经济损失，是断奶仔猪危害较严重的疾病。此病分布于全世界，中国也常见报道，是多年来困扰中国养猪业的问题之一。虽然此病可采用抗生素及磺胺类药物进行治疗，但会造成药物残留，据现地调查90%以上的大型养猪场均采用接种疫苗的方式来防治该病。目前，中国国内一些生物制品生产厂家生产的仔猪水肿病疫苗均为灭活疫苗。其主要的工艺方法如下1、制备一级斜面菌种将大肠杆菌菌种稀释接种营养肉汤平板，37 °C培养 22-24h ；选典型菌落接种营养肉汤斜面培养基，37°C培养Mh，得到一级斜面菌种；2、制备二级菌种取一级斜面菌种接种于营养肉汤基中37°C振荡培养18_20h，得到二级菌种，备用；3、菌液培养将二级菌种接种到营养肉汤培养基中用生物发酵罐培养；37°C通气培养18-20h，纯检确认无菌后，灭活，即得。按照现有的方法进行生产所制备得到的仔猪水肿病灭活疫苗的培养菌数一般都在100-200亿/ml。此外，现有的仔猪水肿病灭活疫苗的制备方法还存在培养基营养成分少，生产成本高，产量低等缺陷，有待改进。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有的仔猪水肿病灭活疫苗的制备方法中所普遍存在的培养菌数低、生产成本高等缺陷，提供一种新的仔猪水肿病灭活疫苗的制备方法，该制备方法具有培养基营养丰富，生产成本低，产量高等优点。本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的一种仔猪水肿病灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤(1)、制备一级斜面菌种将大肠杆菌菌种稀释接种合成平板培养基，培养；选取所培养的典型菌落接种合成斜面培养基，培养，得到一级斜面菌种；(2)、制备二级菌种取一级斜面菌种接种于合成培养基中振荡培养，得到二级菌种，备用；
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(3)、菌液培养将二级菌种接种到合成培养基中进行发酵培养；将发酵培养液灭活，即得。其中，步骤(1)中所述的大肠杆菌菌种为大肠杆菌C83684菌种；所述的合成平板培养基或合成斜面培养基的成分包括蒸馏水100ml、牛肉粉0. 5g、酵母提取物0. 5g、胰蛋白胨lg、氯化钠lg、琼脂粉1. 5g、葡萄糖0. 5g、DMEM0. Ig ；所述的培养优选在以下条件下进行培养温度为37°C，培养时间为22-24h。优选的，步骤(1)中选10-20个所培养的典型菌落接种合成斜面培养基；步骤⑵或步骤(3)中所述合成培养基的成分包括蒸馏水3000ml、牛肉粉15g、 酵母提取物15g、胰蛋白胨30g、氯化钠30g、葡萄糖15g、DMEM 3g ；其pH值为7. 2-7. 4。步骤O)中所述的振荡培养优选在以下条件下进行振荡转速为100-200r/min， 培养温度为37°C，培养时间为16h。步骤(3)中所述的发酵培养条件优选为培养温度为37°C;转速为100-200r/min ； 培养时间为12h ；本发明人经过进一步的试验发现，在发酵培养过程中，采用逐渐加大通气量的方法，能够显著提高培养菌数。本发明针对现有的仔猪水肿病灭活疫苗的制备方法所存在的培养基营养成分少， 生产成本高，产量低等缺陷，改进培养基配方并优化了生产工艺，最终在培养基配方和培养方法上获得突破，培养菌数相比于现有的方法有大幅度提高，平均达到了 279. 875亿/ml， 本发明方法培养时间缩短了 8-10h，有效降低了生产成本。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。1、大肠杆菌C83684菌种购自中国兽医药品监察所。2、各培养基的具体组成成分及配制(1)营养肉汤培养基牛肉汤1000ml、蛋白胨10g、氯化钠5g ；
(2)合成平板培养基蒸馏水100ml、牛肉粉0. 5g、酵母提取物0. 5g、胰蛋白胨lg、 氯化钠lg、琼脂粉1. 5g、葡萄糖0. 5g、DMEMO. Ig ；(3)合成斜面培养基成分与合成平板培养基相同；(4)合成培养基蒸馏水3000ml、牛肉粉15g、酵母提取物15g、胰蛋白胨30g、氯化钠 30g、葡萄糖 15g、DMEM3g ；调 pH7. 2-7. 4、115°C灭菌 40 分钟。实施例11、一级斜面菌种制备大肠杆菌C83684菌种稀释接种合成平板培养基37°C培养 22h，选典型菌落10个接种合成斜面培养基，37°C培养Mh，得到一级斜面菌种，放置4°C冰箱待用；2、二级菌种制备取一级斜面菌种接种于合成培养基中全温振荡器37°C培养 16h，纯检确认无菌后，得到二级菌种，备用；3、菌液培养将二级菌种接种到合成培养基中用生物发酵罐进行培养；培养温度
