专利名称：一种含组成型启动子pPGK和G418抗性基因的酿酒酵母表达载体及其构建方法
技术领域：
本发明属于分子生物学基因工程领域，主要涉及一种酿酒酵母用G418为筛选标记的表达载体的构建方法，具体地涉及酿酒酵母以G418为选择性标记同时质粒上含有 PPGKl启动子的质粒的构建方法。
背景技术：
大肠杆菌E. coli表达系统是基因表达技术中发展最早，目前应用最广泛的经典表达系统，但外源蛋白在大肠杆菌E. coli中常以不溶性的包涵体形式表达，产物纯化困难。同时，大肠杆菌作为表达宿主，尤其是对于真核基因的表达，翻译后的加工修饰体系不完善，表达的产物活性低或者没有活性。为了克服大肠杆菌表达系统的不足，需要发展新的真核表达系统。酵母表达系统拥有转录后加工修饰功能，操作简便，成本低廉，适合于稳定表达有功能的外源蛋白质，而且可大规模发酵，是最理想的重组真核蛋白质生产制备用工具。酿酒酵母是一种极为重要的工业微生物，也是一种重要的基因真核表达系统，常被用于生产多种生物物质，如氨基酸、酶、谷胱甘肽、乙醇等等。由于酿酒酵母全基因组已经测序，它被美国食品与药品安全管理局(Food and Drug Administration，FDA)认证为安全的微生物，可以用于食品、制药等行业。但是，在酵母的基因操作领域常用的酿酒酵母表达载体如pTO212、pUG36多为营养缺陷作为筛选标记。这就要求宿主菌必须是营养缺陷型，大大限制了酵母菌基因工程研究中的受体菌的使用单位。使用各种理化因素将一株完整营养型的酵母通过筛选营养缺陷是目前常用而又最常见的方法。但是，诱变筛选是一个繁琐而又费时费力的过程，诱变存在很大的不确定性，而且容易产生回复突变。同时，筛选得到的营养缺陷菌株应用于实际生产中，需要添加必须的营养成分，无疑增加了生产成本。虽然， 亦可以通过基因敲除手段构建营养缺陷菌株，但是存在着操作成本高，需要一系列基因操作，费时费力。因此常用的营养缺陷为筛选标记的质粒对于酿酒酵母基因工程操作过程中酿酒酵母转化体系的建立带来很大不便。G418是一种氨基糖苷类抗生素，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成， 对原核和真核等细胞都有毒性，是稳定转染最常用的选择试剂。已有研究表明，来自大肠杆菌转座子Tn903的卡那霉素抗性基因与表达调控序列来自丝状真菌Astibya gossypii (针孢酵母)的TEF基因相融合，所组成的KanMX元件可以在酵母细胞中表达氨基糖苷磷酸转移酶，将G418转变成无毒形式，从而赋予酵母细胞以G418抗性。由于G418可用于选择细菌、酵母，植物和哺乳动物细胞。可以以G418作为筛选标记，大大简化了重组转化酵母的筛选过程。将G418基因从pFA6a-GFPS65T-kanMX6表达载体上克隆下来连接到常用的表达载体上，使该载体获得G418抗性，有利于酿酒酵母转化子的筛选
发明内容
本发明是克服上述技术的不足，构建出一种用G418为筛选标记酿酒酵母表达载体，并提供了一条可行的酿酒酵母表达载体构建方法。本发明的目的通过以下技术方案来实现本发明以pYES 2. 0载体作为基本骨架，以质粒pFA6a-GFPS65T-kanMX6为模板， 采用PCR的方法克隆获得KanMX的抗性基因；同样以酿酒酵母基因组DNA为模板，采用PCR 的方法获得PGK启动子片段，构建出具有G418抗性的组成型酿酒酵母表达载体；并以构建的表达载体，采用醋酸锂方法转化工业酿酒酵母二倍体菌株，使得转化后的菌株可以耐受 120ug/ml的G418，使转化子的筛选简便易行。1、KanMX抗性标记基因的克隆根据pYES 2. 0酶切位点特性，选择KanMX基因的插入位点，设计克隆KanMX基因的引物，两端分别含有Nhe I/Nde I酶切位点，以质粒pFA6a-GFPS65T-kanMX6为模板，用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，电泳回收目的片段，克隆到pMDIS-T载体上，转入大肠杆菌 E. coli DH5a，测序。