专利名称：利用羔羊超排卵母细胞生产体外胚胎的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用羔羊卵巢中卵母细胞在体外生产胚胎的方法，特别是一种利用羔羊超数排卵后卵巢中卵母细胞在体外生产胚胎的方法。
背景技术：
目前牧业生产中，新品种的繁育决定着经济效益高低。而有实际生产中，一些优良品种在推广繁育过程中往往受到来自各方面因素的影响，一是优良品种胚胎供体或来源的不足，二是胚胎生产平台或载体的的瓶颈，都会制约新的优良品种的推广和繁育。因此，一种利用羔羊卵巢中卵母细胞在体外生产胚胎的方法，特别是一种利用羔羊超数排卵后卵巢中卵母细胞在体外生产胚胎的方法就应运而生。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用羔羊卵巢中卵母细胞在体外生产胚胎的方法，特别是一种利用羔羊超数排卵后的卵巢中卵母细胞在体外生产胚胎的方法。本发明的目的是通过以下技术方案实现的
成熟液配制在M199培养基原液中加入8 12Pg/mL FSH(促卵泡素)、8 12Pg/mL LH (促黄体素)、0. 5 1. 5Pg/mL E2 (雌激素)、0. 05 0. 15mmol/L β -巯基乙醇和10 20%ESS (发情母羊血清)，培养液在使用前制作成40 60 μ L/滴的成熟液微滴，在培养箱中平衡1 汕。卵母细胞培养将采集到的COCs (卵丘-卵母细胞复合体)移入成熟液微滴中，每滴成熟液微滴中移入10 20枚卵母细胞为好，在38 39°C、4 6% CO2、饱和湿度环境下培养22 ^h，COCs中的卵母细胞成熟为卵子。上述COCs最好先在成熟液中洗涤1 2次后，再移入成熟液微滴中进行培养。受精液配配制在SOF(输卵管合成液)中加入0.1 0.2 ymol/L青霉胺 (Penicillamine)、。· 1 0. 2 μ mol/L 亚牛磺酸(Hypotaurine)、5 10 μ g/mL 肝素 (!feparin)和2 10% ESS (发情母羊血清)，在受精前1 池，在培养皿或培养板中制做受精液滴，每滴40 60 μ L。所述受精液滴在制作后最好覆盖上石蜡油。精液处理取新鲜或者解冻后的精液，稀释成4Χ IO6 6Χ106 /mL的精子稀释液，在所述的每个受精液滴中移入8 12 μ L精子稀释液，将受精液滴连同培养皿或培养板一同放入(X)2培养箱中平衡池以上。上述的精液，最好采用Percoll梯度(45%/90%)离心法收集活力较好的精子，之后再进行稀释。体外受精将成熟液中的成熟卵子按每个受精液滴中30 50个成熟卵子的比例移入受精液滴中，然后放入在38 39°C、4 6% CO2、饱和湿度环境的培养箱中进行体外受精并培养18 Mh。
所述的成熟卵子最好在HSOF中洗涤2 4次后，再移入受精液滴中进行体外受精和培养。上述的受精液滴在移入成熟卵子后之后最好再在每滴受精液滴中加入5 10 μ L 精子稀释液。上述成熟液中培养的成熟卵子在使用前最好将卵子间相互分离，所述分离用采用移液器在原成熟盘中反复吹打培养成熟COCs方法实现。胚胎发育液为配制在SOF中加入1 3% BME(EAA)(必需氨基酸)、1 3% MEM(NEAA)(非必需氨基酸)、0. 5 5% BSA(胎牛血清)、0. 05 0. 15 mmol/mL Glutamine (谷氨酰胺)和0. 4 6 mg/mL Mys-Inositol (肌醇)，将胚胎发育液按照50-100 μ 1的容积在培养板或培养皿上做成液滴状，在培养箱中平衡i-池。所述胚胎发育液滴在制作后最好覆盖上石蜡油。受精卵子培养精子与卵子受精培养18 24h后，除去受精卵子周围的颗粒细胞和附着的精子，以15-40枚/滴的密度放入胚胎发育液滴中，在饱和湿度的培养箱中，38 39°C、4 6%ω2下进行体外培养6-8天，受精卵子即发育为胚胎，此时即可将成活的胚胎殖入代孕母羊体内发育成胎儿。