一种多段dna并行组装的方法

专利名称：一种多段dna并行组装的方法
技术领域：
本发明涉及的是遗传工程领域基因重组技术，具体地说是一种多段DNA并行组装的方法。
背景技术：
目前人类所接触到的生命形式，都需要完整的细胞结构才能发挥生物体的全部特征。在细胞当中，DNA是主要的遗传物质，DNA转录形成RNA，RNA翻译得到蛋白质，RNA和蛋白质在生物细胞中实现生物学功能。因此对生物的改造最本质对DNA的改造。对DNA的改造能力决定了人类改造甚至创造生物的能力。2005年以后，合成生物学相关技术需要发展出合适的大规模基因组装技术以适应基因工程、代谢工程的发展和需要。“重组DNA技术” (recombinant DNA technology)发明于1973年，至今仍然普遍使用。但是由于对限制性内切酶的依赖，导致该技术具有以下缺陷
1、常用限制性内切酶识别序列一般为4-8碱基对，通常为6碱基对，平均每4096bp长度的天然DNA当中就含有一个限制性内切酶位点。长片段的DNA往往含有多种限制性内切酶位点而难于操作。2、限制性内切酶位点需要体外操作，而长片段DNA难于进行体外操作。3、当需要回避限制性内酶切位点时，很难并行化操作。为了克服“重组DNA技术”的缺点解决多段DNA组装问题，近年来有以下方法被提出
一、基于内切酶的方法 a) BioBrick 系统
MIT的IGEM组织提倡通过人工合成基因来规避天然DNA当中的原本具有的某些限制性内切酶位点，从而利用同尾酶进行并行化组装。BioBrick协议规定一个标准的BioBrick的 DNA当中依次具有如下结构=EcoRI位点、XbaI位点、DNA片段、SpeI位点、PstI位点。其中合成的DNA片段当中不含有EcoRI、XbaI, SpeKPstI位点。XbaI和SpeI是酶切后具有相同粘性末端的同尾酶，但它们在连接之后得到非回文序列，酶切位点消失，从而使组装的产物仍然具有EcoRI位点、XbaI位点、DNA片段、SpeI位点、PstI位点的顺次结构，可用于进一步组装。此方法的缺点1、合成DNA的成本比较高。2、不能避免大片段DNA难于进行体外操作的问题。b)基于产生不特定粘末端的限制性内切酶的多段DNA连接法。少数限制性内切酶的识别序列中含有不特定序列，例如SfiI的识别位点为 GGCCNNNN~NGGCC，其中N可以为ATGC任意碱基对。该酶切割产生三个碱基NNN的任意粘末端。利用不同粘末端的匹配可以同时连接多段DNA。此方法的缺点1、不能回避天然序列中含有该类型酶切位点的问题。2、一次性连接组装的片段数一般不宜超过10段，否则连接效率很低。3、对于大片段难于进行体外操作。
二、重组组装技术
a)基于枯草芽孢杆菌同源重组的筛选标记交换法。该方法利用到枯草芽孢杆菌当中一种同源重组。每个待组装片段需要预留同源臂，并连接到domino载体当中。Domino载体具有两种不同抗生素的形式。在重组过程中将载体需要在体外先切割成线性并连接成多段重复的线形结构。当基因组当中含有一种抗性的载体时，则下一个组装片段将被置于含有另外一种抗性的载体；该载体携带组装片段与基因组发生重组，替换基因组中原有载体和抗性，从而实现逐次组装片段。组装起来的片段可以再次通过同源重组从枯草芽孢杆菌当中取出，并用于下一次重组。此方法的缺点1、由于完全利用同源重组，当重待组装片段当中有重复序列时会出现错误重组。2、此方法重组效率并不高，很少有人实际采用。b)位点特异性重组组装法
美国专利“重组法组装大片段 DNA" (Recombination assembly of large DNA fragments, US7267984)当中描述一个环形基因组和环形质粒的系统。其基因组当中包括3 个位点，分别用于重组插入、切出载体、回收载体。此方法的缺点1、是一个顺序组装系统， 不能并行化。三、体外重组法 a)体外重组方法
该方法的原理是体外重组通过不完全PCR或者T4 DNA聚合酶或者λ外切酶分解等方法在获得末端单链伸出的DNA，然后利用碱基配对原理使伸出的单链DNA根据配对结合。 首先通过PCR引物或者基因合成的设计，使待组装的PCR片段末端带有特定的重组片段，一般为30bp ；然后用T4 DNA聚合酶处理这些PCR片段，获得末端具备单链末端伸出的产物， 然后将这些DNA利用体外重组方法组装起来。此方法的缺点1、由于涉及到PCR过程，容易引入突变。2、并不适用于组装长片段。b)改进的体外重组法
改进的体外重组方法在原理上和SLIC —致。此方法较SLIC方法有如下改进1、增加了重组片段的长度，通常使用80碱基的同源末端进行重组，少数情况下会使用长达200-250 碱基的同源末端；2、在反应体系当中增加了 DNA聚合酶和连接酶，使单链互补重组后的产物能够补平并连接为双链完整DNA。3、需要时，在反应体系当中可引入了 T5 exo外切酶以切掉单链DNA末端一段非匹配单链DNA。此方法的缺点1、由于重组所需长度的增加，对于天然片段而言，一次PCR难于获得80碱基以上的重组片段，所以该方法主要用于全化学合成基因组。而全化学合成基因组成本过高，导致应用范围有很大限制。2、组装过程中需要用较高拷贝数的载体做中间克隆，在E. coli当中不宜组装超过50Kbp的片段。相关技术
Invitrogen的美国专利US5888732保护了如下内容若一个质粒可拆分成为两部分， 其中一部分的两端是两个不互相重组的Attachment重组位点，则此质粒及其重组反应属于US5888732的保护范围。lambda red重组和切出大肠杆菌Lambda Red噬菌体中发现的另外一类重组反应由Lambda Red Alpha, Beta, Exo和大肠杆菌的RecA酶催化。该反应可以催化PCR或者酶切产生的平末端或者粘末端的线性DNA与基因组或者质粒重组。当在大肠杆菌细胞内利用归位内切酶切开染色体时，Lambda Red重组可以诱导切出DNA片段。Lambda Red重组被WO 1999029837等专利保护。线形质粒m5噬菌体及类似的噬菌体能够以线形存在于宿主细菌当中。其两端是封闭的发卡形端粒。基于N15噬菌体的质粒发表很早，按照一般专利法的规定，该线形噬菌体和质粒本身已经不能受专利保护。目前在申请中的美国专利US20090263873，申请保护基于该质粒的克隆载体。本发明中的线形单元载体和回收载体利用到了线形质粒。线性基因组大部分原核微生物都具有环形的染色体，少数天然具有线形染色体。 比如根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的染色体中有一条为线形。将附5噬菌体的端粒酶识别位点整合到大肠杆菌染色体的合适位置，并表达端粒酶，可以使大肠杆菌的染色体线形化。此结果已经公开，无专利保护此内容。

发明内容
为了克服现有DNA组装技术所存在的缺陷，本发明提出了一种多段DNA并行组装的方法。该方法通过利用单元载体置入宿主进行基因对接，然后再回收载体，解决多段DNA 组装的技术问题。本发明解决技术方案所采用的方案是
对待组装片段进行克隆，得到符合“广义单元载体”结构的单元载体； 根据单元载体的“组装职能”选出一系列含有不同待组装片段的广义单元载体，形成 “可组装队列”；
对“可组装队列“进行“队列并行组装”； 具体步骤
(1)首先，根据组装实施者的需要，将“待组装片段”克隆到“空单元载体”当中形成“单元载体”；取含有待组装片段的“单元载体”和其他“广义单元载体”构成至少一种“初始可组装队列”；然后，对“初始可组装队列”进行“队列并行组装”，直到形成的“可组装队列”中单元载体数量等于1 ；最后队列中所得的1个载体，包含按照组装实施者需要设计顺序排列的所有待组装片段的组装产物；
并且，
(2)组装若在细胞内发生，则所需的重组酶由“辅助质粒”表达；组装若在细胞外发生， 则所需的重组酶以蛋白形式直接加入；
并且，
(3)当“队列并行组装”需要时，组装过程中有“辅助质粒”、“组装宿主”、“回收载体”的辅助；
所述“广义单元载体”包括“单元载体”和“组装宿主”；
所述“单元载体”的结构特征如下“单元载体”结构具有以下2种可能性
(1)一种是含有单重构位点“单元载体”，按序列顺序依次包括左臂、左反应端、待组装片段、右反应端、右臂、拓扑重构位点、接左臂；
或者，
(2)另一种是含有双重构位点单元载体，按序列顺序依次包括固定臂、回收重构位点、左臂、左反应端、待组装片段、右反应端、右臂、拓扑重构位点、接前述固定臂；所述“待组装片段”连接到“空单元载体”当中形成含有“待组装片段”的“单元载体”；
所述“组装宿主”是“待组装片段”长度为0的“单元载体”，具有如下结构特征固定臂、回收重构位点、左臂、左反应端和右反应端有至少其一、右臂、拓扑重构位点、接前述固定臂；
所述“广义单元载体”具有如下特征
(1)“广义单元载体”的“组装职能”类型的差别在于左反应端、右反应端、拓扑重构位点、回收重构位点的差别；
并且，
(2)“广义单元载体”有至少1种类型的“组装职能”；
并且，
(3)不同种类型“组装职能”的“广义单元载体”的反应端和重构位点的选择要满足任何一种“组装职能”的“广义单元载体”，并且至少存在一种“组装职能”的“广义单元载体” 与其“互相匹配”；
并且，
(4)“广义单元载体”的“组装职能”的所有种类要满足对于任意数量待组装片段，至少存在一种“可组装队列”；
所述“回收载体”的结构特征如下
(1)“回收载体”具有回收重构位点、左反应端、右反应端、拓扑重构位点、接前述固定臂4个重组位点当中至少其中2个；
并且，
(2)“回收载体”与“匹配”的“广义单元载体”进行“载体置换”的目的产物仍然为“广义单元载体”；
所述“待组装片段”，是组装实施者需要组装的片段；“待组装片段”的DNA序列，允许是任意不参与反应端、拓扑重构位点、回收重构位点的重组的，并且不参与复制子和筛选标记的筛选的DNA序列；
所述待组装片段的“左反应端”和“右反应端”是具有发生重组能力的DNA序列；并且， 在“组装反应”中，同一个单元载体内的左反应端和右反应端不具有互相重组能力；并且，在 “组装反应”中，来自不同“组装职能”的“广义单元载体”的左反应端和右反应端重组后消失或者变为在该重组酶下没有重组活性的DNA序列；并且，“左反应端”和“右反应端”来自于空单元载体、或者来自于待组装片段；
所述“拓扑重构位点”是序列特异性重组位点，或者是端粒酶位点，或者是相互断开的 2个端粒，并且在同一 “组装反应”中具有发生重组能力，并且在同一 “组装反应”中不具有与同一载体内的反应端或回收重构位点重组的能力；并且，当拓扑重构位点是相互断开的 2个端粒时，含有拓扑重构位点的载体DNA分子在拓扑结构上为线形；
所述“回收重构位点”是在“组装反应”中具有发生重组能力的DNA序列，并且在同一 “组装反应”中不具有与同一载体内的任何反应端重组的能力，并且同一“组装反应”中不具有与同一载体内的拓扑重构位点重组的能力；
所述“固定臂”、“左臂”、“右臂”，是任意在“组装反应”中不具有与反应端、拓扑重构位点、回收重构位点重组能力的DNA序列，其中包括至少一个复制子和至少一个筛选标记；所述“置换臂”，是任意不参与反应端、拓扑重构位点、回收重构位点的重组的DNA序
列；
所述“回收载体”与“广义单元载体”的“位点匹配”具有如下3点特征
(1)“回收载体”包含的重组位点中与“广义单元载体”的回收重构位点、左反应端、右反应端、拓扑重构位点重组位点当中至少2个具有发生重组的能力；
