专利名称：中间补料发酵生产环磷酸腺苷的方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种中间补料发酵生产环磷酸腺苷的方法。
背景技术：
环憐酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,简称cAMP)为当今分子生物学研究的重要内容之一，具有第二信使的作用。基础医学研究证明，至少40多种疾病(包括癌症、高血压、冠心病、心肌梗塞和心源性休克、牛皮癣等)与cAMP的代谢有关(Hong D，Peng X R. 2003. Role of the cAMP in immunological liver injury in mi ce comparingLPS-induced model with LPS+BCG-indudced model. Chinese Pharmacol Bull. 19 :940 943)。在制药方面，环磷酸腺苷也可以作为药物中间体制备二丁酰环磷酸腺苷和环磷腺苷葡甲胺，提高脂溶性，从而发挥更有效地生理与药理作用。在畜牧业上，采用外源性cAMP可以摸拟生产激素的作用，促进畜禽生长、提高饲料报酬、增加优质畜产品产量(关荣发，王淑彩，许梓荣.2002.外源性环核苷酸在动物生产中的应用.饲料与饲养.9 :40 42)，是提高畜牧业生产的经济效益开辟一条新途径。目前，环磷酸腺苷国内需求以每年20%的速度增长，而全球市场也已15%的速度递增，年用量达上百吨，具有良好的市场前景。cAMP的生产方法有化学合成法、酶法和发酵法三种。国内外产业化生产全部采用化学合成法，该方法以AMP为原料，采用高效分离柱进行中间体分离，由于该方法的溶剂损耗量大，收率低，成本偏高，产量小，以及严重的环境污染，制约着它的大规模生产。酶法只在国外有报道，是利用液化短杆菌提取的腺苷酸环化酶，在丙酮酸存在下，可以高效地催化ATP生成cAMP,收率几乎达到了 100% (Kurashina Y, Takai T,Hori C, Okamoto H. 1974.Adenylate cyclase from Brevibacterium liquefaciens.Reversibility and thermodynamic studies. J Biol Chem. 249 :4824 4827)。但是的生产规模有限(仅仅达到克规模)，离真正的产业化还有较大的距离。因此，还有必要开发出可以应用于工业化生产的发酵生产环磷酸腺苷的方法。
发明内容
因此，本发明的目的是，基于本发明人早期筛选出的高产环磷酸腺苷的菌株，提供一种发酵生产环磷酸腺苷的方法。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。本发明提供了一种发酵生产环磷酸腺苷的方法，所述方法采用间歇匀速补料的方式分批发酵生产环磷酸腺苷，发酵菌株为保藏编号为CGMCC No. 3584的节杆菌。优选地，所述间歇匀速补料的操作如下在发酵的指数期之后，以每隔3 IOh间歇匀速流加补料碳源，共流加4 10次。优选地，所述初始发酵培养基中含有碳源、氮源、无机盐和环磷酸前体物质。
优选地，所述碳源选自糖蜜、葡萄糖、蔗糖和果糖中的一种或几种。优选地，所述碳源的初始浓度为O. 01 100g/L，优选为30 50g/L。优选地，所述氮源选自酵母粉、酵母膏、玉米浆、蛋白胨、尿素和硫酸铵中的一种或几种。优选地，所述氮源的初始浓度为O. 01 100g/L，优选为10 30g/L。优选地，所述无机盐选自钾盐、钠盐、镁盐、碳酸盐和硫酸盐中的一种或几种；优选地，所述无机盐的初始浓度为O. 01 100g/L，优选为I 10g/L。优选地，所述环磷酸前体物质选自腺苷、腺苷单磷酸、腺苷三磷酸、腺嘌呤、次黄嘌呤、肌苷和肌苷酸中的一种或几种。
优选地，所述磷酸前体物质的初始浓度为0. 01 100g/L，优选为I 10g/L。
优选地，所述分批发酵生产环磷酸腺苷的条件如下接种量I 15% (v/v)，pH为