上述的卵母细胞的采集最好选择性成熟前的雌性羔羊进行采集，优先选择出生后4-10周龄的性成熟前的雌性羔羊。采集前最好经PMSG_FSH(孕马血清联合促卵泡素)作超数排卵处理2 5次，每次间隔12小时；手术法取出并固定卵巢，注射器抽取COCs (卵丘-卵母细胞复合体)。与现有技术相比，本发明特别是利用幼年羔羊超排处理后采集的卵母细胞进行体外胚胎生产，具有卵母细胞采集数量多、胚胎生产效率高、培育羔羊后代所需时间短等优点，因而在大规模体外胚胎生产应用中具有优势。本发明对于解决当前优质胚胎来源不足的问题还具有重要意义，特别是利用优良母羔羊品种体外大量生产优质胚胎并进行胚胎移植生产后代，有利于缩短优良品种繁殖的世代间隔，大幅提高畜群的遗传改良速度与生产效率。若配合克隆及转基因动物生产技术， 除可提供家畜遗传育种、免疫及细胞生物学等相关领域的研究之用外，还可以加速改善优良基因性状种群的选拔、生产高价生物医药产品供人类临床医学之用，具有广阔的应用前景。
具体实施例方式试剂下列试剂均使用SIGMA公司产品M199培养液(Gibco)，促卵泡素(FSH) (Vetr印harm)，促黄体素(LH) LH和孕马血清(PMSG)(宁波)。实施例1
卵母细胞的采集选用4-10周龄的性成熟前绵羊母羔羊。采集前连续两天注射4次 FSH，每次40mg，最后一次还同时注射500IU PMSG，通过手术法暴露出卵巢，并固定。采用含有采卵液(M199原液+25mmol/L HEPES+0. 2% BSA (胎牛血清)的IOml注射器抽吸卵巢上的卵泡，抽吸完毕将含有COCs的液体放置在采卵液中，并统计卵母细胞数量。成熟液配制在M199培养基原液中加入lOPg/mL FSH (促卵泡素)、lOPg/mL LH (促黄体素)、lPg/mL E2 (雌激素)、0. lmmol/L β -巯基乙醇，并按体积加入20%ESS (发情母羊血清)，在培养箱中平衡I。卵母细胞培养所述培养液制作成50μ L/滴的成熟液微滴，将采集到的COCs先在成熟液中洗涤2次，移入成熟液微滴中，每滴成熟液微滴中以20枚卵母细胞，在38. 5°C、5% CO2、饱和湿度环境下培养Mh，COCs中的卵母细胞成熟为卵子。精子处理在SOF(输卵管合成液)中加入0. 1 μ mol/L青霉胺(Penicillamine)、 0. 1 μ mol/L 亚牛磺酸(Hypotaurine)UO μ g/mL 肝素(H印arin)，按体积再加入 10% ESS 作为受精液，在受精前I，在培养皿中制做受精液滴，每滴50 μ L，受精液滴在制作后覆盖上石蜡油，取冷冻精液，在39°C下解冻，采用Percoll梯度(45%、60%、90%)离心法收集活力较好的精子，稀释成5 X IO6 /mL的精子稀释液，在所述的每个受精液滴中移入10 μ L精子稀释液，将受精液滴连同培养皿一同放入( 培养箱中平衡池以上。体外受精将成熟液中的成熟卵子采用移液器在原成熟盘中反复吹打的方法将卵子间相互分离，在HSOF中洗涤2 4次后，按每个受精液滴中50个成熟卵子的比例移入受精液滴中，之后再在每滴受精液滴中加入10 μ L精子稀释液，然后放入在38. 5°C、5% CO2、 饱和湿度环境的培养箱中进行体外受精并培养M小时。胚胎发育液配制在SOF中，按体积加入2% BME (EAA)(必需氨基酸)、洲 MEM(NEAA)(非必需氨基酸)和觊BSA (胎牛血清)，按重量加入0. Immo 1/mL Glutamine (谷氨酰胺)和3 mg/mL Mys-Inositol (肌醇)，将胚胎发育液按照50 μ L的容积在培养板或培养皿上做成液滴状并覆盖上石蜡油，在培养箱中平衡1-池。受精卵子培养精子与卵子受精培养后，除去受精的卵子周围的颗粒细胞和精子， 在胚胎发育液中清洗2次后，以20枚/滴的密度移入胚胎发育液滴中，在饱和湿度的培养箱中，38. 5°C,5%C02进行体外培养7天后，卵子即发育为胚胎，此时即可将成活的胚胎殖入代孕母羊体内。
