专利名称：一种利用大气压冷等离子体提高细胞膜通透性的方法
技术领域：
本发明属于冷等离子体技术在生物学领域的应用，特别涉及利用大气压冷等离子体提高细胞膜通透性的应用。
背景技术：
等离子体是物质的第四态，放电过程可以产生大量高能电子、离子、分子、中性原子、激发态原子、光子和自由基，具有高度的物理和化学活性。大气压冷等离子体可以在大气压下通过气体放电获得，整个体系温度接近室温，具有作用效果显著、低能耗、无毒性等优点，因而在生物领域具有广泛的应用前景。细胞膜是包围细胞质的一层半透性薄膜，其主要性状之一是选择通透性。细胞膜通透性的提高有利于细胞与周围环境之间的物质交换、能量转换和信号转导。通常提高细胞膜通透性的方法包括物理方法(如电处理、超声波、渗透压等)和化学方法(如添加吐温、C16-18饱和脂肪酸、青霉素等)。但是，这些方法往往存在作用效果不明显、成本高、后处理不便等问题。本发明采用大气压冷等离子体这种条件温和且能量密度较高的方法对微生物细胞膜进行处理，可以高效、方便的提高细胞膜的通透性。
发明内容
本发明通过采用大气压冷等离子体中的介质阻挡放电等离子体作用于微生物细胞悬浮液，利用了大气压冷等离子体具有的条件温和且能量密度高的特点，达到了提高细胞膜通透性的目的，其具体操作步骤如下将微生物细胞悬浮液载于石英载片上，将载片置于大气压冷等离子体发生器的放电区，放电区金属电极的间距为1 12mm，外加电压0. 5 100kV，频率0 50MHz，作用时间为IOs 25min，作用温度为15 45°C ；其中，放电区的工作气体为下述一种或几种的混
合物空气、氮气、氩气、氦气。当上述操作条件为下述值时，处理的效果较佳当电极间距为3 4mm，外加电压为12kV，频率设定为20MHz，作用时间为30s 240s,作用温度为25°C，工作气体为空气时，提高细胞膜通透性的效果较佳。当上述电极为下述的一种铜、铝、不锈钢，尤其是不锈钢的时候，效果较佳。当上述电极是平板型或同轴型，尤其是平板型的时候，效果较佳。当上述微生物为原核微生物或真核微生物时，细胞悬浮液中的细胞个数为 1 X IO5 1 X IO9个/mL，效果均较佳。当上述原核微生物为克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，细胞悬浮液中的细胞个数为1 X IO7个/mL时，效果较佳。当上述真核微生物为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，细胞悬浮液中的细胞个数为5 X IO5个/mL，效果较佳。当上述细胞悬浮液按下述方法制备时，效果较佳在无菌条件下，将培养至对数期的菌液收集、8000 10000r/min，0 4°C，离心20 30min后所得沉淀用0. 05mol/L的磷酸钾缓冲液洗涤两次后，再用磷酸钾缓冲液稀释制得，其中，所述磷酸钾缓冲液的浓度为 0. 05mol/L, pH 为 7. 0。本发明中涉及到的微生物细胞培养及微生物细胞悬浮液的制备方法，均属于本领域普通技术人员根据现有技术和常规实验能够完成的，因此在实现获得培养至对数期微生物并稀释至上述浓度范围的前提下，可通过调节培养基的种类、微生物接种的量、培养温度、或改变其他培养条件来实现。有益效果本发明具有操作简单、无毒性、高效性的特点。不会引发微生物细胞完全失活，并可以达到提高微生物细胞膜通透性的效果。
具体实施例方式下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，或可以常规方法制备。以下结合大气压介质阻挡放电等离子体处理原核微生物克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) ^lRMMWL^^iMW1^ (Saccharomyces cerevisiae)。Luria-Bertani (LB)胰蛋白胨=IOg ；酵母粉:5g ；氯化钠=IOg ；加水调至IL并调pH至7. 0后，121°C灭菌后冷却备用。LB固体培养基在液体培养基基础上添加15g/L琼脂粉。酵母浸出粉胨葡萄糖(Yeast Peptone Dextrose, YPD)培养基酵母膏IOg ；蛋白胨20g ；葡萄糖20g ；溶于IOOOml水中，115°C灭菌后冷却备用。YPD固体培养基在液体培养基基础上添加20g/L琼脂粉。实施例1大气压冷等离子体提高克雷伯氏菌细胞膜的通透性一.所用菌种克雷伯氏菌，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，菌种保藏号是1.6366。二.实验步骤1.细胞培养将克雷伯氏菌接种于Luria-Bertani培养基，接种量为体积百分含量1%，摇床转速为170r/min，温度为37°C，培养时间为10h。2.细胞悬浮液的制备将培养至OD值为2. 0菌液收集，在无菌条件下8000r/min， 4°C，离心30min，沉淀用0. 05mol/L、pH 7. 0的磷酸钾缓冲液洗涤两次后，再离心，将沉淀制成菌悬液，菌悬液中菌体细胞个数IX IO7个/mL，4°C保存备用。将微生物细胞悬浮液载于石英载片，然后置于等离子体放电区下电极正中进行处理。3.根据需要设定大气压介质阻挡放电等离子体发生器的工作气体为空气，工作参数为电极间距为4mm，外加电压12kV，频率20MHz，电极为不锈钢平板电极，作用温度25°C。4.使用大气压介质阻挡放电等离子体对克雷伯氏菌细胞悬浮液进行处理，处理时间分别为 Os，30s，60s，90s，120s。5.将等离子体处理的菌液用0. 05mol/L、pH7. 0的磷酸钾缓冲液稀释IO5 IO7倍， 涂布于LB固体培养基中，37°C培养时间12h，数菌落数，计算存活率。