并且，
(2)“回收载体”与“广义单元载体”发生“载体置换”之后的目的产物符合“广义单元载体”的结构特征，并且具有区别于反应前的筛选特征；
所述“回收载体”与“广义单元载体”的“载体置换”定义包括如下2个反应的
(1) “回收载体”与“广义单元载体”回收重构位点、左反应端、右反应端、拓扑重构位点 4个重组位点当中至少具有其中2个发生重组；
所述“载体置换”的目的产物是“载体置换”反应后，得到反应物当中“广义单元载体” 的“待组装片段”的、并且符合“广义单元载体”特征的载体；
所述“广义单元载体”的“互相匹配”定义为同时满足以下三个条件
(1)满足反应端匹配2个单元载体，或者至多其中2个单元载体经过“载体置换”之后， 其中一个单元载体的右反应端具有与另一个单元载体的左反应端重组的能力，或者其中一个单元载体的左反应端具有与另一个单元载体的右反应端重组的能力；上述两种情况在同一种酶催化下不同时发生；该重组定义为“反应端匹配重组”；
并且，
(2)满足重构位点匹配2个单元载体本身，或者至多其中两者单元载体经过“载体置换”之后，在同一种酶催化下，其中一个单元载体与另一个单元载体的拓扑重构位点具有重组能力，或者其中一个单元载体与另一个单元载体的拓扑重构位点同时为断开的端粒形式，或者其中一个单元载体与另一个单元载体的回收重构位点具有重组能力；上述三种情况在同一种酶催化下不同时发生；该重组定义为“重构位点匹配重组”；
并且，
(3)满足筛选特征匹配互相匹配的2个单元载体本身，或者至多其中两者单元载体经过“载体置换”之后，单元载体之间进行组装的每一步重组产物，都有区别于过反应前体的筛选特征变化；
所述“匹配单元载体对”定义为满足“互相匹配”关系的2个“广义单元载体”；
所述“组装反应”是“互相匹配”的2个“广义单元载体”之间发生的重组反应，其特征如下
(1)在“互相匹配”需要的情况下先与“回收载体”进行所需的“载体置换”，然后发生 “反应端匹配重组”和“重构位点匹配重组” 2个重组；
并且，
(2)“组装反应”产物是重组反应产物当中含有其2个“广义单元载体”前体中所包含的所有待组装片段的载体；
根据所述单元载体的结构，“组装反应”的产物，满足单元载体的定义，仍称为“单元载体”，具有继续与匹配的“广义单元载体”发生组装反应的能力；
所述“可组装队列”是由“广义单元载体”构成的队列；并且满足当队列中“广义单元载体”数量为2N或者2N+1，且N为非负整数，队列中可挑选出不超过N个互不共用“广义单元载体”的“匹配单元载体对”，这不超过N个的“匹配单元载体对”发生“组装反应”后得到的“广义单元载体”替代原队列中的这些“匹配单元载体对”，得到的队列，仍然符合“可组装队列”的条件；
所述“初始可组装队列”是一个“可组装队列”，由含有“待组装片段”的单元载体和“组装宿主”构成；并且，队列中含有“待组装片段”的“单元载体”的数量与所需组装的片段的数量一致，并且，每个“单元载体”含有一个待组装片段；并且，队列中的单元载体所含的待组装片段的顺序与组装实施者的目的组装顺序一致；
所述“队列并行组装”定义为如下过程根据前述定义，在“广义单元载体”数量为2N或者2N+1 (N为非负整数)的“可组装队列”中存在的不超过N个互不共用单元载体的“匹配单元载体对”，使这不超过N个“匹配单元载体对”同时并行进行“组装反应”，并用每个“匹配单元载体对”的“组装反应”产物或“宿主中间体”替代原“匹配单元载体对”；
广义单元载体
(1)所述“广义单元载体”的“组装职能”的所有种类进一步满足对于任意数量的“待组装片段”，至少存在一种“匹配组装队列”；
并且，
(2)通过挑选“匹配”的“广义单元载体”，使所述“初始可组装队列”满足“匹配组装队列”的要求；
并且，
(3)对满足“匹配组装队列”要求的“初始可组装队列”进行“队列并行匹配组装”；
所述“匹配组装队列”是满足以下2个条件的“可组装队列”
(1)当队列中“广义单元载体”数量为2N或者2N+1，且N为非负整数，则队列中存在N 个互不共用“广义单元载体”的“匹配单元载体对”；
并且，
(2)用前述N个“匹配单元载体对”发生“组装反应”后得到的“广义单元载体”替代原队列中的这些“匹配单元载体对”，得到的队列，仍然符合“匹配组装队列”的条件；
所述“队列并行匹配组装”定义为如下过程根据前述定义，在“广义单元载体”数量为 2N或者2N+1，且N为非负整数的“匹配组装队列”中存在的N个互不共用“广义单元载体” 的“匹配单元载体对”，使这N个“匹配单元载体对”同时并行进行“组装反应”，并用每个“匹配单元载体对”的“组装反应”产物替代原“匹配单元载体对”；
第一种筛选标记
(1)筛选标记有至少1种，每种“单元载体”的左臂或右臂之一带有筛选标记；
并且，
(2)“组装反应”发生时，在“组装宿主”所在的细胞中，“单元载体”不具有复制能力； 并且，“组装宿主”为染色体；并且，回收载体在特定辅助质粒存在时具有在组装宿主中复制的能力；
并且，
(3)“单元载体”和“组装宿主”发生“反应端匹配重组”、“重构位点匹配重组”的其中一组后，利用“单元载体”的筛选标记筛选到中间体进行筛选含有单元载体的筛选标记的中间产物；中间产物再发生“反应端匹配重组”、“重构位点匹配重组”的其中的另一组后，利用 “单元载体”所带的筛选标记的丢失筛选“组装反应”产物；
并且，
(4)“载体置换”目的产物的筛选“广义单元载体”和“回收载体”发生“载体置换”反应的2个重组的其中一个后，利用“回收载体”的筛选标记筛选到中间体；中间体再发生“载体置换”反应的2个重组的其中的另一个，利用“回收载体”在特定复制蛋白下可复制筛选到“载体置换”产物；
并且，
(5)“辅助质粒”为温度敏感性载体；并且，在每一步重组前将辅助质粒转化到宿主细胞；并且，在每一步重组后在“辅助质粒”不具有复制能力的温度下培养，将辅助质粒从宿主细胞中去除；
第二种筛选标记
(1)筛选标记有至少2种，每种“组装职能”的“单元载体”的左臂或右臂各带有一种筛选标记，且两臂所带有的筛选标记互不相同；并且，“组装反应”发生时，在“组装宿主”所在的宿主细胞中，“单元载体”不具有复制能力；并且，“组装宿主”为染色体，有至少2种不同 “组装职能”的组装宿主，每种含有一种不同的筛选标记；并且，“回收载体”在含有其复制所需的复制蛋白的“辅助质粒”存在时具有在宿主细胞中复制的能力；
(2)“单元载体”和“广义单元载体”发生“组装反应”后，禾Ij用“广义单元载体”所带的筛选标记的被“单元载体”的筛选标记替换来筛选“组装反应”产物；
(3)“广义单元载体”和“回收载体”发生“载体置换”反应的2个重组的其中一个后， 利用“回收载体”和“广义单元载体” 2个筛选标记筛选到“载体置换”产物；
第三种筛选标记
(1)筛选标记有至少3种，每种“单元载体”的左臂和右臂各带有一种筛选标记，且两臂所带有的筛选标记互不相同；
并且，
(2)“组装反应”所包含的2个重组同时进行；并且，“组装反应”的目的产物含有不同于其2个“单元载体”前前体的筛选标记组合，使该产物具有通过这种筛选标记组合从重组产物、副产物和未发生反应的单元载体的混合物种筛选出来的操作性；
并且，
(3)组装过程不需要“回收载体”和“组装宿主”；
并且，
(4)“辅助质粒”同时表达“组装反应”包含的2个反应所需的2个重组酶；
反应端、回收重构位点、拓扑重构位点
所述反应端、回收重构位点、拓扑重构位点为frt，IoxP, Lambda噬菌体的重组位 attB, attBl, attB2, attB3, attB4, attB5, attP, attPl, attP2 attP3, attP4, attP5, attL, attLl, attL2, attL3, attL4, attL5, attR, attRl, attR2, attR3, attR4, attR5，HK022噬菌体的重组位点attB, attP, attL, attR, phi80噬菌体的重组位点 attB, attP, attL, attR, P21 噬菌体的重组位点 attB, attP, attL, attR, P22 噬菌体的重组位点attB，attP, attL, attR ；所述反应端为lambda red重组所需的同源序列；端粒酶识别位点
端粒酶识别位点或端粒为原核生物的端粒酶的识别位点或端粒，包括EntercAacteria phage N15、Vibrio phage VP882、Klebsiella phage phiK02、Yersinia phage PY54 等的端粒酶识别位点；端粒也为真核生物染色体的端粒； 单元载体、组装宿主、回收载体
所述单元载体、组装宿主、回收载体为原核生物或者真核生物的质粒、也为原核生物或者真核生物的基因组；
单元载体、回收载体的转化位点
所述单元载体、回收载体当中含有接合转化位点，且组装宿主微生物具备接合转化能力时，不需要宿主细胞外的分子操作；所述单元载体、回收载体当中不含有接合转化位点， 或且宿主微生物不具备接合转化能力时，需要有宿主细胞外的分子操作； 重组位点重组酶
当在细胞外使用重组位点的重组酶时，IoxP对应Cre重组酶，frt对应FLP重组酶， Lambda噬菌体的BP重组对应Lambda Int和IHF，Lambda噬菌体的BP重组对应Lambda Int、 Xis和IHF，，=HK022噬菌体的BP重组对应HK022 Int和IHF，HK022噬菌体的BP重组对应 HK022 Int、Xis和IHF，phi80噬菌体的BP重组对应phi80 Int和IHF，phi80噬菌体的BP 重组对应phi80 Int、Xis和IHF，P21噬菌体的BP重组对应P21 Int和IHF，P21噬菌体的 BP重组对应P21 Int.Xis和IHF, P22噬菌体的BP重组对应P22 Int和IHF, P22噬菌体的 BP重组对应P22 Int. Xis和IHF，组装过程中的重组反应具有在细胞外进行的能力； 其中
两个线形载体重组后的单侧端粒发生交换，视为在端粒位点发生了一次重组，因为此过程等效于环形载体的两次重组；例如线形载体A和B端粒标记为T，左右两个端粒分别用 L和R区分，在载体中X和Y之间发生重组，如下
Tl _v _v _ Te -ι- Tl —Y —V — Te λ Tl —Y —V — Te + Tl _γ _γ _ Te
1 A ΛΑ iA 1 A 十1 B ΛΒ liB 1Be 1 A ΛΑ iB 1 B 十1 B ΛΒ liA 1A
重组之后，每个载体的X-Y组合发生交换，同时末端端粒组合也发生交换。积极效果本发明选择利用环形或线形单元载体置入到环形宿主或线形宿主，形成基因载体，再通过回收环形或线形载体，得到重组后的DNA遗传物质。其特点是，能够实现多段DNA的并行同时操作，从而提高DNA组装形成新的DNA结构的效率，并且防止DNA污染和歧化，保证组装后DNA的质量，使之达到设计目的。适宜在遗传工程领域基因重组获得新的生物体中应用。


图1为组装的总流程图。图2为队列并行组装示意图。图3为第一种拓扑异构位点重组示意图。图4为第二种拓扑异构位点重组示意图。图5为第三种拓扑异构位点重组示意图。图中，l.DNA，2.广义单元载体，3.反应端，4.拓扑重构位点。