实施例2 卵母细胞的采集选用4-10周龄的性成熟前绵羊母羔羊。采集前连续两天注射2次FSH，每次50mg，最后一次还同时注射400IU PMSG，通过手术法暴露出卵巢，并固定。采用含有采卵液(M199原液+20mmol/L HEPES+0. 3% BSA (胎牛血清)的IOml注射器抽吸卵巢上的卵泡，抽吸完毕将含有COCs的液体放置在采卵液中，并统计卵母细胞数量。成熟液配制在M199培养基原液中加入8Pg/mL FSH(促卵泡素)、12Pg/mL LH (促黄体素)、1. 5“g/mL E2 (雌激素)、0· 15mmol/L β -巯基乙醇，并按体积加入20%ESS(发情母羊血清)，使用前制作成40 μ L/滴的成熟液微滴，在培养箱中平衡lh。卵母细胞培养将采集到的COCs先在成熟液中洗涤1次后，在每滴成熟液微滴中移入10枚卵母细胞，在38. 8°C、6% CO2、饱和湿度环境下培养22h。受精液配制在SOF (输卵管合成液)中加入0· 2 μ mol/L青霉胺 (Penicillamine)、。· 1 μ mol/L 亚牛磺酸(Hypotaurine)、5 μ g/mL 肝素(Heparin)禾口(按体积)10% ESS，作为受精液，受精前Ih在培养板中制做受精液滴，每滴60 μ L，所述受精液滴在制作后覆盖上石蜡油，将受精液滴连同培养皿或培养板一同放入CO2培养箱中平衡池。精子处理取新鲜或者解冻后的精液，采用Percoll梯度(50%、70%、90%)离心法收集活力较好的精子，稀释成6Χ IO6 /mL的精子稀释液，在上述的每个受精液滴中移入 8μ L精子稀释液。
体外受精将成熟液中的成熟卵子，用移液器在原成熟盘中反复吹打将卵子间相互分离，将成熟卵子在HSOF (浓度为10 mmol/L. HEPES [4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸]的SOF 液)中洗涤2次后，按每个受精液滴中40个成熟卵子的比例移入受精液滴中，之后再在每滴受精液滴中加入5 μ L精子稀释液，然后置于38°C、4%C02的饱和湿度的培养箱中受精20h。胚胎发育液配制在SOF中，按体积加入1% BME (EAA)(必需氨基酸)、1% MEM(NEAA)(非必需氨基酸)5% BSA (胎牛血清)，按重量加入0.15 mmol/mL Glutamine (谷氨酰胺)和6 mg/mL Mys-Inositol (肌醇)，将胚胎发育液按照80 μ 1的容积在培养板或培养皿上做成液滴状并覆盖上石蜡油，在培养箱中平衡lh。受精卵子培养精子与卵子受精培养，除去受精的卵子周围的颗粒细胞和精子，在胚胎发育液中清洗2次后，在每个胚胎发育液滴中移入30枚卵子，在饱和湿度的培养箱中， 38 39°C、4 6%0)2进行体外培养6_8天后，卵子即发育为胚胎，此时即可将成活的胚胎殖入代孕母羊体内。实施例3 卵母细胞的采集选用4-10周龄的性成熟前绵羊母羔羊。采集前连续两天注射4次FSH，每次50mg，最后一次还同时注射500IU PMSG，通过手术法暴露出卵巢，并固定。采用含有采卵液(M199原液+30mmol/L HEPES+0. 2% BSA (胎牛血清)的IOml注射器抽吸卵巢上的卵泡，抽吸完毕将含有COCs的液体放置在采卵液中。成熟液配制在M199培养基原液中加入12Pg/mL FSH(促卵泡素)、8Pg/mL LH (促黄体素)、1. 5“g/mL E2 (雌激素)、0· 15mmol/L β -巯基乙醇，并按体积加入20%ESS(发情母羊血清)，使用前制作成60 μ L/滴的成熟液微滴，在培养箱中平衡池。