437°C，转速lOOr/min，进气量18m3/h，罐内压0. 05Mpa，培养时间12h ；取样平板活菌计数、纯检确认无菌后，灭活，即得。采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，营养琼脂平板计数，计算培养菌数，培养菌数的检测结果见表1。实施例21、一级斜面菌种制备大肠杆菌C83684菌种稀释接种合成平板培养基37°C培养 Mh，选典型菌落20个接种合成斜面培养基，37°C培养Mh，得到一级斜面菌种，放置4°C冰箱待用；2、二级菌种制备取一级斜面菌种接种于合成培养基中全温振荡器37°C培养 16h，纯检确认无菌后，得到二级菌种，备用；3、菌液培养将二级菌种接种到合成培养基中用生物发酵罐进行培养；培养温度 37°C，转速200r/min，进气量18m3/h，罐内压0. 05Mpa，培养时间12h ；取样平板活菌计数、纯检确认无菌后，灭活，即得。采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，营养琼脂平板计数，计算培养菌数，培养菌数的检测结果见表1。实施例31、一级斜面菌种制备大肠杆菌C83684菌种稀释接种合成平板培养基37°C培养 23h，选典型菌落15个接种合成斜面培养基，37°C培养Mh，得到一级斜面菌种，放置4°C冰箱待用；2、二级菌种制备取一级斜面菌种接种于合成培养基中全温振荡器37°C培养 16h，纯检确认无菌后，得到二级菌种，备用；3、菌液培养将二级菌种接种到合成培养基中用生物发酵罐进行培养；培养温度 37°C，转速150r/min，罐内压0. 05Mpa，培养时间12h ；在发酵培养过程中，采用逐渐加大通气量的方法，其中0- 静置培养，2-4h进气量12m3/h，4-Mi进气量14m3/h，6_1池进气量 18m3/h。取样平板活菌计数，纯检确认无菌后，灭活，即得。采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，营养琼脂平板计数，计算培养菌数，培养菌数的检测结果见表1。实施例41、一级斜面菌种制备大肠杆菌C83684菌种稀释接种合成平板培养基37°C培养 22h，选典型菌落20个接种合成斜面培养基，37°C培养Mh，得到一级斜面菌种，放置4°C冰箱待用；2、二级菌种制备取一级斜面菌种接种于合成培养基中全温振荡器37°C培养 16h，纯检确认无菌后，得到二级菌种，备用；3、菌液培养将二级菌种接种到合成培养基中用生物发酵罐进行培养；培养温度 37°C，转速120r/min，罐内压0. 05Mpa，培养时间12h ；在发酵培养过程中，采用逐渐加大通气量的方法，其中0- 静置培养，2-4h进气量12m3/h，4-Mi进气量14m3/h，6_1池进气量 18m3/h。取样平板活菌计数，纯检确认无菌后，灭活，即得。采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，营养琼脂平板计数，计算培养菌数，培养菌数的检测结果见表1。
实施例51、一级斜面菌种制备大肠杆菌C83684菌种稀释接种合成平板培养基37°C培养 Mh，选典型菌落10个接种合成斜面培养基，37°C培养Mh，得到一级斜面菌种，放置4°C冰箱待用；2、二级菌种制备取一级斜面菌种接种于合成培养基中全温振荡器37°C培养 16h，纯检确认无菌后，得到二级菌种，备用；3、菌液培养将二级菌种接种到合成培养基中用生物发酵罐进行培养；培养温度 37°C，转速180r/min，罐内压0. 05Mpa，培养时间1 ；在发酵培养过程中，采用逐渐加大通气量的方法，其中0- 静置培养，2-4h进气量12m3/h，4-Mi进气量14m3/h，6_1池进气量 18m3/h。取样平板活菌计数，纯检确认无菌后，灭活，即得。