具体实施例方式据图1所示，DNAl经过并行组装后，成为设定结构的DNA。据图2所示，其中上方为组装前的队列，下方为组装后的队列。队列并行组装时， 匹配两个广义单元载体2发生“组装反应”，得到的产物载体具有来自于两个反应物的待组装片段，并替换反应物在队列中的位置，形成新的队列。此过程不断重复，直到队列中广义单元载体数量为1。据图3所示，4为拓扑重构位点，分为左右反应端3，DNA-I和DNA-2表示待组装片段，双向箭头标出了两个组装反应发生的对应位点，线形载体末端的圆形头部表示端粒。图中左侧表示利用线形载体端粒位点作为拓扑重构位点时的组装反应，可以看到产物得到了分别来自两个反应载体的端粒，因此视为端粒发生了重组。图中中间部分表示不利用线形载体端粒作为拓扑重构位点的情形，此时端粒没有发生交换，仅发生了箭头标出的两个重组反应。图中右侧是环形质粒的组装反应，发生了箭头标出的两个重组。以“回收重构位点”为“位点匹配重组”的组装反应则相当于将该图中拓扑重构位点的反应换为回收重构位点的反应。本发明的描述中对“广义单元载体”系统的结构和不同“组装职能”的关系做了描述。根据结构定义和相互关系，可以得到广义单元载体和回收载体的可行具体形式。以下给出了针对单个筛选标记、双筛选标记、三筛选标记系统的具体单元载体系统、组装过程的具有一般代表意义的典型细化方案，更多筛选标记的系统具有类似的特征。a)环形单元载体互组装
(1)环形空单元载体互组装系统的设计
拓扑重构位点_载体骨架_筛选标记AS-左反应端AL-待组装片段克隆位点-右反应端BR-筛选标记BS-(接开头)；
拓扑重构位点_载体骨架_筛选标记AS-左反应端AL-待组装片段克隆位点-右反应端CR-筛选标记CS-(接开头)；
拓扑重构位点_载体骨架_筛选标记BS-左反应端BL-待组装片段克隆位点-右反应端AR-筛选标记AS-(接开头)；
拓扑重构位点_载体骨架_筛选标记BS-左反应端BL-待组装片段克隆位点-右反应端CR-筛选标记CS-(接开头)；
拓扑重构位点_载体骨架_筛选标记CS-左反应端CL-待组装片段克隆位点-右反应端AR-筛选标记AS-(接开头)；
拓扑重构位点_载体骨架_筛选标记CS-左反应端CL-待组装片段克隆位点-右反应端BR-筛选标记BS-(接开头)；
其中复制子可以置于前臂或者后臂。(2)环形单元载体互组装系统的组装 ①初始材料
每个DNA片段可以都构建6个亚版本的单元载体。但通常而言，对于既定顺序的组装， 仅使用其中3个亚版本即可。不妨取如下8个构成“初始可组装队列”，并且满足“匹配组装队列”要求
AlB: frt-0riS-0riT-AS-AL-DNAl-BR-BS-(接开头)；B2Cfrt--OriS--OriT--BS--BL--DNA2--CR--CS-(接开头)C3Afrt--OriS--OriT--CS--CL--DNA3--AR--AS-(接开头)A4Bfrt--OriS--OriT--AS--AL--DNA4--BR--BS-(接开头)B5Cfrt--OriS--OriT--BS--BL--DNA5--CR--CS-(接开头)C6Afrt--OriS--OriT--CS--CL--DNA6--AR--AS-(接开头)A7Bfrt--OriS--OriT--AS--AL--DNA7--BR--BS-(接开头)B8Cfrt--OriS--OriT--BS--BL--DNA8--CR--CS-(接开头)
其中左反应端为AL、BL、CL ；右反应端为AR、BR、CR ；拓扑重构位点为frt。
②第一轮组装 AlB与B2C反应 反应前
AlB: frt-0riS-0riT-AS-AL-DNAl-BR-BS-(接开头)； B2C: frt-0riS-0riT-BS-BL-DNA2-CR-CS-(接开头)；
接合转化使其中一个载体转移到另一个载体的宿主当中，BR和BL反应，同时frt与 frt反应，通过筛选标记AS和CS筛选得到
A12C: frt-0riS-0riT-AS-AL-DNAl-BB-DNA2-CR-CS-(接开头)； C3A与A4B反应 反应前
C3A: frt-0riS-0riT-CS-CL-DNA3-AR-AS-(接开头)； A4B: frt-0riS-0riT-AS-AL-DNA4-BR-BS-(接开头)；
接合转化使其中一个载体转移到另一个载体的宿主当中，AR和AL反应，同时frt与 frt反应，通过筛选标记CS和BS筛选得到
C34B: frt-0riS-0riT-CS-CL-DNA3-AB-DNA4-BR-BS-(接开头)； B5C与C6A反应 反应前
B5C: frt-0riS-0riT-BS-BL-DNA5-CR-CS-(接开头)； C6A: frt-0riS-0riT-CS-CL-DNA6-AR-AS-(接开头)；
接合转化使其中一个载体转移到另一个载体的宿主当中，CR和CL反应，同时frt与 frt反应，通过筛选标记BS和AS筛选得到
B56A: frt-0riS-0riT-BS-BL-DNA5-CB-DNA6-AR-AS-(接开头)； A7B与B8C反应 反应前
A7B: frt-0riS-0riT-AS-AL-DNA7-BR-BS-(接开头)； B8C: frt-0riS-0riT-BS-BL-DNA8-CR-CS-(接开头)；
接合转化使其中一个载体转移到另一个载体的宿主当中，BR和BL反应，同时frt与 frt反应，通过筛选标记AS和CS筛选得到
A78C: frt-0riS-0riT-AS-AL-DNA7-BB-DNA8-CR-CS-(接开头)； ③第二轮组装 A12C与C34B反应反应前
A12C: frt-0riS-0riT-AS-AL-DNAl-BB-DNA2-CR-CS-(接开头)； C34B: frt-0riS-0riT-CS-CL-DNA3-AB-DNA4-BR-BS-(接开头)； 接合转化使其中一个载体转移到另一个载体的宿主当中，CR和CL反应，同时frt与 frt反应，通过筛选标记AS和BS筛选得到
A1234B: frt-OriS-OriT-AS-AL-DNAl-BB-DNA2-CB-DNA3-AB-DNA4-BR-BS-(接开头)； B56A与A78C反应 反应前
B56A: frt-0riS-0riT-BS-BL-DNA5-CB-DNA6-AR-AS-(接开头)； A78C: frt-0riS-0riT-AS-AL-DNA7-BB-DNA8-CR-CS-(接开头)； 接合转化使其中一个载体转移到另一个载体的宿主当中，AR和AL反应，同时frt与 frt反应，通过筛选标记BS和CS筛选得到
B5678C: frt-0riS-0riT-BS-BL-DNA5-CB-DNA6-AB-DNA7-BB-DNA8-CR-CS-(接开头)； ④第三轮组装 A1234B 与 B5678C 反应 反应前
A1234B frt-OriS-OriT-AS-AL-DNA1-BB-DNA2-CB-DNA3-AB-DNA4-BR-BS-(接开头) B5678C: frt-0riS-0riT-BS-BL-DNA5-CB-DNA6-AB-DNA7-BB-DNA8-CR-CS-(接开头)； 接合转化使其中一个载体转移到另一个载体的宿主当中，BR和BL反应，同时frt与 frt反应，通过筛选标记AS和CS筛选得到
A12345678C: fr t-0r i S-Or i T-AS-AL-DNA1-BB-DNA2-CB-DNA3-AB-DNA4-BB-DNA5-CB-D NA6-AB-DNA7-BB-DNA8-CR-CS-(接开头)； b)线形单元载体互组装系统
(1)线形单元载体互组装系统的设计
端粒_载体骨架_筛选标记AS-左反应端AL-待组装片段DNA-右反应端BR-筛选标记BS-端粒；
端粒_载体骨架_筛选标记AS-左反应端AL-待组装片段克隆位点-右反应端CR-筛选标记CS-端粒；
端粒_载体骨架_筛选标记BS-左反应端BL-待组装片段克隆位点-右反应端AR-筛选标记AS-端粒；
端粒_载体骨架_筛选标记BS-左反应端BL-待组装片段克隆位点-右反应端CR-筛选标记CS-端粒；
端粒_载体骨架_筛选标记CS-左反应端CL-待组装片段克隆位点-右反应端AR-筛选标记AS-端粒；
端粒_载体骨架_筛选标记CS-左反应端CL-待组装片段克隆位点-右反应端BR-筛选标记BS-端粒；
(2)线形单元载体互组装系统的组装 ①初始材料
每个DNA片段都构建6个亚版本的单元载体。但通常而言，对于既定顺序的组装，仅使用其中3个亚版本即可。不妨取如下8个构成“初始可组装队列”，并且满足“匹配组装队
要求AlB端粒-OriL--OriT--AS--AL--DNAl--BR--BS-端粒B2C端粒-OriL--OriT--BS--BL--DNA2--CR--CS-端粒C3A端粒-OriL--OriT--CS--CL--DNA3--AR--AS-端粒A4B端粒-OriL--OriT--AS--AL--DNA4--BR--BS-端粒B5C端粒-OriL--OriT--BS--BL--DNA5--CR--CS-端粒C6A端粒-OriL--OriT--CS--CL--DNA6--AR--AS-端粒A7B端粒-OriL--OriT--AS--AL--DNA7--BR--BS-端粒B8C端粒-OriL--OriT--BS--BL--DNA8--CR--CS-端粒
其中左反应端为AL、BL、CL ；右反应端为AR、BR、CR ；拓扑重构位点为frt。
②第一轮组装 AlB与B2C反应 反应前
AlB:端粒-OriL-OriT-AS-AL-DNAl-BR-BS-端粒； B2C:端粒-OriL-OriT-BS-BL-DNA2-CR-CS-端粒；
接合转化使其中一个载体转移到另一个载体的宿主当中，BR和BL反应，同时frt与 frt反应，通过筛选标记AS和CS筛选得到
A12C:端粒-OriL-OriT-AS-AL-DNA1-BB-DNA2-CR-CS-端粒； C3A与A4B反应 反应前
C3A:端粒-OriL-Or iT-CS-CL-DNA3-AR-AS-端粒； A4B:端粒-OriL-Or iT-AS-AL-DNA4-BR-BS-端粒；
接合转化使其中一个载体转移到另一个载体的宿主当中，AR和AL反应，同时frt与 frt反应，通过筛选标记CS和BS筛选得到
C34B:端粒-OriL-Or iT-CS-CL-DNA3-AB-DNA4-BR-BS-端粒； B5C与C6A反应 反应前
B5C:端粒-OriL-OriT-BS-BL-DNA5-CR-CS-端粒； C6A:端粒-OriL-OriT-CS-CL-DNA6-AR-AS-端粒；
接合转化使其中一个载体转移到另一个载体的宿主当中，CR和CL反应，同时frt与 frt反应，通过筛选标记BS和AS筛选得到
B56A:端粒-OriL-Or iT-BS-BL-DNA5-CB-DNA6-AR-AS-端粒； A7B与B8C反应 反应前
A7B:端粒-OriL-Or iT-AS-AL-DNA7-BR-BS-端粒； B8C:端粒-OriL-Or iT-BS-BL-DNA8-CR-CS-端粒；
接合转化使其中一个载体转移到另一个载体的宿主当中，BR和BL反应，同时frt与 frt反应，通过筛选标记AS和CS筛选得到A78C:端粒-OriL-OriT-AS-AL-DNA7-BB-DNA8-CR-CS-端粒；
③第二轮组装 A12C与C34B反应 反应前