卵母细胞培养将采集到的COCs先在成熟液中洗涤2次，在每滴成熟液微滴中移入15枚卵母细胞，在38. 3°C、6% CO2、饱和湿度环境下培养^h，COCs中的卵母细胞成熟为卵子。受精液配制在SOF (输卵管合成液)中加入0· 15 μ mol/L青霉胺 (Penicillamine)、。· 15 μ mol/L 亚牛磺酸(Hypotaurine)、6 μ g/mL 肝素(Heparin)和(按体积)8% ESS，作为受精液，受精前1. ，在培养皿中制做受精液滴，每滴40 μ L，在受精液滴上覆盖上石蜡油，将受精液滴连同培养皿或培养板一同放入CO2培养箱中平衡4h以上。精子处理取新鲜精液稀释成4X IO6 /mL的精子稀释液，在所述的每个受精液滴中移入SyL精子稀释液。体外受精将成熟液中的成熟卵子，用移液器在原成熟盘中反复吹打将卵子间相互分离，将成熟卵子在HSOF (浓度为8 mmol/L HEPES [4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸]的SOF液)
中洗涤2 4次后，按每个受精液滴中40个成熟卵子的比例移入受精液滴中，之后再在每滴受精液滴中加入5μ L精子稀释液，然后置于39°C、6%0)2的饱和湿度的培养箱中受精 20h。胚胎发育液配制在SOF中，按体积加入3% BME (EAA)(必需氨基酸)、1. 5% MEM(NEAA)(非必需氨基酸)和4% BSA(胎牛血清)，按重量加入0.15 mmol/mL Glutamine (谷氨酰胺)和ang/mL Mys-Inositol (肌醇)，将胚胎发育液按照100 μ 1的容积在培养板或培养皿上做成液滴状并在发育液滴上覆盖石蜡油，在培养箱中平衡池。受精卵子培养以35枚/滴的密度移入胚胎发育液滴中，在饱和湿度的培养箱中， 38°C、4%C02进行体外培养8天后，卵子即发育为胚胎，此时即可将成活的胚胎殖入代孕母羊体内。实施例4 卵母细胞的采集选用4-10周龄的性成熟前绵羊母羔羊。采集前连续两天注射3次FSH，每次45mg，最后一次还同时注射450IU PMSG，通过手术法暴露出卵巢，并固定。采用含有采卵液(M199原液+15mmol/L HEPES+0. 5% BSA (胎牛血清)的IOml注射器抽吸卵巢上的卵泡，抽吸完毕将含有COCs的液体放置在采卵液中。成熟液配制在M199培养基原液中加入9Pg/mL FSH(促卵泡素)、llPg/mL LH (促黄体素)、1. 2“g/mL E2 (雌激素)、0. 08mmol/L β -巯基乙醇，并按体积加入18%ESS(发情母羊血清)，使用前制作成60 μ L/滴的成熟液微滴，在培养箱中平衡池。卵母细胞培养将采集到的COCs先在成熟液中洗涤2次后，在每滴成熟液微滴中移入20枚卵母细胞，在39°C、5. 5% CO2、饱和湿度环境下培养23h，COCs中的卵母细胞成熟为卵子。受精液配制在SOF (输卵管合成液)中加入0. 1 2 μ mol/L青霉胺 (Penicillamine)、。· 2 μ mol/L 亚牛石黄酸(Hypotaurine)、5 μ g/mL 月干素(H印arin)禾口(按体积)6% ESS,作为受精液，在受精前1. 2h,在培养皿或培养板中制做受精液滴，每滴50 μ L，受精液滴在制作后覆盖上石蜡油，将受精液滴连同培养皿或培养板一同放入(X)2培养箱中平衡5h以上。精子处理取新鲜精液稀释成5 X IO6 /mL的精子稀释液，在所述的每个受精液滴中移入10 μ L精子稀释液。体外受精将成熟液中的成熟卵子按每个受精液滴中30个成熟卵子的比例移入受精液滴中，之后再在每滴受精液滴中加入 ο μ L精子稀释液，然后置于38. 6°C、4. 5%C02 的饱和湿度的培养箱中受精Mh。胚胎发育液配制在SOF中，按体积加入1. 