5.O 8. 0，发酵温度25 40°C，搅拌转速200 400r/min，培养时间50 80h，并且在发酵的指数期之后，例如20 40h开始，以每隔3 IOh间歇匀速流加补料浓度为400 800g/L的碳源,共流加4 10次,每次10 50mL。在一个优选的实施方案中，本发明提供的发酵生产环磷酸腺苷的方法包括以下步骤1)斜面培养将冷藏的发酵菌株接种到斜面上，30°c培养箱培养48h活化；2)种子培养从活化的斜面挑取一环菌体接入种子培养基，30°C，200r/min，培养18h ；3)分批发酵培养接种量I 15% (v/v)，pH为5. O 8. 0，发酵温度25 40°C，搅拌转速200 400r/min,培养时间50 80h，并且在发酵的指数期之后，例如20 40h开始，以每隔3 IOh间歇匀速流加补料浓度为400 800g/L的碳源，共流加4 10次，每次10 50mL。综上所述，本发明建立在筛选出的环磷酸腺苷高产菌株(分类命名为节杆菌(Arthrobacter sp. )A302,目前该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 3584，保藏日期为2010年I月18日)，对发酵培养基进行了优化，可进行300L发酵罐中试生产的基础上，通过进行补料分批发酵调控，即根据菌株生长和起始培养基的特点，在分批生产的某阶段适当补加培养基的一种或几种成分，使菌株保证一定的生长密度，消除底物抑制，同时延长次级代谢产物的生产时间，从而提高cAMP的产量。可见，本发明提供的中间补料发酵生产环磷酸腺苷的方法，有效克服了分批发酵时的底物抑制效应，使cAMP发酵的最终浓度提高。本发明的关键在于，使用SBA生物传感分析仪在线监测发酵液中的底物浓度，通过此参数反馈流加培养液，在整个培养过程中，使底物浓度较低，消除底物抑制，同时延长次级代谢产物的生产时间，而且发酵结束基本被耗尽，过程的控制和分析也比较简单，可以极大方便工业化中的自动化生产控制。因此，采用中间补料发酵生产环磷酸腺苷的优势在于，生产设备简单，选择性高、反应条件温和、副产物少，可以减轻环境压力，符合低碳经济，而且成本低、适合于工业化。具体而言，本发明具有如下优势I)与传统的化学法合成相比，生产设备简单，反应条件温和，环境污染小，副产物少。2)该方法生物合成环磷酸腺苷，发酵培养基成分简单，价格低廉，生产成本低，适合于工业化。
3)在整个培养过程中，碳源浓度较低，可以消除底物抑制，同时延长次级代谢产物的生产时间，而且发酵结束基本被耗尽。4)本发明所用的微生物菌株，具有高产性状稳定，不易丢失的特点，传代10代以
上转接，产量保持稳定。5)发酵培养时间短，生产强度高，可达约11. 21g/L，与不补料相比，产量提高39. 1%。生物材料的保藏节杆菌(Arthrobacter sp. )A302已经于2010年I月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路 I号院，中科院微生物研究所(邮编=100101)，保藏编号为CGMCC No. 3584。关于节杆菌Arthrobacter A302的详细信息,可参见本申请人于2010年6月4日提交的中国发明专利申请 201010191515. 6。
具体实施例方式以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。以下各实施例所采用的分析方法如下发酵液中的产物cAMP采用Agilent 1100高效液相色谱仪测定(HPLC)。色谱柱江苏淮阴汉邦科技有限公司Lichrospher C18 (4. 6x250mm, 5 μ m),柱温30°C,检测器为紫外检测器(254nm)，流动相为V (甲醇)V (pH6. 6的磷酸三乙胺溶液)=30 : 70 ;流速O. 8mL/min ;进样量20μ L。精确称取环磷腺苷的标准品，用重蒸三重水配制成质量浓度约50mg/L的标准品溶液；将经预处理的样品用去离子水稀释至适当浓度，并用O. 45 μ m微孔膜进行过滤后，作为样品溶液待检测，发酵样品根据峰面积计算cAMP产量。以下各实施例中所采用的斜面培养基(g/L)组成如下葡萄糖10、蛋白胨10、酵母膏5、牛肉膏10、氯化钠3及琼脂20。以下各实施例中所采用的液体种子培养基(g/L)组成如下葡萄糖10、蛋白胨10、酵母膏5、牛肉膏10、氯化钠3、生物素O. 001及酸水解酪蛋白5。实施例I发酵培养基(g/L):葡萄糖50，磷酸氢二钾10，磷酸二氢钾10，硫酸镁1，蛋白胨4，生物素O. 003，次黄嘌呤6，pH 6. 0，121 °C高压蒸汽灭菌15min。将斜面试管上的节杆菌(Arthrobacter)A302接2环于种子培养基，30°C,摇床200r/min,培养18h，获得指数期的种子液。将种子液按发酵体积的8% (v/v)的接种量接入含3L发酵液的发酵罐中，发酵温度 28°C，通气量 I. 5vvm,搅拌转速 350r/min，在 20h、28h、36h、44h、52h，分别匀速流加 600g/L的葡萄糖溶液，每隔8h流加一次，流加5次，每次40mL，流加量在200ml左右。