A12C:端粒-OriL-OriT-AS-AL-DNA1-BB-DNA2-CR-CS-端粒； C34B:端粒-OriL-OriT-CS-CL-DNA3-AB-DNA4-BR-BS-端粒； 接合转化使其中一个载体转移到另一个载体的宿主当中，CR和CL反应，同时frt与 frt反应，通过筛选标记AS和BS筛选得到
A1234B:端粒-OriL-OriT-AS-AL-DNA1-BB-DNA2-CB-DNA3- AB-DNA4-BR-BS-端粒； B56A与A78C反应 反应前
B56A:端粒-OriL-Or iT-BS-BL-DNA5-CB-DNA6-AR-AS-端粒； A78C:端粒-OriL-OriT-AS-AL-DNA7-BB-DNA8-CR-CS-端粒； 接合转化使其中一个载体转移到另一个载体的宿主当中，AR和AL反应，同时frt与 frt反应，通过筛选标记BS和CS筛选得到
B5678C:端粒-OriL-OriT-BS-BL-DNA5-CB-DNA6-AB-DNA7- BB-DNA8-CR-CS-端粒；
④第三轮组装 A1234B 与 B5678C 反应 反应前
A1234B:端粒-OriL-OriT-AS-AL-DNA1-BB-DNA2-CB-DNA3- AB-DNA4-BR-BS-端粒； B5678C:端粒-OriL-OriT-BS-BL-DNA5-CB-DNA6-AB-DNA7- BB-DNA8-CR-CS-端粒； 接合转化使其中一个载体转移到另一个载体的宿主当中，BR和BL反应，同时frt与 frt反应，通过筛选标记AS和CS筛选得到
A12345678C:端粒-OriL-OriT-AS-AL-DNAl-BB-DNA2_CB- DNA3-AB-DNA4-BB-DNA5-CB -DNA6-AB-DNA7-BB-DNA8-CR- CS-端粒； c)环形单元载体的宿主转移回收组装 (1)单元载体的设计
环形单元载体包括至少两个载体，在组装过程中交替使用。环形单元载体按照DNA碱基排列顺序的结构为
环形单元载体A 拓扑重构位点IR、载体骨架、左反应端AR、待组装片段的克隆位点、右反应端BL。环形单元载体B 拓扑重构位点IP、载体骨架、左反应端BR、待组装片段的克隆位点、右反应端AL。载体骨架包含复制子、筛选基因。可以包含结合转化位点或其他不参与重组反应的序列。其排布顺序不影响功能。单元载体在组装宿主当中不能复制。其中AL和AR重组得到AB和AP，BL和BR重组得到BB和BP。(2)重组宿主的设计
环形重组宿主当从环形单元载体A开始组装，环形重组宿主当中按顺序碱基依次含有如下位点回收载体插入位点EL、切出位点AL、组装位点IL。
当从环形单元载体B开始组装，环形重组宿主当中按顺序碱基依次含有如下位点回收载体插入位点EL、切出位点BL、组装位点IB。(3)回收载体的设计
环形回收载体当回收前组装宿主当中含有AL，则对应的回收载体具有如下结构回收载体插入位点ER-组装位点IR-载体骨架-切出位点BR。当回收前组装宿主当中含有BL，则对应的回收载体具有如下结构回收载体插入位点ER-组装位点IP-载体骨架-切出位点AR载体骨架包含复制子、筛选基因。可以包含结合转化位点或其他不参与重组反应的序列。其排布顺序通常不影响功能。单元载体在组装宿主当中不能复制。(4)环形单元载体的宿主转移回收组装过程 ①初始材料
先将待组装DNA克隆到单元载体当中得到“初始可组装队列”如下 组装宿主染色体-EL-AL-IL-染色体。其中回收重构位点为EL ；右反应端为AL ；拓扑重构位点为IL。C2R :IR_载体骨架-AR-DNA2-BL-接开头。其中左反应端为AR ；右反应端为BL ；拓扑重构位点为顶。ClP :IP-载体骨架-BR-DNAl-AL-接开头。其中左反应端为BR ；右反应端为AL ；拓扑重构位点为IP。回收载体B =ER-IR-载体骨架-BR-接开头。其中回收重构位点为ER ；拓扑重构位点为IR0②组装过程
组装宿主初始状态
组装宿主染色体-EL-AL-IL-染色体；组装C2R，IL和顶重组 组装宿主染色体-EL-AL- IP-载体骨架-AR-DNA2-BL-IB-染色体；切出载体骨架，AL 和AR重组
组装宿主为染色体-EL-AB-DNA2-BL-IB-染色体；组装C1P，IB和IP重组 组装宿主染色-EL-AB-DNA2-BL-IR-载体骨架-BR-DNAI-AL-1L-染色体，切出载体骨架，BL和BR重组
组装宿主染色体-EL-AB-DNA2-BB-DNA1-AL-IL-染色体；使用回收载体使其变为质粒形式，EL和ER重组
组装宿主染色体-EP-IR-载体骨架-BR-DNA2-BB-DNA1-AL-IL-染色体；将组装片段切出回收，顶和IL重组
组装宿主染色体-EP-IB-染色体。回收的载体IP-载体骨架-BR-EB-AB-DNA2-BB-DNAI-AL-接开头
回收到的载体具有的结构“IP-载体骨架-BR-……-AL-接开头”与单元载体一致，可用于进一步组装。④并行组装
如果有N段DNA待组装，先将DNA克隆到单元载体，将按设计的前后相接关系的DNA单元载体每2-3段划分为一组，每组用顺次组装并回收，这些组可以同时操作，实现并行化。在下一轮中，将按设计的前后相接关系的回收的载体每2-3段划分为一组，每组用顺次组装并回收，这些组可以同时操作，实现并行化。重复以上过程，直到所有需要组装的DNA都按照设计的顺序组装到一起。d)线形单元载体的宿主转移回收组装
(1)单元载体的设计利用线形单元载体。线形单元载体包括至少两个载体，在组装过程中交替使用。线形单元载体可以有线形和环形，在实际发生重组时，底物为线性。线形单元载体按照DNA碱基排列顺序的结构为线形单元载体A线形形式载体左臂、左反应端AR、待组装片段的克隆位点、右反应端BL、筛选标记AS、载体右臂。线形单元载体B线形形式载体左臂、左反应端BR、待组装片段的克隆位点、后反应端AL、筛选标记BS、载体右臂。载体左臂包含端粒、复制原点。单元载体在组装宿主当中不能复制。载体右臂包含端粒。线形单元载体A的环形形式端粒酶识别位点、载体骨架、左反应端AR、待组装片段的克隆位点、右反应端BL、筛选标记AS。线形单元载体B的环形形式端粒酶识别位点、载体骨架、左反应端BR、待组装片段的克隆位点、右反应端AL、筛选标记BS。载体骨架包含复制子、筛选基因。可以包含结合转化位点或其他不参与重组反应的序列。其排布顺序通常不影响功能。单元载体在组装宿主当中不能复制。对于线形载体，端粒为拓扑重构位点。线形重组宿主当从线形单元载体A开始组装，线形重组宿主的接近端粒末端处从内侧到端粒依次具有如下位点回收位点EL，插入位点AR。当从线形单元载体B开始组装，线形重组宿主的接近端粒末端处从内侧到端粒依次具有如下位点回收位点EL，插入位点BR。线形回收载体当回收前组装宿主含有AL时，则对应的回收载体具有如下结构 端粒、复制子、AR、回收载体插入位点er、筛选标记AS、端粒。当回收前组装宿主含有BL时，则对应的回收载体具有如下结构端粒、复制子、 BR、回收载体插入位点ER、筛选标记BS、端粒。(4)线形单元载体的宿主转移回收组装过程 ①初始材料
组装宿主染色体-EL-AL-BS-端粒；其中回收重构位点为EL ；右反应端为AL ；拓扑重构位点为端粒。L2A 端粒-复制原点-AR-DNA2-BL-AS-端粒；其中左反应端为AR ；右反应端为BL ； 拓扑重构位点为端粒。LlB 端粒-复制原点-BR-DNA1-AL-BS-端粒；其中左反应端为BR ；右反应端为AL ； 拓扑重构位点为端粒。回收载体B 端粒-复制原点-BR-ER-BS-复制起始蛋白基因-端粒。其中回收重构位点为ER ；拓扑重构位点为端粒。②顺序组装 组装宿主初始状态组装宿主染色体-EL-AL-BS-端粒；组装L2A，IL和顶重组。用AS筛选组装宿主染色体-EL-AB-DNA2-BL-AS-端粒；组装LIB、IL和顶重组，用BS筛选 组装宿主染色体-EL-AB-DNA2-BB-DNAI-AL-BS-端粒；回收载体B与基因组交换，EL 和ER重组
组装宿主染色体-EP-AS-复制起始蛋白基因-端粒； 回收载体端粒-复制原点-BR-EB-AB-DNA2-BB-DNAI-AL-BS-端粒 回收到的载体具有的结构“端粒-复制原点-BR-……-AL-BS-端粒”与单元载体一致， 可用于进一步组装。④并行组装
如果有N段DNA待组装，先将DNA克隆到单元载体，将按设计的前后相接关系的DNA单元载体每2-3段划分为一组，每组用顺次组装并回收，这些组可以同时操作，实现并行化。 在下一轮中，将按设计的前后相接关系的回收的载体每2-3段划分为一组，每组用顺次组装并回收，这些组可以同时操作，实现并行化。重复以上过程，直到所有需要组装的DNA都按照设计的顺序组装到一起。由于部分基因序列长度较大，用NCBI数据库中的引用代替。例如 “ [AY048744. 1 240-23] ”表示 NCBI 的 nucleotide 数据库中编号 AY048744. 1 的序列中(由于MO大于23，所以是反向互补序列)23碱基到240碱基的反向互补序列。 “[AY048744. 1 23-240] ”表示 NCBI 的 nucleotide 数据库中编号 AY048744. 1 序列中(由于 23小于240，是正向序列)23碱基到240碱基序列。基因合成所用的载体，合成的基因保存于该载体当中
pQLV:接片段下游 TAGGAGAGACCGTGCAGGTACCCCGCGTTGTCTAGAAGCTTCCTATTGG GCTTGCTATCCCTCCATAGCAGAAAGTCAAAAGCCTCCGACCGGAGGCTTTTGACTATTACTCAACAGGT TTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACG[EF196094. 1:533-1581][JF313343. 1 1950-2222] AATACCGCGG[JF796098. 11967-2136]C[JF796098. 12138-2292]CGTGTTATCACTCATGGTTATG GCAGCACTA[JF796098. 12324-2798]TACCGAAGAAAGGCCCACCCGTGAAGGTGAGCCAGTGAGTTGATTG CGTTCGCAGAATTGGGAATCTGCAGGGTACCTGATCCTCTAGAGTCGACCTGCACAGGTCTCTAAG 接片段上游。实施例1 利用环形组装系统组装luxA、luxB、luxC、luxD、luxE。原始质粒pAH57，表达Lambda Int Xis。pAH69，表达 HK022 Int。pAH129， 表达 Phi80 Int Xis。pAH83，表达 HK022 Int Xis。pAH70，包含 HK022 attP。来源于 CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)。pCMR，表达 HK022_Lambda Chemira Int Xis。 pAH69Pir，表达 HK022 Int 禾Π Pir 基因。pCMRPir，表达 HK022_Lambda Chemira Int Xis 和 Pir 基因。pAH129E,用 HindIII 破坏 pAH129 中的 lambda Cl 得到。构建质粒