命名该克隆载体为pMD18-T_KanMX。2、G418抗性载体的构建分别用限制性内切酶Nhe I和Nde I酶切ρYES 2. 0和pMD18_T_KanMX，回收相应片段，用T4 DNA连接酶进行连接，转化E. coli DH5 α感受态细胞。提取质粒进行酶切鉴定。 载体命名为pYES-Kanl。3、PGK启动子的克隆根据pYES 2. 0质粒启动子pGAL酶切位点特性，选择组成型启动子pPGK基因的插入位点，设计引物，引物两端分别引入Age I和EcoR I酶切位点，以酿酒酵母染色体DNA为模板，用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，电泳回收目的片段，克隆到pMDIS-T载体上，转入大肠杆菌E. coli DH5a，测序。命名该克隆载体为pMD18_T_PGK。4、组成型G418抗性载体的构建分别用限制性内切酶Age I和EcoR I酶切pYES-Kanl和pMD18_T_PGK，回收相应片段，用T4 DNA连接酶进行连接，将克隆的PGK启动子构建至pYES-Kanl相应位置，转化 E. coliDH5a感受态细胞，提取质粒进行酶切鉴定。即得到酿酒酵母组成型表达载体，载体命名为 pPGK-KanMX。本发明通过将构建的重组质粒，采用醋酸锂方法转化酿酒酵母工业菌株(可以耐受80ug/ml G418)，用G418抗性平板筛选转化子(120ug/ml)，使得该菌株可以在120ug/ml 的G418，表明本发明方法构建的质粒转化酿酒酵母可以增加G418抗性，使转化子的筛选简单易行，大大简化了酿酒酵母遗传转化过程。通过实施本发明具体的技术指标，实现本发明内容，达到以下有益效果。本发明通过提供一种酿酒酵母组成型表达载体及其构建方法，为探索一条可行的酿酒酵母表达载体构建方法或构建出商品化的酿酒酵母表达载体将具有重要的意义。
图1 :KanMX抗性标记基因的PCR电泳图，其中M是分子量标准DL2000，1为扩增得到的目的基因片段。图2 重组质粒载体pMD18-T-KanMX的PCR鉴定的电泳图，其中M是分子量标准DL2000,1，2，3，4，5，6，7为PCR扩增得到的KanMX基因产物。图3 重组质粒pYES-Kanl的酶切电泳图，其中，M是分子量标准DL2000，1为表达载体的酶切产物，2为非重组质粒。图4 :PGK启动子的基因的PCR电泳图，其中，M是分子量标准DL2000，1为扩增得到的目的基因片段。图5 重组质粒pYES-KanMX的酶切电泳图，其中，M是分子量标准DL2000，1为表达载体的酶切产物，2为非重组质粒。图6 含G418为抗性筛选标记的组成型表达载体的质粒图谱。
具体实施例方式通过以下实例对本发明作进一步的详细说明，但并不以此来限定本发明。实施例1 实验材料和试剂1. 1菌株与质粒大肠杆菌E. coli DH5 α、酿酒酵母均为本实验保存。质粒pFA6a-GFPS65T_kanMX6 为本实验室保存，克隆载体PMD18-T购自TaKaRa宝生生物工程(大连)有限公司，质粒pYES 2. 0 购自 hvitrogen 公司。1. 2主要生化试剂质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；高保真DNA聚合酶 PrimeSTAR HS DNA Polymerase、T4 连接酶、限制性内切酶 EcoRI、Nhe I,Nde I 均购自宝生生物工程(大连)有限公司。限制性内切酶Age I、DNA胶纯化回收试剂盒购自！^rmentas 公司。引物合成及菌液测序由南京金丝瑞生物科技有限公司完成。实施例2引物设计根据质粒pFA6a-GFPS65T-kanMX6中的KanMX的基因序列结合ρYES 2. 0质粒序列特征设计引物并引入合适的酶切位点，引物如下KanMX6基因序列的克隆引物Kan-F 见序列表中序列1 (引入Nde I酶切位点)Kan-R 见序列表中序列2 (引入Nhe I酶切位点)含KanMX基因质粒pMD18-T_KanMX的PCR鉴定引物RV-M 见序列表中序列3M13-47 见序列表中序列4启动子pPGK基因序列的克隆引物pPGK-F 见序列表中序列5 (引入Age I酶切位点)pPGK-R 见序列表中序列6 (引入EcoR I酶切位点)实施例3KanMX基因的克隆以质粒 pFA6a-GFPS65T-kanMX6 为模板，以 Kan_F、Kan-R 为引物，扩增 KanMX 基因。 扩增条件为:94V 5min ；94°C变性 30s，55°C退火 lmin20s，72°C延伸 2min，30 个循环，72°C