采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，营养琼脂平板计数，计算培养菌数，培养菌数的检测结果见表1。实施例61、一级斜面菌种制备大肠杆菌C83684菌种稀释接种合成平板培养基37°C培养 23h，选典型菌落16个接种合成斜面培养基，37°C培养Mh，得到一级斜面菌种，放置4°C冰箱待用；2、二级菌种制备取一级斜面菌种接种于合成培养基中全温振荡器37°C培养 16h，纯检确认无菌后，得到二级菌种，备用；3、菌液培养将二级菌种接种到合成培养基中用生物发酵罐进行培养；培养温度 37°C，转速140r/min，进气量18m3/h，罐内压0. 05Mpa，培养时间12h ；取样平板活菌计数，纯检确认无菌后，灭活，即得。采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，营养琼脂平板计数，计算培养菌数，培养菌数的检测结果见表1。实施例71、一级斜面菌种制备大肠杆菌C83684菌种稀释接种合成平板培养基37°C培养 Mh，选典型菌落17个接种合成斜面培养基，37°C培养Mh，得到一级斜面菌种，放置4°C冰箱待用；2、二级菌种制备取一级斜面菌种接种于合成培养基中全温振荡器37°C培养 16h，纯检确认无菌后，得到二级菌种，备用；3、菌液培养将二级菌种接种到合成培养基中用生物发酵罐进行培养；培养温度 37°C，转速190r/min，进气量18m3/h，罐内压0. 05Mpa，培养时间12h ；取样平板活菌计数，纯检确认无菌后，灭活，即得。采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，营养琼脂平板计数，计算培养菌数，培养菌数的检测结果见表1。实施例81、一级斜面菌种制备大肠杆菌C83684菌种稀释接种合成平板培养基37°C培养 Mh，选典型菌落18个接种合成斜面培养基，37°C培养Mh，得到一级斜面菌种，放置4°C冰箱待用；2、二级菌种制备取一级斜面菌种接种于合成培养基中全温振荡器37°C培养16h，纯检确认无菌后，得到二级菌种，备用；3、菌液培养将二级菌种接种到合成培养基中用生物发酵罐进行培养；培养温度 37°C，转速200r/min，罐内压0. 05Mpa，培养时间1 ；在发酵培养过程中，采用逐渐加大通气量的方法，其中0- 静置培养，2-4h进气量12m3/h，4-Mi进气量14m3/h，6_1池进气量 18m3/h。取样平板活菌计数，纯检确认无菌后，灭活，即得。培养菌数的检测结果见表1。采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，营养琼脂平板计数，计算培养菌数，培养菌数的检测结果见表1。对照实施例11、一级斜面菌种制备大肠杆菌C83684菌种稀释接种营养琼脂平板37°C培养 22h，选典型菌落10个接种营养琼脂斜面培养基，37°C培养Mh，得到一级斜面菌种，放置 4°C冰箱待用；2、二级菌种制备取一级斜面菌种接种于营养肉汤培养基中全温振荡器37°C培养18h，纯检确认无菌后，得到二级菌种，备用；3、菌液培养将二级菌种接种到营养肉汤培养基中用生物发酵罐进行培养；培养温度37°C，转速lOOr/min，进气量18m3/h，罐内压0. 05Mpa，培养时间18h ；取样平板活菌计数纯检确认无菌后，灭活，即得。采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，营养琼脂平板计数，计算培养菌数，培养菌数的检测结果见表1。对照实施例21、一级斜面菌种制备大肠杆菌C83684菌种稀释接种营养琼脂平板37°C培养 24h,选典型菌落20个接种营养琼脂斜面培养基，370C培养Mh，得到一级斜面菌种，放置 4°C冰箱待用；2、二级菌种制备取一级斜面菌种接种于营养肉汤培养基中全温振荡器37°C培养18h，纯检确认无菌后，得到二级菌种，备用；3、菌液培养将二级菌种接种到营养肉汤培养基中用生物发酵罐进行培养；培养温度37°C，转速200r/min，进气量18m3/h，罐内压0. 05Mpa，培养时间18h ；取样平板活菌计数纯检确认无菌后，灭活，即得。采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，营养琼脂平板计数，计算培养菌数，培养菌数的检测结果见表1。