(1)构建辅助质粒 合成引物
EVFACCTGACCGCTATCCCTGA EVRGCCCTTCAATCGCCAGA IHFTTGACTATTTTACCTCTGGCGG IHR:TCCGACTTATGCCCGAGAAGACGTTGIIFCAACGTCTTCTCGGGCATAAGTCGGA IIR:AATAACATGTAGCTTGGCATTGCTTATCAA 合成基因
plpir:ACTAGTTTGAATTGGTCACGACTTTGCGAAGCAAAGTCTAGTGAGTATACTCAAGCATTGAGTGGA TCGATGAGCTCAGGAGGTAATTATAATGCGTCTGAAAGTTATGATGGACGTTAACAAAAAAACCAAAATCCGTCACC GTAACGAACTGAACCACACCCTGGCGCAGCTGCCGCTGCCGGCGAAACGTGTTATGTACATGGCGCTGGCGCTGATC GACTCTAAAGAACCGCTGGAACGTGGTCGTGTTTTCAAAATCCGTGCGGAAGACCTGGCGGCGCTGGCGAAAATCAC CCCGTCTCTGGCGTACCGTCAGCTGAAAGAAGGTGGTAAACTGCTGGGTGCGTCTAAAATCTCTCTGCGTGGTGACG ACATCATCGCGCTGGCGAAAGAACTGAACCTGCTGTCTACCGCGAAAAACTCTTCTGAAGAACTGGACCTGAACATC ATCGAATGGATCGCGTACTCTCCGGACGAAGGTTACCTGTCTCTGAAATTCACCCGTACCATCGAACCGTACATCTC TTCTCTGATCGGTAAAAAAAACAAATTCACCACCCAGCTGCTGACCGCGTCTCTGCGTCTGTCTTCTCAGTACTCTT CTTCTCTGTACCAGCTGATCCGTAAACACTACTCTAACTTCAAAAAAAAAAACTACTTCATCATCTCTGTTGACGAA CTGAAAGAAGAACTGATCGCGTACACCTTCGACAAAGACGGTAACATCGAATACAAATACCCGGACTTCCCGATCTT CAAACGTGACGTTCTGAACAAAGCGATCGCGGAAATCAAAAAAAAAACCGAAATCTCTTTCGTTGGTTTCACCGTTC ACGAAAAAGAAGGTCGTAAAATCTCTAAACTGAAATTTGAATTTGTGGTGGATGAAGATGAATTTTCTGGTGACAAA GACGACGAAGCGTTCTTCATGAACCTGTCTGAAGCGGACGCGGCGTTCCTGAAAGTTTTCAACGAAACCGTTCCGCC GAAAAAAGCGAAAGGTTAGGAGCTCTCTAGAAACAAGCTT 实验步骤
构建pAH129E 用HindIII对pAHU9作酶切，用溶液法回收酶切产物，用T4 DNA连接酶对回收产物进行连接、转化到E. coli DH5 α制成的感受态中，将转化产物涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，在30°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，在30°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒用引物EVF和EVR 进行PCR验证筛选其中能够产生248bp片段的，并测序验证，验证正确的标记为pAH129E。准备PCR 以pAH129E为模板用引物EVF和EVR进行PCR， 准备pAH83
构建pCMR 以pAH57为模板用引物IIF和UR进行PCR，产物标记为rl。以pAH83为模板用引物IHF和IHR进行PCR，产物标记为rH。以rH和rl为模板用引物IHF和UR进行 PCR，用限制内切酶EcoRI和PciI对PCR产物作酶切，用溶液法回收酶切产物，标记为cIH。 用限制内切酶NcoI和EcoRI对pAH83作酶切，并加入CIAP去磷酸化处理，用溶液法回收酶切产物，标记为cAH83。用T4 DNA连接酶对cAH83和cIH进行连接，将连接产物电转化到E. coli DH5a制成的感受态中，将转化产物涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，在30°C 培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，在30°C 培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为pCMR。准备cPir 用限制内切酶EcoRI和HindIII对plpir作酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中1123bp的片段，标记为cPir。构建pCMRPir 用限制内切酶EcoRI和HindIII对pCMR作酶切，并加入CIAP去磷酸化处理，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中4588bp的片段，标记为cCMR。用T4 DNA连接酶对cPir和cCMR进行连接，将连接产物电转化到E. coli DH5 α制成的感受态中，将转化产物涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，在30°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，在30°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为pCMRPir。构建pAH69Pir 用限制内切酶EcoRI和HindIII对pAH69作酶切，并加入CIAP去磷酸化处理，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中4371bp的片段，标记为c69。用T4 DNA连接酶对cPir和c69进行连接，将连接产物电转化到E. coli DH5 α制成的感受态中，将转化产物涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，在30°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，在30°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为pAH69Pir。(2)构建单元载体 合成引物
hkpFGGTACCATAAATAGCCTGAAAGGCGCTGCTAATGCTCTGTCTCAGGTC
hkpRGTCGACATAATTACACTTCGTGATGGGACAAAATTGAAATCG
aplFGGTACCATAAATAGCCTGAAAGGCGAACACGTTTCAGTGAAACCATTTAAGAAAG
aplR:GTCGACATAATTACACTTCGTGGGTGAATCACGACAAAGCGTATCAAAAAC
vccFGGTACCATAAATAGCCTGAAAGGCCCTGCCACTCATCGCAGTACTGTTG
vccR:GTCGACATAATTACACTTCGTGATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATAC
cInFATAAGGTACCAGTCGACGCCGTCGAGGCCGATGC
cInRATATTTACACTTCGTGGGCCATGCTGGCGTCCG
aprFGGTACCATAAATAGCCTGAAAGGCACATTTTTGTTTTTGGGTACACA
aprRGTCGACATAATTACACTTCGTGAATATTGAATCTCTATTCAGAACACTTT
KNFATAAGTCGACAAAGCCAGTCCGCAGAAACG
KNRATAAGAATTCCCCGCTCAGAAGAACTCGTC
PUCFATAACAATTGCTTCGCCCACCCCAAAAGGATCTAG
PUCRAAAGTCGACAAGGAGGTACCACGGTTATCCACAGAATCAGGG
tesFCCTTTTTACGGTTCCTGGC
tesR:TGTCCAGATAGCCCAGTAGC
合成基因
attRHK022:GGTACCATAAATAGCCTGAAAGGCTCAGGTCACTAATACTATCTAAGTAGTTGATTCATAGT GACTGGATATGTTGCGTTTTGTCGCATTATGTAGTCTATCATTTAACCACAGATTAGTGTAATGCGATGATTTTTAA GTGATTAATGTTATTTTGTCATCCTTTAGGTGAAAAAGGTTGAGTCGCAAAGCGGCACGAAGTGTAATTATGTCGAC attLl:GGTACCATAAATAGCCTGAAAGGCCAAATAATGATTTTATTTTGACTGATAGTGACCTGTTCGTTG CAACAAATTGATAAGCAATGCTTTTTTATAATGCCAACTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCACGAAGTGTAATTATGTC GAC
attRl:GGTACCATAAATAGCCTGAAAGGCACAAGTTTGTACAAAAAAGCTGAACGAGAAACGTAAAATGAT ATAAATATCAATATATTAAATTAGATTTTGCATAAAAAACAGACTACATAATACTGTAAAACACAACATATCCAGTC ACTATGCACGAAGTGTAATTATGTCGAC
attR2:GGTACCATAAATAGCCTGAAAGGCACCACTTTGTACAAGAAAGCTGAACGAGAAACGTAAAATGAT ATAAATATCAATATATTAAATTAGATTTTGCATAAAAAACAGACTACATAATACTGTAAAACACAACATATCCAGTC ACTATGCACGAAGTGTAATTATGTCGACattL2:GGTACCATAAATAGCCTGAAAGGCCAAATAATGATTTTATTTTGACTGATAGTGACCTGTTCGTTG CAACAAATTGATAAGCAATGCTTTCTTATAATGCCAACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCACGAAGTGTAATTATGTC GAC
phi80attR:ACATTTTTGTTTTTGGGTACACAAAAGTGTACACAAAGTTGCCCACTCAAAGCTACACGCAA TGTAACACTAGTTCGCAGAGTGTTATGGTTTACATCCTTGAAAGCCTGCTGGATAAGGGTTTAGCGTAACAGAACGT TTTTACGCGGAATTGTTCGTAATATGCCAAATGACAATTTAAGAAAGTGTTCTGAATAGAGATTCAATATT phi80attLGAACACGTTTCAGTGAAACC[AY048738. 1572-358]