培养到72h后，HPLC检测，产物cAMP含量为11. 21g/L，生产强度为O. 156g/(L *h)。实施例2发酵培养基(g/L):葡萄糖45，磷酸氢二钾10，磷酸二氢钾5，硫酸镁O. 5，蛋白胨4，生物素O. 005，腺嘌呤6，pH 7. 0，121 °C高压蒸汽灭菌15min。其他条件与实施例I的方法相同，将斜面试管上的节杆菌(Arthrobacter) A302接2环于种子培养基，30°C，摇床200r/min，培养18h，获得指数期的种子液。将种子液按发酵体积的10% (v/v)的接种量接入3. 5L发酵液的发酵罐中，发酵温度32°C，通气量I. 2vvm,搅拌转速300r/min，在20 50h之间每3h流加浓度为400g/L的葡萄糖溶液，共流加10次，每次20ml，流加量在200ml左右。培养到72h后，HPLC检测，产物cAMP含量为10. 88g/L，生产强度为O. 151g/(L *h)。实施例3发酵培养基(g/L):糖蜜50，磷酸氢二钠10，磷酸二氢钠10，硫酸镁I，尿素4，生物素O. 005，腺苷6，pH 6. 0，121°C高压蒸汽灭菌15min。
其他条件与实施例I的方法相同，将斜面试管上的节杆菌(Arthrobacter) A302接2环于种子培养基，30°C，摇床200r/min，培养18h，获得指数期的种子液。将种子液按发酵体积的4% (v/v)的接种量接入4L发酵液的发酵罐中，发酵温度34°C，通气量I. 5vvm，搅拌转速350r/min，在20h、26h、32h、38h、44h，50h分别匀速流加300g/L的糖蜜，每隔6h流加一次，流加6次，每次30mL。流加量在180ml左右。培养到66h后，HPLC检测，产物cAMP含量为8. 83g/L，生产强度为O. 134g/(L *h)。实施例4发酵培养基(g/L):蔗糖45，磷酸氢二钾10，磷酸二氢钾10，硫酸镁O. 5，玉米浆4，生物素O. 003，肌苷酸6，pH 8. 0，121 °C高压蒸汽灭菌15min。其他条件与实施例I的方法相同，将斜面试管上的节杆菌(Arthrobacter) A302接2环于种子培养基，30°C，摇床200r/min，培养18h，获得指数期的种子液。将种子液按发酵体积的8% (v/v)的接种量接入3. 5L发酵液的发酵罐中，发酵温度28°C，通气量I. 2vvm，搅拌转速350r/min，在20h、30h、40h、50h，分别匀速流加600g/L的蔗糖溶液，每隔IOh流加一次，流加4次，每次50mL。流加量在200ml左右。培养到72h后，HPLC检测，产物cAMP含量为9. 66g/L，生产强度为O. 134g/(L *h)。实施例5发酵培养基(g/L):糖蜜50，磷酸氢二钾5，磷酸二氢钾10，硫酸镁1，尿素4，生物素O. 005,腺嘌呤6, pH 6. 0,121°C高压蒸汽灭菌15min。其他条件与实施例I的方法相同，将斜面试管上的节杆菌(Arthrobacter) A302接2环于种子培养基，36°C，摇床200r/min，培养18h，获得指数期的种子液。将种子液按发酵体积的8% (v/v)的接种量接入3L发酵液的发酵罐中，发酵温度30°C，通气量I. 5vvm，搅拌转速350r/min，在20 50h之间每3h流加浓度为400g/L的糖蜜，共流加10次，每次20ml，流加量在200ml左右。培养到72h后，HPLC检测，产物cAMP含量为10. 54g/L，生产强度为O. 146g/(L -h)实施例6发酵培养基(g/L):葡萄糖50，磷酸氢二钾10，磷酸二氢钾5，硫酸镁O. 5，尿素4，生物素O. 003，次黄嘌呤8，pH 7. 0，121 °C高压蒸汽灭菌15min。其他条件与实施例I的方法相同,将斜面试管上的节杆菌Arthrobacter A302接
2环于种子培养基，30°C，摇床200r/min，培养18h，获得指数期的种子液。将种子液按发酵体积的10% (v/v)的接种量接入4L发酵液的发酵罐中，发酵温度30°C，通气量1.2VVH1，搅拌转速300r/min，在20h、28h、36h、44h、52h，分别匀速流加600g/L的葡萄糖，每隔8h流加一次，流加5次，每次30mL。流加量在150ml左右。培养到66h后，HPLC检测，产物cAMP含量为12. lg/L，生产强度为O. 183g/(L *h)。对比例I未采取间歇匀速补料的方法进行分批培养，其他条件均与实施例I的方法相同。最终检测产物cAMP含量为8. 06g/L,生产强度为O. 112g/(L · h)。对比例2