5延伸lOmin。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测。实施例4扩增产物的克隆和测序4. IPCR产物的回收将KanMX基因用Silica Bead DNA Gel Extraction Kit(Fermentas)回收试剂盒进行特异性扩增产物的回收纯化，操作步骤如下(1)在1.0%的琼脂糖凝胶电泳中电泳，使扩增产物分离形成单一的目的条带，切下目的条带放入干净的离心管中；(2)按3倍胶的重量体积加入溶胶液，即IOOmg加入300ul的binding buffer ； 55°C水浴5min至胶完全溶解；溶解后溶液颜色为黄色。(3)加入混悬均勻的硅粉悬液3-5ul，55°C水浴5min，让DNA与硅粉结合，其间偶尔摇动保持硅粉悬浮；(4) 12000rpm离心5s，使DNA/硅粉沉淀，弃去废液；(5)加入500ul漂洗液(washing buffer)漂洗，重悬硅粉；12000rpm离心5s，弃
上清。重复漂洗3次；(6) 37 °C培养箱培养20-30min，以去除乙醇；用灭菌的双蒸水或者TE缓冲液 5-10ul悬浮硅粉，55°C水浴5min，12000rpm离心5s，上清即为回收的目的片段。4. 2回收产物的连接和转化回收产物连接到pMDIS-T载体上，按照TaKaRa公司的连接试剂盒说明书进行操作。转化E. coli DH5a感受态采用热激法进行。(1)将回收的纯化的PCR产物连接到pMDIS-T载体上，在离心管中分别加入下列成分回收产物3. 5ul ；T载体Iul ；2XT4Buffer 5ul ；T4DNA连接酶0. 5ul ；轻轻混勻后4°C连接 12-lMir ；(2)从_70°C冰箱中取出IOOul感受态细胞，至于冰上解冻后加入IOul的连接产物，轻轻混勻，冰浴30min ；(3) 42°C水浴热激90s，迅速置冰上冷却2_5min ；(4)向管中加入Iml LB液体培养基，混勻后37°C培养90min ；(5)4000rpm 离心 5min，上清弃去 850ul，加入 Amp 1.5_3ul(浓度为 100mg/ml)，取 200ul涂布含有50-100ug/ml Amp的LB筛选平板，37°C倒置培养12_16hr ；(6)待平板上长出菌落后即为重组子。4. 3质粒DNA提取用灭菌牙签挑取含Amp的LB平板上的单菌落，接种于3ml含Amp (50ug/ml) LB液体培养基，37°C振荡培养过夜。质粒提取按照天根生化科技(北京)有限公司试剂盒使用操作手册的方法进行。(1)取500ul过夜培养的菌液，12000rpm离心lmin，弃去上清；(2)用250ul已加RNaseA的溶液I均勻悬浮细菌沉淀，室温放置5min ；(3)加入250ul溶液II，温和上下翻转4_6次混勻，使菌体充分裂解；(4)加入350ul溶液III，上下翻转4-6次混勻，12000rpm离心IOmin ；(5)吸取离心的上清并转到DNA制备管中，12000rpm离心Imin ；
(6)将制备管放回离心管中，加入500ul的Buffer Wl，12000rpm离心Imin ；弃滤液；(7)将制备管放回离心管中，加入700ul的Buffer W2，12000rpm离心Imin ；弃滤