2% BME (EAA)(必需氨基酸)、3% MEM (NEAA)(非必需氨基酸)和5% BSA(胎牛血清)，按重量加入0.15 mmol/mL Glutamine (谷氨酰胺)和6 mg/mL Mys-Inositol (肌醇)，将胚胎发育液按照60 μ 1的容积在培养皿上做成液滴状并在发育液滴上覆盖石蜡油，在培养箱中平衡池。受精卵子培养精子与卵子受精培养M小时后，除去受精的卵子周围的颗粒细胞和精子，在胚胎发育液中清洗1-2次后，以20枚/滴的密度将受精卵子移入胚胎发育液滴中，在饱和湿度的培养箱中，38. 7V、5. 5%C02进行体外培养6天后，卵子即发育为胚胎，此时即可将成活的胚胎殖入代孕母羊体内。实施例5 卵母细胞的采集选用4-10周龄的性成熟前绵羊母羔羊。采集前连续两天注射2次FSH，每次50mg，最后一次还同时注射550IU PMSG，通过手术法暴露出卵巢，并固定。采用含有采卵液(M199原液+25mmol/L HEPES+0. 5% BSA (胎牛血清)的IOml注射器抽吸卵巢上的卵泡，抽吸完毕将含有COCs的液体放置在采卵液中。成熟液配制在M199培养基原液中加入dOPg/mL FSH(促卵泡素)、(^g/mL LH (促黄体素)、01. 5Pg/mL E2 (雌激素)、00· 15mmol/L β -巯基乙醇，并按体积加入20%ESS (发情母羊血清)，使用前制作成60 μ L/滴的成熟液微滴，在培养箱中平衡1.证。卵母细胞培养将采集到的COCs先在成熟液中洗涤2次，在每滴成熟液微滴中移入20枚卵母细胞，在38. 5°C、5% CO2、饱和湿度环境下培养22h，COCs中的卵母细胞成熟为卵子。
受精液配制在SOF (输卵管合成液)中加入0. 1 μ mol/L青霉胺 (Penicillamine)、。· 2 μ mol/L 亚牛磺酸(Hypotaurine)、5 μ g/mL 肝素(H印arin)禾口(按体积》％ ESS,作为受精液，在受精前池，在培养皿或培养板中制做受精液滴，每滴60 μ L，所述受精液滴在制作后覆盖上石蜡油，将受精液滴连同培养皿或培养板一同放入ω2培养箱中平衡汕。精子处理取冷冻的精液，在39°C水浴中解冻后采用Percoll梯度(45%、60%、 75%、90%)离心法收集活力较好的精子，稀释成5 X IO6 /mL的精子稀释液，在所述的每个受精液滴中移入12 μ L精子稀释液。体外受精将成熟液中的成熟卵子，用移液器在原成熟盘中反复吹打将卵子间相互分离后，将成熟卵子在HSOF (浓度为8 mmol/L. HEPES[4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸]的SOF 液)中洗涤3次，按每个受精液滴中40个成熟卵子的比例移入受精液滴中，之后再在每滴受精液滴中加入10 μ L精子稀释液，置于38. 8°C、4. 2%C02的饱和湿度的培养箱中受精18h。胚胎发育液配制在SOF中，按体积加入1.5% BME(EAA)(必需氨基酸)、1.5% MEM (NEAA)(非必需氨基酸)和1% BSA(胎牛血清)，按重量加入0.1 mmol/mL Glutamine (谷氨酰胺)和5 mg/mL Mys-Inositol (肌醇)，将胚胎发育液按照50 μ 1的容积在培养板或培养皿上做成液滴状并在发育液滴上覆盖石蜡油，在培养箱中平衡lh。受精卵子培养精子与卵子受精培养18 M小时后，除去受精的卵子周围的颗粒细胞和精子，将受精的卵子在胚胎发育液中清洗2次，以15枚/滴的密度移入胚胎发育液滴中，在饱和湿度的培养箱中，39°C、6%C02进行体外培养6天后，卵子即发育为胚胎，此时即可将成活的胚胎殖入代孕母羊体内。实施例6 卵母细胞的采集选用4-10周龄的性成熟前绵羊母羔羊。采集前连续两天注射2次FSH，每次50mg，最后一次还同时注射550IU PMSG，通过手术法暴露出卵巢，并固定。采用含有采卵液(M199原液+35mmol/L HEPES+0. 5% BSA (胎牛血清)的IOml注射器抽吸卵巢上的卵泡，抽吸完毕将含有COCs的液体放置在采卵液中。成熟液配制在M199培养基原液中加入12Pg/mL FSH(促卵泡素)、12Pg/mL LH (促黄体素)、l“g/mL E2 (雌激素)、0. 15mmol/L β -巯基乙醇，并按体积加入18%ESS(发情母羊血清)，使用前制作成^yL/滴的成熟液微滴，在培养箱中平衡池；