在20h、35h、50h，分别匀速流加600g/L的葡萄糖溶液，每隔15h流加一次，流加3次，每次60mL，流加量在180ml左右，其他条件均与实施例I的方法相同。最终检测产物cAMP含量为9. 52g/L，生产强度为O. 132g/ (L · h)。
权利要求
1.一种发酵生产环磷酸腺苷的方法，所述方法采用间歇匀速补料的方式分批发酵生产环磷酸腺苷，发酵菌株为保藏编号为CGMCC No. 3584的节杆菌。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述间歇匀速补料的操作如下在发酵的指数期之后，每隔3 IOh间歇匀速流加补料碳源，共流加4 10次。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述初始发酵培养基中含有碳源、氮源、无机盐和环磷酸前体物质。
4.根据权利要求I至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述碳源选自糖蜜、葡萄糖、蔗糖、果糖中的一种或几种；优选地，所述碳源的初始浓度为O. 01 100g/L，优选为30 50g/L。
5.根据权利要求I至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述氮源选自酵母粉、酵母膏、玉米浆、蛋白胨、尿素、硫酸铵中的一种或几种；优选地，所述氮源的初始浓度为0.01 100g/L，优选为 10 30g/L。
6.根据权利要求I至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述无机盐选自钾盐、钠盐、镁盐、碳酸盐、硫酸盐中的一种或几种；优选地，所述无机盐的初始浓度为O. 01 100g/L，优选为I 10g/L。
7.根据权利要求I至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述环磷酸前体物质选自腺苷、腺苷单磷酸、腺苷三磷酸、腺嘌呤、次黄嘌呤、肌苷、肌苷酸中的一种或几种，优选地，所述磷酸前体物质的初始浓度为0. 01 100g/L，优选为110g/L。
8.根据权利要求I至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述分批发酵生产环磷酸腺苷的条件如下接种量I 15% (v/v), pH为5. O 8.0，发酵温度25 40°C，通气量I. 2 I. 5vvm，搅拌转速200 400r/min，培养时间50 80h，并且在发酵的指数期之后，例如20 40h开始，每隔3 IOh间歇匀速流加补料浓度为400 800g/L的碳源，共流加4 10次，每次10 50mL。
9.根据权利要求I至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤 1)斜面培养将冷藏的发酵菌株接种到斜面上，30°C培养箱培养48h活化； 2)种子培养从活化的斜面挑取一环菌体接入种子培养基，30°C，200r/min，培养18h； 3)分批发酵培养接种量I 15%(v/v), pH为5. O 8.0，发酵温度25 40°C，通气量I. 2 I. 5vvm,搅拌转速200 400r/min，培养时间50 80h，并且在发酵的指数期之后，例如20 40h开始，每隔3 IOh间歇匀速流加补料浓度为400 800g/L的碳源，共流加4 10次，每次10 50mL。
全文摘要
本发明提供一种中间补料发酵生产环磷酸腺苷的方法。本发明提供的发酵生产环磷酸腺苷的方法采用间歇匀速补料的方式分批发酵生产环磷酸腺苷，发酵菌株为保藏编号为CGMCC No.3584的节杆菌，在发酵的指数期之后，以每隔3～10h间歇匀速流加补料碳源，共流加4～10次。本发明提供的方法优点在于，在整个培养过程中，碳源浓度较低，而且发酵结束基本被耗尽，在减少反馈抑制的同时，使环磷酸腺苷产量有较大幅的提高。
文档编号C12P19/40GK102899373SQ201110210858
公开日2013年1月30日 申请日期2011年7月26日 优先权日2011年7月26日
发明者应汉杰, 李磊, 陈晓春, 柏建新, 陈勇, 吴菁岚, 谢婧婧 申请人:南京工业大学