液；重复洗涤一次。(8)将制备管移入新的干净的离心管中，在膜正中央处加入30-40ul的灭菌的双蒸水，室温静置Imin ； 12000rpm离心lmin。将得到的质粒于_20°C保存。4. 4质粒的PCR鉴定及测序根据pMD18-T载体图谱，以外源片段插入的两端引物(RV_M/M13_47)对提取的质粒进行PCR鉴定。将鉴定的阳性克隆的菌液，送南京金丝瑞生物科技有限公司测序部进行基因测序。命名该载体为pMD18-T-KanMX，全长为4058bp，其特征在于所含的KanMX基因可作为构建其他表达载体的供体。实施例5载体pMD18-T_KanMX 和 pYES 2. 0 质粒的酶切将质粒pYES 2. 0和测序后正确的质粒pMD18-T-KanMX，首先用限制性内切酶Nde I进行酶切。酶切体系为50ul，由2ul Nde I (10U/ul)、5ul IOXH buffer与38ul灭菌的双蒸水组成，37°C过夜酶切。酶切后加入1/10体积的3mol/L的醋酸钠(pH 5. 2),2.5倍体积的无水乙醇进行沉淀。_20°C沉淀30-50min，12000rpm离心lOmin，用70%的乙醇洗一次。 纯化后使用限制性内切酶Nhe I进行二次酶切。酶切体系为50ul，由2ul Nhe I (10U/ul)、 5ul IOXM buffer和40ul灭菌的双蒸水组成，37°C过夜酶切。质粒pYES 2. O和测序后正确的质粒pMD18-T_KanMX后经两次单酶切后回收的方法按照实施例4中的4.1进行。实施例6G418抗性载体的构建将经Nde I和Nhe I酶切后的质粒pYES 2. O和pMD18-T_KanMX的酶切产物，在4°C 条件下连接12-1他1·，即可以获得以G418为抗性筛选标记的质粒pYES-Kanl。连接体系为 10ul，由 lullOXT4 DNA 连接 buffer、0. 5ul T4 DNA 连接酶(350U/ul)、限制性酶切后的质 SpYES 2. O片段和KanMX基因序列片段分别为1. 2ug和5ug，以灭菌的双蒸水补足至10ul。将连接产物按照实施例4中的4. 2进行转化保存，按照实施例4中4. 3的方法进行质粒的提取。以提取后的质粒为模板，以引物Kan-F/Kan-R进行PCR验证。实施例7酿酒酵母基因组DNA的提取(1)取細1酵母菌4000rpm离心5min后收集沉淀，再用等体积的无菌蒸馏水洗涤 1-2 次；(2)将细胞沉淀用 200ul 裂解缓冲液(2% (v/v) Triton X-100U % (v/v) SDS, IOOmM NaClUOMm Tris-HCl pH 8. OUmM EDTA ρΗ 8.0)中重新悬浮，然后加入约0. 3g玻璃珠和200ul的1 1苯酚/氯仿混合液；(3)漩涡振荡l-2min ；加200ul TE (pH 8. 0)，轻轻倒转混勻；(4) 12000rpm离心IOmin取上清，加入等体积的酚氯仿异戊醇Q5 24 1), 12000rpm离心lOmin，取上清；重复抽提一次；
(5)加入2. 5倍体积预冷的无水乙醇和1/10体积的醋酸钠(3M，pH5. 2)，_20°C冰箱放置 30-40min ;12000rpm 离心 lOmin，弃上清；加入 600-800ul 75% (ν/ν)洗涤一次，倒置晾干；(6)待乙醇完全挥发后，加20_40ul ddH20,室温放置，使DNA溶解；实施例8pPGK启动子基因的克隆以酿酒酵母基因组DNA为模板，以pPGK-F、pPGK-R为引物，扩增pPGK基因。扩增条件为:94V 4min ；94°C变性 lmin，54°C退火 lmin20s，72°C延伸 lmin20s，30 个循环，72°C 延伸15min。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测。pPGK基因PCR产物的回收、回收产物与pMD18_T连接和转化、质粒pMD18_T_PGK提取、质粒pMD18-T-PGK的PCR鉴定及测序与实施例4的操作步骤相同。实施例9载体pYES-Kanl 和质粒 pMD18_T_PGK 的酶切将质粒pYES-Kanl和测序后正确的质粒pMD18_T_PGK，首先用限制性内切酶Age I 进行酶切。