卵母细胞培养将采集到的COCs先在成熟液中洗涤2次后，在每滴成熟液微滴中移入 20枚卵母细胞，在38°C、6% CO2、饱和湿度环境下培养沈11，COCs中的卵母细胞成熟为卵子。受精液配制在SOF (输卵管合成液)中加入0· 15 μ mol/L青霉胺 (Penicillamine),0. 12 μ mol/L 亚牛磺酸(Hypotaurine)、6 μ g/mL 肝素(H印arin)和(按体积)6% ESS,作为受精液，在受精前lh，在培养皿或培养板中制做受精液滴，每滴55 μ L，所述受精液滴在制作后覆盖上石蜡油，将受精液滴连同培养皿或培养板一同放入CO2培养箱中平衡池。精子处理取新鲜或者解冻后的精液，采用Percoll梯度(50%、60%、70%、80%、 90%)离心法收集活力较好的精子，稀释成5. 5X IO6 /mL的精子稀释液，在每个受精液滴中移入10 μ L精子稀释液。体外受精将成熟液中的成熟卵子，用移液器在原成熟盘中反复吹打将卵子间相互分离，将成熟卵子在HSOF中洗涤4次后，按每个受精液滴中40个成熟卵子的比例移入受精液滴中，之后再在每滴受精液滴中加入8μ L精子稀释液，然后置于38°C、6%0)2的饱和湿度的培养箱中受精20h。胚胎发育液配制在SOF中，按体积加入3% BME (EAA)(必需氨基酸)、 3% MEM(NEAA)(非必需氨基酸)和05% BSA (胎牛血清)，按重量加入0.05 mmol/mL Glutamine (谷氨酰胺)和0. 5 mg/mL Mys-Inositol (肌醇)，将胚胎发育液按照70 μ 1的容积在培养板或培养皿上做成液滴状并在发育液滴上覆盖石蜡油，在培养箱中平衡lh。受精卵子培养精子与卵子受精培养18 M小时后，除去受精的卵子周围的颗粒细胞和精子，在胚胎发育液中清洗1-2次，以30枚/滴的密度移入胚胎发育液滴中，在饱和湿度的培养箱中，38. 5°C,5%C02进行体外培养7天后，卵子即发育为胚胎，此时即可将成活的胚胎殖入代孕母羊体内。
权利要求
1.一种利用羔羊超排卵母细胞生产体外胚胎的方法，其特征在于通过以下过程实现成熟液配制在M199培养基原液中加入8 12Pg/mL FSH(促卵泡素)、8 12Pg/mL LH (促黄体素)、0. 5 1. 5Pg/mL E2 (雌激素)、0. 05 0. 15mmol/L β -巯基乙醇和10 20%ESS (发情母羊血清)，培养液在使用前制作成40 60 μ L/滴的成熟液微滴，在培养箱中平衡1 : ；卵母细胞培养将采集到的COCs (卵丘-卵母细胞复合体)移入成熟液微滴中，每滴成熟液微滴中移入10 20枚卵母细胞，在38 39°C、4 6% CO2、饱和湿度环境下培养22 26h, COCs中的卵母细胞成熟为卵子；受精液配配制在SOF (输卵管合成液)中加入0. 1 0. 2 μ mol/L青霉胺 (Penicillamine)、。