对照实施例31、一级斜面菌种制备大肠杆菌C83684菌种稀释接种营养琼脂平板37°C培养 23h，选典型菌落15个接种营养琼脂斜面培养基，37°C培养Mh，得到一级斜面菌种，放置 4°C冰箱待用；2、二级菌种制备取一级斜面菌种接种于营养肉汤培养基中全温振荡器37°C培养18h，纯检确认无菌后，得到二级菌种，备用；3、菌液培养将二级菌种接种到营养肉汤培养基中用生物发酵罐进行培养；培养温度37°C，转速150r/min，进气量18m3/h，罐内压0. 05Mpa，培养时间18h ；取样平板活菌计数纯检确认无菌后，灭活，即得。采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，营养琼脂平板计数，计算培养菌数，培养菌数的检测结果见表1。对照实施例41、一级斜面菌种制备大肠杆菌C83684菌种稀释接种营养琼脂平板37°C培养 22h，选典型菌落20个接种营养琼脂斜面培养基，370C培养Mh，得到一级斜面菌种，放置 4°C冰箱待用；2、二级菌种制备取一级斜面菌种接种于营养肉汤培养基中全温振荡器37°C培养18h，纯检确认无菌后，得到二级菌种，备用；3、菌液培养将二级菌种接种到营养肉汤培养基中用生物发酵罐进行培养；培养温度37°C，转速120r/min，进气量18m3/h，罐内压0. 05Mpa，培养时间18h ；取样平板活菌计数，纯检确认无菌后，灭活，即得。采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，营养琼脂平板计数，计算培养菌数，培养菌数的检测结果见表1。对照实施例51、一级斜面菌种制备大肠杆菌C83684菌种稀释接种营养琼脂平板37°C培养 Mh，选典型菌落10个接种营养琼脂斜面培养基，37°C培养Mh，得到一级斜面菌种，放置 4°C冰箱待用；2、二级菌种制备取一级斜面菌种接种于营养肉汤培养基中全温振荡器37°C培养18h，纯检确认无菌后，得到二级菌种，备用；3、菌液培养将二级菌种接种到营养肉汤培养基中用生物发酵罐进行培养；培养温度37°C，转速180r/min，进气量18m3/h，罐内压0. 05Mpa，培养时间1 ；取样平板活菌计数，纯检确认无菌后，灭活，即得。采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，营养琼脂平板计数，计算培养菌数，培养菌数的检测结果见表1。对照实施例61、一级斜面菌种制备大肠杆菌C83684菌种稀释接种营养琼脂平板37°C培养 23h，选典型菌落16个接种营养琼脂斜面培养基，370C培养Mh，得到一级斜面菌种，放置 4°C冰箱待用；2、二级菌种制备取一级斜面菌种接种于营养肉汤培养基中全温振荡器37°C培养18h，纯检确认无菌后，得到二级菌种，备用；3、菌液培养将二级菌种接种到营养肉汤培养基中用生物发酵罐进行培养；培养温度37°C，转速140r/min，进气量18m3/h，罐内压0. 05Mpa，培养时间18h ；取样平板活菌计数，纯检确认无菌后，灭活，即得。采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，营养琼脂平板计数，计算培养菌数，培养菌数的检测结果见表1。对照实施例71、一级斜面菌种制备大肠杆菌C83684菌种稀释接种营养琼脂平板37°C培养 Mh，选典型菌落17个接种营养琼脂斜面培养基，37°C培养Mh，得到一级斜面菌种，放置 4°C冰箱待用；2、二级菌种制备取一级斜面菌种接种于营养肉汤培养基中全温振荡器37°C培养18h，纯检确认无菌后，得到二级菌种，备用；3、菌液培养将二级菌种接种到营养肉汤培养基中用生物发酵罐进行培养；培养温度37°C，转速190r/min，进气量18m3/h，罐内压0. 05Mpa，培养时间18h ；取样平板活菌计数，纯检确认无菌后，灭活，即得。采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，营养琼脂平板计数，计算培养菌数，培养菌数的检测结果见表1。对照实施例8 1、一级斜面菌种制备大肠杆菌C83684菌种稀释接种营养琼脂平板37°C培养 Mh，选典型菌落18个接种营养琼脂斜面培养基，37°C培养Mh，得到一级斜面菌种，放置 4°C冰箱待用；2、二级菌种制备取一级斜面菌种接种于营养肉汤培养基中全温振荡器37°C培养18h，纯检确认无菌后，得到二级菌种，备用；3、菌液培养将二级菌种接种到营养肉汤培养基中用生物发酵罐进行培养；培养温度37°C，转速200r/min，罐内压0. 