酶切体系为50ul，由2ul Age I (10U/ul)、5ul IOXbuffer O与35ul灭菌的双蒸水组成，37°C过夜酶切。酶切后加入1/10体积的3mol/L的醋酸钠(pH 5. 2),2.5倍体积的无水乙醇进行沉淀。-20°C沉淀30-50min，12000rpm离心lOmin，用70%的乙醇洗一次。 纯化后使用限制性内切酶Nhe I进行二次酶切。酶切体系为50ul，由2ul EcoR I (10U/ul)、 5ul IOXHbuffer和!35ul灭菌的双蒸水组成，37°C过夜酶切。质粒pYES-Kanl和测序后正确的质粒PMD18-T-PGK后经两次单酶切后回收的方法按照实施例4中的4.1进行。实施例10组成型载体PPGK-KanMX的构建将经Age I和EcoR I酶切回收后的质粒pYES-Kanl和pMD18-T_KanMX的酶切产物，在4°C条件下连接12-16hr，即可以获得以G418为抗性筛选标记组成型质粒pPGK-Kan。 连接体系为 IOul，由 Iul IOXT4DNA 连接 buffer,0. 5ul T4DNA 连接酶(350U/ul)、限制性酶切后的质粒pYES-Kanl片段和pPGK基因序列片段分别为1. 2ug和5ug，以灭菌的双蒸水补足至IOul。将连接产物按照实施例4中的4. 2进行转化保存，按照实施例4中4. 3的方法进行质粒的提取。以提取后的质粒为模板，以限制性内切酶Age I和EcoR I进行酶切验证。实施例1111. 1质粒pPGK-KanMX转化酿酒酵母(1)将酿酒酵母CGMCC 2842划线接种于YPD平板上，在30°C培养酵母单菌落大小为2mm左右；(2)挑取酵母单菌落到5mL YPD培养基，30°C，200rpm培养16_18hr ；以1 %的接种量转接于50mlYPD培养基，300C，200rpm培养2_4hr，使OD600达到1. 3-1. 5左右；(3)取一管硅精DNA变性，煮沸5min，迅速置于冰水混合物中，制成单链DNA ；(4)取适量预培养物在室温下1500 Xg离心5min，收集细胞，用IX TE洗涤离心两次，弃上清；
(5)用 anl lXLiAc/0. 5XTE 悬浮，室温放置 5-10min ；(6)吸取IOOul步骤(5)中的酵母悬液至1. 5ml离心管中，加入Iug的质粒DNA， IOOug饱和的单链鱼精DNA，再加入700ul的lXLiAc/40% PEG-3350/1 X TE后混合均勻 (同时设置空白对照)；(7)将混合物30°C培养30min，加入88ul的DMS0，轻轻倒转混勻；(8)在421热激15-301^11，在 3000\8下离心308，去除上清;(9)吸取Iml液体YPD加入每管，重悬菌体，在30°C培养3_4hr ；(10)每管转化菌吸取一定量涂在YPD-G418(120ug/ml)平板上，30°C培养3_4d。11.2酵母质粒pPGK-KanMX的提取方法(1)接种转化平板上生长的酿酒酵母一环于3ml液体YPD培养基中，加入G418使其终浓度为120ug/ml，30°C恒温摇床，培养12 IMi至对数期；Q)5000rpm离心5min收集菌体，用TE洗涤一次；(3)用蜗牛酶灭菌的双蒸水悬浮菌体，37°C处理30 60min，至大部分菌体变为球形；G)3000rpm离心5min收集原生质体；(5)将原生质体悬浮于 50mmol/L Tris-HCl (pH 7. 4)，20mmol/L EDTA (pH 7.4)， 1% SDS溶液中65°C处理30min ；(6)加入体积的5mol/L KAc溶液混勻后冰浴30min ；(7) 12000rpm离心lOmin，将上清液转入另一离心管中，用酚氯仿抽提一次；(8)将上层水相转入另一心离心管中，加入2倍体积预冷的无水乙醇，于-20°C放置Ih ；(9) I2OOOrpm,离心 lOmin，弃去上清液；(10)加入适量TE溶解沉淀。所获得的质粒DNA浓度较低并含大量杂质，不能用于酶切电泳，按照实施例4的操作步骤转化大肠杆菌，再提取质粒酶切电泳鉴定。酶切鉴定的结果表明提取的质粒为本实施方式构建的质粒。酿酒酵母CGMCC 2842对120ug/ml的G418敏感，本发明构建的质粒pPGK-KanMX 转化酿酒酵母CGMCC 2842后，使得对G418敏感的菌株可以耐受120ug/ml的G418，表明本发明构建的质粒实现了以G418作为酿酒酵母转化子抗性筛选标记，使转化子的筛选简单易行；同时该载体的启动子由原来的半乳糖诱导的启动子改造为组成型的PPGK组成型的启动组，不需诱导就可以实现相关基因的表达。