· 1 0· 2 μ mol/L 亚牛磺酸(Hypotaurine)、5 10 μ g/mL 肝素 (!feparin)和2 10% ESS (发情母羊血清)，在受精前1 池，在培养皿或培养板中制做受精液滴，每滴40 60yL ；精液处理取新鲜或者解冻后的精液，稀释成4X IO6 6X106 /mL的精子稀释液，在所述的每个受精液滴中移入8 12 μ L精子稀释液，将受精液滴连同培养皿或培养板一同放入(X)2培养箱中平衡池以上；体外受精将成熟液中的成熟卵子按每个受精液滴中30 50个成熟卵子的比例移入受精液滴中，然后放入在38 39°C、4 6% CO2、饱和湿度环境的培养箱中进行体外受精并培养18 24h ；胚胎发育液为配制在SOF中加入1 3% BME(EAA)(必需氨基酸)、1 3% MEM(NEAA)(非必需氨基酸)、0. 5 5% BSA(胎牛血清)、0. 05 0. 15 mmol/mL Glutamine (谷氨酰胺)和0. 4 6 mg/mL Mys-Inositol (肌醇)，将胚胎发育液按照50-100 μ 1的容积在培养板或培养皿上做成液滴状，在培养箱中平衡1- ；受精卵子培养精子与卵子受精培养18 24h后，除去受精卵子周围的颗粒细胞和附着的精子，以15-40枚/滴的密度放入胚胎发育液滴中，在饱和湿度的培养箱中，38 39°C、4 6%C02下进行体外培养6-8天。
2.根据权利要求1所述的利用羔羊超排卵母细胞生产体外胚胎的方法，其特征在于 所述COCs先在成熟液中洗涤1 2次后，再移入成熟液微滴中进行培养；所述的成熟卵子在HSOF中洗涤2 4次后，再移入受精液滴中进行体外受精和培养；所述受精卵子在胚胎发育液中清洗1-2次后，再放入胚胎发育液滴中进行培养；所述HSOF为含有8 12 mmol/L hepes (4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸)的S0F。
3.根据权利要求1或2所述的利用羔羊超排卵母细胞生产体外胚胎的方法，其特征在于所述受精液滴和胚胎发育液滴在制作后覆盖上石蜡油。
4.根据权利要求1或2所述的利用羔羊超排卵母细胞生产体外胚胎的方法，其特征在于所述的精液采用Percoll梯度(45%/90%)离心法收集活力较好的精子，之后再进行稀释。
5.根据权利要求3所述的利用羔羊超排卵母细胞生产体外胚胎的方法，其特征在于 所述的精液采用Percoll梯度(45%/90%)离心法收集活力较好的精子，之后再进行稀释。
6.根据权利要求1或2所述的利用羔羊超排卵母细胞生产体外胚胎的方法，其特征在于所述的受精液滴在移入成熟卵子之后再在每滴受精液滴中加入5 10 μ L精子稀释液。
7.根据权利要求3所述的利用羔羊超排卵母细胞生产体外胚胎的方法，其特征在于 所述的受精液滴在移入成熟卵子之后再在每滴受精液滴中加入5 10 μ L精子稀释液。
8.根据权利要求4所述的利用羔羊超排卵母细胞生产体外胚胎的方法，其特征在于 所述的受精液滴在移入成熟卵子之后再在每滴受精液滴中加入5 10 μ L精子稀释液。
9.根据权利要求5所述的利用羔羊超排卵母细胞生产体外胚胎的方法，其特征在于 所述的受精液滴在移入成熟卵子后之后再在每滴受精液滴中加入5 10 μ L精子稀释液。
10.根据权利要求1或2所述的利用羔羊超排卵母细胞生产体外胚胎的方法，其特征在于选择性成熟前的雌性羔羊进行卵母细胞的采集。
全文摘要
本发明公开了一种羔羊超排卵母细胞生产体外胚胎的方法，通过以下技术方案实现的将从羔羊体内采集到的卵母细胞在成熟液中进行体外培养成熟为卵子，再经体外受精和培养，使卵子发育为胚胎，即可将成活的胚胎移植到代孕母羊体内进行繁育。与现有技术相比，本发明特别是利用幼年羔羊超排处理后采集的卵母细胞进行体外胚胎生产，具有卵母细胞采集数量多、胚胎生产效率高、培育羔羊后代所需时间短等优点，因而在大规模体外胚胎生产应用中具有优势。
文档编号C12N5/073GK102296047SQ20111023296
公开日2011年12月28日 申请日期2011年8月13日 优先权日2011年8月13日
发明者万鹏程, 代蓉, 倪建宏, 刘长彬, 张宾, 石国庆, 石文艳, 郭洪 申请人:新疆农垦科学院