Kan0ri:GGTACCATAAATAGCCTGAAAGGC[AY048744. 1:1271-110] CTCGAG[AY048744. 12104-1666]CACGAAGTGTAATTATGTCGAC 实验步骤
构建pUCVHK022P 以pAH70为模板用弓丨物hkpF和hkpR进行PCR，用限制内切酶KpnI 和Mil对PCR产物作酶切，用溶液法回收酶切产物，标记为CHK022P。用T4 DNA连接酶对 cUCV和CHK022P进行连接，将连接产物转化到E. coli DH5 α制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为pUCVHK022P。准备cUCVHK022P 用限制内切酶DraIII和MlI对pUCVHK022P作酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中介于IOOObp和3600bp之间的DNA片段，标记为cUCVHK022P。构建pUCVHK022PXLl 用限制内切酶BglI和Mil对λ Ll作酶切，用溶液法回收酶切产物，标记为c λ Li。用"Γ4 DNA连接酶对CUCVHK022P和cXLl进行连接，将连接产物转化到E. coli DH5ci制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有卡那霉素的LB 琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为 PUCVHK022PA Ll0准备PCR 以pUCVHK022P λ Ll为模板用引物tesF和tesR进行PCR，
构建pUCV 以pK18mobSacB为模板用引物KNF和KNR进行PCR，用限制内切酶Mil和 EcoRI对PCR产物作酶切，用溶液法回收酶切产物，标记为dKMS。以pUC18为模板用引物 PUCF和PUCR进行PCR，用限制内切酶Mil和MfeI对PCR产物作酶切，并加入CIAP去磷酸化处理，用溶液法回收酶切产物，标记为dUC。用T4 DNA连接酶对dUC和dKMS进行连接， 将连接产物转化到E. coli DH5 α制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有卡那霉素的LB 液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为 pUCV。准备cUCV 用限制内切酶KpnI和MlI对pUCV作酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中1921bp的片段，标记为cUCV。构建pUCV080L:以Φ80 为模板用引物aplF和aplR进行PCR，用限制内切酶 KpnI和Mil对PCR产物作酶切，用溶液法回收酶切产物，标记为c080L。用T4 DNA连接酶对cUCV和c080L进行连接，将连接产物转化到E. coli DH5 α制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为pUCV0 80L。构建pUCV0 80LChlr 用限制内切酶DraIII和SalI对pUCV080L作酶切，并加入CIAP去磷酸化处理，用溶液法回收酶切产物，标记为cUCVOSOL。以pKD3为模板用引物 vccF和vccR进行PCR，用限制内切酶BglI和MlI对PCR产物作酶切，用溶液法回收酶切产物，标记为cChlr。用T4 DNA连接酶对cChlr和cUCV0 80L进行连接，将连接产物转化到 E. coli DH5 α制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有卡那霉素的LB琼脂平板上， 在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，在 37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为pUCVOSOLChlr。构建TARGET 用限制内切酶BglI和DraI11对PCR产物作酶切，用溶液法回收酶切产物,标记为CHK022P λ LlBD。用限制内切酶BglI和DraIII对pUCV。80LChlr作酶切，并加入CIAP去磷酸化处理，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中介于IOOObp和1950bp之间的 DNA片段，用T4 DNA连接酶对分离产物和cHK022P λ LlBD进行连接，将连接产物转化到Ε. coli S17-1 Pir制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有氯霉素的LB琼脂平板上，在 37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有氯霉素的LB液体培养基中，在37°C 培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为TARGET。准备cKanOri 用限制内切酶BglI和Mil对KanOri作酶切，用溶液法回收酶切产物，标记为cKanOri。构建pUCVX R2 用限制内切酶KpnI和Mil对λ R2作酶切，用溶液法回收酶切产物，标记为cXR2。用Τ4 DNA连接酶对cUCV和c λ R2进行连接，将连接产物转化到E. coli DH5 α制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为PUCV λ R2。构建pUCVAR2Kan0ri 用限制内切酶DraIII和SalI对pUCV λ R2作酶切，并加入CIAP去磷酸化处理，用溶液法回收酶切产物，标记为CUCVXR2。用Τ4 DNA连接酶对 cUCV λ R2和cKanOri进行连接，将连接产物转化到Ε. coli DH5 α制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为PUCV λ R2Kan0ri。准备cUCV λ R2Kan0ri :用限制内切酶 DraI 11 和 Sal I 对 pUCV λ R2Kan0ri 作酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中介于IOOObp和4950bp之间的DNA片段，标记为 cUCVA R2Kan0rio 构建pUCVPreUnitP 用限制内切酶BglI和SalI对PCR产物作酶切，用溶液法回收酶切产物，标记为 CHK022P λ LlBS0 用 Τ4 DNA 连接酶对 cHK022P λ LlBS 和 cUCV λ R2Kan0ri 进行连接，将连接产物转化到Ε. coli DH5 α制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为pUCVPreUnitP。 准备cBGL 以pBHR68为模板用引物clnF和clnR进行PCR，用限制内切酶DraIII和KpnI对PCR产物作酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中介于IOObp和1500bp之间的DNA片段，标记为cBGL。构建pUCVUnitP 用限制内切酶BglI和KpnI对pUCVPreUnitP作酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中介于IOOObp和5100bp之间的DNA片段，标记为cUCVPreUnitP。 用T4 DNA连接酶对cBGL和cUCVPreUnitP进行连接，将连接产物转化到E. coli DH5 α制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为pUCVUnitP。构建pUnitP 用限制内切酶Mil对pUCVUnitP作酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中26Mbp的片段，用T4 DNA连接酶对分离产物进行连接，将连接产物转化到E. coli DH5a制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，在 37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，在 37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为pUnitP。构建pUCVX Rl 用限制内切酶KpnI和Mil对λ Rl作酶切，用溶液法回收酶切产物，标记为cXRl。用Τ4 DNA连接酶对cUCV和c λ Rl进行连接，将连接产物转化到E. coli DH5 α制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为PUCV λ Rl。构建pUCV λ RlKanOri 用限制内切酶DraIII和Mil对pUCV λ Rl作酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中介于IOOObp和3000bp之间的DNA片段，标记为cUCVX R1。用 T4 DNA连接酶对cUCVARl和cKanOri进行连接，将连接产物转化到E. coli DH5 α制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊， 从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为pUCV λ RlKanOri。准备cUCV λ RlKanOri 用限制内切酶 DraI 11 和 Sal I 对 pUCV λ RlKanOri 作酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中介于IOOObp和4800bp之间的DNA片段，标记为 cUCVλ RlKanOri0构建pUCVHK022R 用限制内切酶KpnI和Mil对HK022R作酶切，用溶液法回收酶切产物，标记为CHK022R。用"Γ4 DNA连接酶对cUCV和cHK022R进行连接，将连接产物转化到 E. coli DH5ci制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有卡那霉素的LB琼脂平板上， 在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，在 37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒，标记为pUCVHK022R。