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权利要求
1.一种含组成型启动子PPGK和G418抗性基因的酿酒酵母表达载体及其构建方法，其特征在于，以PYES 2. 0为基本骨架，酿酒酵母表达载体含有组成型启动子pPGK基因。
2.根据权利要求1中所述的酿酒酵母用的表达载体，其特征在于所述酿酒酵母表达载体同时含有KanMX基因，即G418的抗性基因。
3.权利要求1所述的酿酒酵母组成型表达载体构建方法，其特征在于，所述的表达载体构建方法具体操作如下(1)KanMX抗性标记基因的克隆根据pYES 2. 0酶切位点特性，选择质粒pYES 2. 0上尿嘧啶筛选标记插入KanMX基因，同时设计克隆KanMX基因的引物，引物两端分别含有Nhe I/Nde I酶切位点，以质粒pFA6a-GFPS65T-kanMX6为模板，用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，电泳回收目的片段，克隆到PMD18-T载体上，转入大肠杆菌E.coli DH5ci，测序。命名该克隆载体为pMD 18-T-KanMX。(2)G418抗性载体的构建分别用限制性内切酶Nhe I和Nde I酶切pYES 2. 0和pMD18-T_KanMX，回收相应片段， 用T4 DNA连接酶进行连接，转化E.coli DH5 α感受态细胞。提取质粒进行酶切鉴定。载体命名为pYES-Kanl。(3)PGK启动子的克隆根据pYES 2. 0质粒启动子pGAL酶切位点特性，选择启动子pPGK基因的插入位点，设计引物，引物两端分别引入Age I和EcoR I酶切位点，以酿酒酵母染色体DNA为模板，用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，电泳回收目的片段，克隆到pMDIS-T载体上，转入大肠杆菌 E.coli DH5a，测序。命名该克隆载体为pMD18_T_PGK。(4)组成型G418抗性载体的构建分别用限制性内切酶Age I和EcoR I酶切ρYES-Kanl和pMD18_T_PGK，回收相应片段，用T4DNA连接酶进行连接，将克隆的PGK启动子构建至pYES-Kanl相应位置，转化 E. coliDH5a感受态细胞，提取质粒进行酶切鉴定。即得到酿酒酵母组成型表达载体，载体命名为 pPGK-KanMX。
全文摘要
本发明公开了一种含组成型启动子pPGK和G418抗性基因的酿酒酵母表达载体及其构建方法，其目的是解决目前酿酒酵母表达载体多以营养缺陷为筛选标记，难以在工业酵母菌株进行基因工程改造过程中使用这一难题。其构建方法步骤如下克隆KanMX基因，与pYES2.0载体连接，构建质粒pYES-Kan1。同时，以酿酒酵母染色体DNA为模板，克隆pPGK启动子基因，将其与pYES-Kan1质粒连接，将其原来的pGAL诱导型启动子替换为pPGK启动子，从而构建组成型酿酒酵母表达质粒pPGK-KanMX。本发明操作简单，构建的质粒无需对工业酵母菌株进行营养缺陷改造即可进行基因操作，大大简化了酵母基因工程改造过程。
文档编号C12N15/66GK102304541SQ20111023521
公开日2012年1月4日 申请日期2011年8月17日 优先权日2011年8月17日
发明者周长林, 奚涛, 曹喜涛, 李扬, 王慧, 窦洁, 陈凯 申请人:中国药科大学