6.对大气压介质阻挡放电等离子体发生器处理的克雷伯氏菌细胞，根据菌体存活率调整不同处理时间的菌液浓度，使OD值均为2.0，然后检测细胞膜的通透性。7.对大气压介质阻挡放电等离子体发生器处理的克雷伯氏菌细胞，根据菌体存活率调整不同处理时间的菌液浓度，使OD值均为2. 0，然后接种于LB液体培养基，以检测其活性及在生长过程中的细胞膜通透性变化。8.检测方法如下(1)菌液浓度测定采用分光光度计法在650nm检测吸光值。待测样品浓度均用 0. 05mol/L、pH 7. 0的磷酸钾缓冲液稀释为吸光值为2. 0。(2)细胞膜通透性测定采用二乙酸荧光素(Fluorescein diacetate, FDA)染色 [1]，通过荧光分光光度计检测荧光强度(最大激发光波长^9nm，发射光波长517nm)。所得样品荧光强度与对照组荧光强度相比，即为相对荧光强度。(3)存活率计算通过平板计数法计数不同处理时间菌体存活个数，根据公式计算菌体存活率菌体存活率=处理菌液存活细胞数/对照组细胞数X 100%对比经过不同时间的大气压介质阻挡放电等离子体处理后的克雷伯氏菌细胞和对照细胞的菌体存活率，如表1所示，随处理时间延长，菌体存活率有轻微的减少，但是 60%以上的大部分菌细胞还是处于存活状态。表1经不同时间大气压冷等离子体处理克雷伯氏菌的存活率
权利要求
1.一种利用大气压冷等离子体提高细胞膜通透性的方法，用大气压冷等离子体作用于微生物细胞悬浮液，其特征在于所述的作用方式为，将微生物细胞悬浮液载于石英载片， 置于等离子体放电区，放电区金属电极间距为1 12mm，外加电压0. 5 100kV，频率0 50MHz，作用时间为IOs 25min，作用温度为15 45°C ；其中，放电区的工作气体为下述一种或几种的混合物空气、氮气、氩气、氦气。
2.根据权利要求1所述的一种方法，其特征在于所述的电极间距为3 4mm，外加电压12kV，频率20MHz，作用时间为30s 240s，作用温度为25°C，工作气体为空气。
3.根据权利要求1或2所述的一种方法，其特征在于所述电极是下述的一种铜、铝、 不锈钢。
4.根据权利要求3所述的一种方法，其特征在于所述电极是不锈钢。
5.根据权利要求1或4所述的一种方法，其特征在于所述电极是平板型或同轴型。
6.根据权利要求5所述的一种方法，其特征在于所述电极是平板型。
7.根据权利要求1或6所述的一种方法，其特征在于所述微生物为原核微生物或真核微生物，细胞悬浮液中的细胞个数为IX IO5 IX IO9个/mL。
8.根据权利要求7所述的一种方法，其特征在于所述的原核微生物为克雷伯氏菌 (Klebsiella pneumoniae)，细胞悬浮液中的细胞个数为lX107f/mL。
9.根据权利要求7所述的一种方法，其特征在于所述的真核微生物为酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)，细胞悬浮液中的细胞个数为5 X IO5个/mL。
10.根据权利要求8或9所述的一种方法，其特征在于细胞悬浮液的制备方法为，在无菌条件下，将培养至对数期的菌液收集、8000 10000r/min，0 4°C，离心20 30min、用 0. 05mol/L，磷酸钾缓冲液洗涤两次后，用磷酸钾缓冲液稀释制得，其中，所述磷酸钾缓冲液的浓度为 0. 05mol/L, pH 为 7. 0。
全文摘要
本发明公开一种利用大气压冷等离子体发生器提高细胞膜通透性的方法，属于冷等离子体技术在生物技术领域的应用。本发明采用间距为1～12mm的金属电极，以空气等气体为放电气体，石英板为放电介质，在电压0.5～100kV，频率0～50MHz，温度为15～45℃的条件下，作用10s～25min，对原核细胞和真核细胞进行处理，可高效、方便的提高细胞膜的通透性。利用这种低能耗，无毒性，效率高的大气压冷等离子体的方法来提高微生物细胞膜的通透性，可应用于微生物发酵、分子生物学感受态细胞的制备以及辅助创伤给药治疗等领域。
文档编号C12N13/00GK102321606SQ20111022226
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月4日 优先权日2011年8月4日
发明者刘婷婷, 董晓宇 申请人:大连大学