准备cUCVHK022R 用限制内切酶DraIII和Mil对pUCVHK022R作酶切，用溶液法回收酶切产物，标记为CUCVHK022R。构建PUCVHK022IUL2 用限制内切酶BglI和Mil对λ L2作酶切，用溶液法回收酶切产物，标记为c λ L2。用Τ4 DNA连接酶对cXL2和CUCVHK022R进行连接，将连接产物转化到E. coli DH5 α制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有卡那霉素的LB 琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为PUCVHK022IU L2。构建PUCVPreUnitR 用限制内切酶BglI和Mil对pUCVHK022R λ L2作酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中介于IOObp和1500bp之间的DNA片段，标记为cHK022R λ L2。 用Τ4 DNA连接酶对CHK022R λ L2和cUCV λ RlKanOri进行连接，将连接产物转化到E. coli DH5 α制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为pUCVPreUnitR。构建pUCVUnitR 用限制内切酶BglI和KpnI对pUCVPreUnitR作酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中3977bp的片段，标记为cUCVPreUnitR。用T4 DNA连接酶对cBGL 和cUCVPreUnitR进行连接，将连接产物转化到E. coli DH5 α制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为pUCVUnitR。构建pUnitR 用限制内切酶Mil对pUCVUnitR作酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中2527bp的片段，用T4 DNA连接酶对分离产物进行连接，将连接产物转化到E. coli DH5a制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，在 37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，在 37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为pUnitR。准备CcD80R:以0 801 为模板用引物即评和即沙进行？0 ，用限制内切酶8811 和Mil对PCR产物作酶切，用溶液法回收酶切产物，标记为c080R。构建pUCVHK022P0 80R 用 T4 DNA 连接酶对 cUCVHK022P 和 c080R 进行连接，将连接产物转化到E. coli DH5 α制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有卡那霉素的 LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有卡那霉素的LB 液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为 pUCVHK022P0 80R。构建pUCVUnitExP 以pUCVHK022P Φ 80R为模板用弓丨物tesF和tesR进行PCR，用限制内切酶BglI和Mil对PCR产物作酶切，用溶液法回收酶切产物，标记为cHK022P080R。 用jM DNA连接酶对CUCVARlKanOri和cHK022P080R进行连接，将连接产物转化到E. coli DH5 α制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为pUCVUnitExP。构建pUnitExP 用限制内切酶BglI和DraIII对pUCVUnitExP作酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中2252bp的片段，用T4 DNA连接酶对分离产物进行连接，将连接产物转化到E. coli DH5a制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为pUnitExP。构建cUCVHK02^080R 用 T4 DNA 连接酶对 cUCVHK022R 和 c080R 进行连接，将连接产物转化到E. coli DH5 α制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有卡那霉素的 LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为 cUCVHK022R0 80R。构建pUCVUnitExR 以cUCVHK02^0 80R为模板用弓丨物tesF和tesR进行PCR，用限制内切酶BglI和Mil对PCR产物作酶切，用溶液法回收酶切产物，标记为cHK022R080R。 用jM DNA连接酶对cHK022R080R和cUCVA R2Kan0ri进行连接，将连接产物转化到E. coli DH5 α制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为pUCVUnitExR。构建pUnitExR 用限制内切酶BglI和DraIII对pUCVUnitExR作酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中2155bp的片段，用T4 DNA连接酶对分离产物进行连接，将连接产物转化到E. coli DH5a制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为pUnitExR。(3)构建带有启动子和发卡结构的单元载体 基因合成
T7HP:TAGACAACGCGGGGTACCTGCACGGTCACTGCGTGCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCC CAAGGGGTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGGTGGCAGCAGCCAACTCAGCTTCCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGGA TCTCAGCCACGTAGGCATAAGCCTTCGAGGCCGTTATCATCCAAAATACGGTACGGAGACGTCAACAATATCTCTAT TGAACTGCAGTCTCGAGATAAGTCGACTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTACACCGAGTGCCTGTGCAGGTCGACTCT AGAGGATCAGGTACCCTGCAGATTCCCAATTCTGCGAACGCAATCAA 实验步骤
准备cT7HP 用限制内切酶DraIII对T7HP作酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中 248bp的片段，标记为cT7HP。构建pUnitRHP 用限制内切酶BglI对pUnitR作酶切，并加入CIAP去磷酸化处理， 用溶液法回收酶切产物，标记为cUnitR。用T4 DNA连接酶对cT7HP和cUnitR进行连接， 将连接产物转化到E. coli S17-1 Pir制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为pUnitRHP。构建pUnitPHP 用限制内切酶BglI对pUnitP作酶切，并加入CIAP去磷酸化处理， 用溶液法回收酶切产物，标记为cUnitP。用T4 DNA连接酶对cUnitP和cT7HP进行连接， 将连接产物转化到E. coli S17-1 Pir制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为pUnitPHP。(4)组装宿主 引物合成
delF:ACGCGCATGATAGCCTCATCAATAATAAGGCTTTATGCTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC delR:TCATCGCAGTACTGTTGTATTCATTAAGCATCTGCCGACCTGTCAAACATGAGAATTAAVRSFGGTGAATCACGACAAAGCGTATC VRSRAAGTTGTCGCATTATTCGCCTG VRTFGAAACCAGGGCACACCAACG K2CGGTGCCCTGAATGAACTGC VRTF2AGGTTATCAGCCGAAAATGCCG VRSR2TGCCTGAGTGTTGTCTTTTTCCA 实验步骤
构建E. coli TOPlO TARGET 将pAH69电转化到E. coli TOPlO制成的感受态中，将转化产物涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，在30°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，在30°C培养至菌液浑浊，将TARGET电转化到菌液制成的感受态中，将转化产物在LB培养基中重悬，在30°C培养30分钟，在42°C 培养30分钟，在30°C培养30分钟，诱导菌液进行HK022 BP重组，将重组产物涂布于含有氯霉素的LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，用引物VRSF和引物VRSR对长出的克隆进行菌落PCR，筛选其中产生970bp产物的克隆，标记为E. coli T0P10 TARGET。构建Ε. coli TARKan JfE. coli T0P10 TARGET接种于含有氯霉素的LB液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，将pKD46转化到菌液制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有氯霉素和氨苄青霉素的LB琼脂平板上，在30°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有氯霉素和氨苄青霉素的LB液体培养基中，在30°C培养至菌液浑浊，以 PKD13为模板用引物delF和delR进行PCR，将PCR产物电转化到菌液制成的感受态中，将转化产物在LB培养基中重悬，在37°C培养1小时，诱导长出的克隆进行λ Red重组，将重组产物涂布于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，用引物VRTF和引物 K2对长出的克隆进行菌落PCR，筛选其中产生1190bp产物的克隆，标记为E. coli TARKan0构建HOST JfE. coli TARKan接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，在37°C 培养至菌液浑浊，将PCP20电转化到菌液制成的感受态中，将转化产物涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，在30°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，在30°C培养至菌液浑浊，取菌液涂布于LB琼脂平板上，在42°C培养 1小时，诱导长出的克隆进行frt重组，将重组产物涂布于LB琼脂平板上，在42°C培养至可见单克隆，用引物VRTF2和引物VRSR2对长出的克隆进行菌落PCR，筛选其中产生863bp产物的克隆，标记为HOST。(5)单元载体 引物合成