05Mpa，培养时间18h ；在发酵培养过程中，采用逐渐加大通气量的方法，其中0- 静置培养，2-4h进气量12m3/h，4-6h进气量14m3/h，6-18h进气量18m3/h。取样平板活菌计数，纯检确认无菌后，灭活，即得。培养菌数的检测结果见表1。采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，营养琼脂平板计数，计算培养菌数，培养菌数的检测结果见表1。表1现在生物制品厂普遍采用的工艺培养方法和本发明方法培养菌数对比
权利要求
1.一种仔猪水肿病灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤(1)、将大肠杆菌菌种稀释接种合成平板培养基，培养；选取所培养的典型菌落接种合成斜面培养基，培养，得到一级斜面菌种；(2)、取一级斜面菌种接种于合成培养基中振荡培养，得到二级菌种，备用；(3)、将二级菌种接种到合成培养基中进行发酵培养；将发酵培养液灭活，即得。
2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的大肠杆菌菌种为大肠杆菌C83684菌种。
3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中选10-20个所培养的典型菌落接种合成斜面培养基。
4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的培养在以下条件下进行培养培养温度为37°C，培养时间为22-24h。
5.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的合成平板培养基或合成斜面培养基的成分包括蒸馏水100ml、牛肉粉0. 5g、酵母提取物0. 5g、胰蛋白胨lg、 氯化钠lg、琼脂粉1. 5g、葡萄糖0. 5g、DMEMO. lg。
6.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(2)或步骤(3)中所述合成培养基的成分包括蒸馏水3000ml、牛肉粉15g、酵母提取物15g、胰蛋白胨30g、氯化钠30g、 葡萄糖 15g、DMEM 3g ；pH 值为 7. 2-7. 4。
7.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的振荡培养为振荡转速为100-200r/min，培养温度为37°C，培养时间为16h。
8.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的发酵培养为培养温度为37°C ；转速为100-200r/min ；培养时间为12h。
9.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(3)中在发酵培养过程中，采用逐渐加大通气量的方法进行发酵培养。
10.由权利要求1-9任何一项制备方法制备得到的仔猪水肿病灭活疫苗。
全文摘要
本发明公开了一种仔猪水肿病灭活疫苗的制备方法及其产品，包括(1)、将大肠杆菌菌种稀释接种合成平板培养基，培养；选取典型菌落接种合成斜面培养基，培养，得到一级斜面菌种；(2)、取一级斜面菌种接种于合成培养基中振荡培养，得到二级菌种；(3)、二级菌种接种到合成培养基中进行发酵培养；灭活发酵培养液，即得。本发明针对仔猪水肿病灭活疫苗制备方法所存在的培养基营养成分少，生产成本高，产量低等缺陷，改进培养基配方并优化了生产工艺，本发明方法培养菌数相比于现有的方法有大幅度提高，平均达到了279.875亿/ml，培养时间缩短了8-10h，有效降低了生产成本。
文档编号C12N1/20GK102266553SQ20111020201
公开日2011年12月7日 申请日期2011年7月19日 优先权日2011年7月19日
发明者丁国杰, 付丽杰, 孙建富, 孙德君, 孟福强, 张杨, 曲海波, 柴华, 王彬, 王琪, 田路路, 谢德炎, 郑铁鑫, 郝建伟 申请人:哈药集团生物疫苗有限公司