IuxCFCCAGATCACCGAGTGAGGCTAATATGACTAAAAAAATTTCATTCA IuxCRCCAGATCACCGTGTGTTACGGGACAAATACAAGGAACTT IuxAFCCAGATCACCGAGTGAGGGCTCTCTATGAAATTTGGAA IuxARCCAGATCACCGTGTGCTATAATAGCGAACGTTGTTTTTCTTT IuxBFCCAGATCACCGAGTGAGGAAAAAGAAATGAAATTTGGATT IuxBRCCAGATCACCGTGTGCTACATGTGGTACTTTTTAATATTATCATT IuxEFCCAGATCACCGAGTGAGGACAGGTATGACTTCATATGTTGATAAACA IuxERCCAGATCACCGTGTGTCAACTATTAAATGCTTGGTTTAAGCIuxDFCCAAATCACCGAGTGAGATAAGTTCCTTGTATTTGTCCCG IuxDRCCAGATCACCGTGTGTTAAGACAGCGAAATCGCTTG 基因合成
IuxA:[BX571866. 1:27616-28695] IuxD:[BX571866. 1:26476-27439] IuxC:[BX571866. 1:25061-26503] IuxB:[BX571866. 1:28713-29687] IuxE:[BX571866. 1:29749-30861] 实验步骤
准备cUnitRHP 用限制内切酶BglI对pUnitRHP作酶切，并加入CIAP去磷酸化处理， 用溶液法回收酶切产物，标记为cUnitRHP。准备cUnitPHP 用限制内切酶BglI对pUnitPHP作酶切，并加入CIAP去磷酸化处理，用溶液法回收酶切产物，标记为cUnitPHP。构建pUnitRHPluxA 以IuxA为模板用引物IuxAF和IuxAR进行PCR，用限制内切酶DraIII对PCR产物作酶切，用溶液法回收酶切产物，用T4 DNA连接酶对cUnitRHP和分离产物进行连接，将连接产物转化到E. coli S17-1 Pir制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为pUnitRHPluxA。构建pUnitPHPluxD 与构建 pUnitRHPluxA 相同，其中 IuxA、IuxAF、IuxAR、 cUnitRHP 分别替换为luxD、IuxDF, luxDR、cUnitPHP。构建pUnitRHPluxC 与构建 pUnitRHPluxA 相同，其中 IuxA、IuxAF、IuxAR、 cUnitRHP 分别替换为luxC、IuxCF, luxCR、cUnitRHP。构建pUnitPHPluxB 与构建 pUnitRHPluxA 相同，其中 IuxA、IuxAF、IuxAR、 cUnitRHP 分别替换为luxB、IuxBF, luxBR、cUnitPHP。构建pUnitRHPluxE 与构建 pUnitRHPluxA 相同，其中 IuxA、IuxAF、IuxAR、 cUnitRHP 分别替换为luxE、IuxEF, luxER、cUnitRHP。(6)组装过程
构建HOSTLuxAUnit 将pCMR电转化到HOST制成的感受态中，将转化产物涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，在30°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，在30°C培养至菌液浑浊，将pUnitRHPluxA电转化到菌液制成的感受态中，将转化产物在LB培养基中重悬，在30°C培养30分钟，在42°C培养30分钟， 在30°C培养30分钟，诱导菌液进行HK022 LR重组，将重组产物涂布于含有卡那霉素的LB 琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，标记为HOSTLuxAUnit。构建HOSTLuxA 将pAH57电转化到HOSTLuxAUnit制成的感受态中，将转化产物涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，在30°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，在30°C培养至菌液浑浊，取菌液涂布于LB琼脂平板上，在42°C培养1小时，诱导长出的克隆进行λ LR重组，将重组产物涂布于LB琼脂平板上，在42°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于LB液体培养基中，在42°C培养至菌液浑浊，标记为HOSTLuxA。构建HOSTLuxALuxBUnit 与构建 HOSTLuxAUnit 相同，其中 pCMR、HOST、 pUnitRHPluxA、HK022 LR 重组分别替换为pAH69、HOSTLuxA、pUnitPHPluxB、HK022 BP 重组。构建HOSTLuxALuxB 与构建 HOSTLuxA 相同，其中 HOSTLuxAUnit 替换为 HOSTLuxALuxBUnit。构建HOSTLuxALuxBLuxEUnit 与构建 HOSTLuxAUnit 相同，其中 pCMR、HOST、 pUnitRHPluxA、HK022 LR 重组分别替换为pCMR、HOSTLuxALuxB、pUnitRHPluxE、HK022 LR重组。构建HOSTLuxALuxBLuxE 与构建 HOSTLuxA 相同，其中 HOSTLuxAUnit 替换为 HOSTLuxALuxBLuxEUnit。构建HOSTLuxALuxBLuxEExP 将 pAHU9E 电转化到 HOSTLuxALuxBLuxE 制成的感受态中，将转化产物涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，在30°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，在30°C培养至菌液浑浊，将PUnitExP电转化到菌液制成的感受态中，将转化产物在LB培养基中重悬，在30°C 培养30分钟，在42°C培养30分钟，在30°C培养30分钟，诱导菌液进行Φ80 LR重组，将重组产物涂布于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，标记为 HOSTLuxALuxBLuxEExP。构建pUnitLuxALuxBLuxE 将 pAH69Pir 电转化到 HOSTLuxALuxBLuxEExP 制成的感受态中，诱导转化产物进行HK022 BP重组，将重组产物涂布于含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB琼脂平板上，在30°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB液体培养基中，在30°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒，用琼脂糖凝胶电泳分离质粒中6246bp的片段，标记为pUnitLuxALuxBLuxE。构建HOSTLuxCUnit 与构建 HOSTLuxAUnit 相同，其中 pCMR、HOST、pUnitRHPluxA、 HK022 LR 重组分别替换为pCMR、H0ST、pUnitRHPluxC、HK022 LR 重组。构建HOSTLuxC 与构建 HOSTLuxA 相同，其中 HOSTLuxAUnit 替换为 HOSTLuxCUnit。构建HOSTLuxCLuxDUnit 与构建 HOSTLuxAUnit 相同，其中 pCMR、HOST、 pUnitRHPluxA、HK022 LR 重组分别替换为pAH69、HOSTLuxC、pUnitPHPluxD、HK022 BP 重组。构建pUnitLuxCLuxD 与构建 HOSTLuxA 相同，其中 HOSTLuxAUnit 替换为 HOSTLuxCLuxDUnit。构建HOSTLuxCLuxDExR 与构建 HOSTLuxALuxBLuxEExP 相同，其中 HOSTLuxALuxBLuxE、pUnitExP 分别替换为pUnitLuxCLuxD、pUnitExR。准备pUnitLuxCLuxD 与构建 pUnitLuxALuxBLuxE 相同，其中 pAH69Pir、 HOSTLuxALuxBLuxEExP 分别替换为pCMRPir、HOSTLuxCLuxDExR。构建HOSTLuxALuxBLuxELuxCLuxDUnit 与构建 HOSTLuxAUnit 相同，其中pCMR、HOST、pUnitRHPluxA、HK022 LR 重组分另Ij 替换为pAH69、HOSTLuxALuxBLuxE、 pUnitLuxCLuxD、HK022 BP 重组。构建HOSTLuxALuxBLuxELuxCLuxD 与构建 HOSTLuxA 相同，其中 HOSTLuxAUnit 替换为HOSTLuxALuxBLuxELuxCLuxDUnit。HOSTLuxALuxBLuxELuxCLuxD即为5个基因组装在一起的产物。实施例2 利用线形组装系统组装luxA、luxB、luxC、luxD、luxE。(1)构建 pLUHelp : 基因合成
CrossInt [AY048 72 1. 1 878- 1 2 58 ] [AY048 72 1. 1 1 2 59- 1 60 2] [AY048715. 1:1614-2236]TTGGCACTGGCTGATCAGCTAGCACATGT 实验步骤
构建pLUHelpH 用限制内切酶NcoI和EcoRI对pAH83作酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中3822bp的片段，将分离产物用碱式磷酸酶处理，产物标记为cAH83。用限制内切酶EcoRI和PciI对Crosslnt作酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中1375bp的片段， 标记为cCrossInt。用T4 DNA连接酶对cCrossInt和cAH83进行连接，将连接产物电转化到E. coli DH5 α制成的感受态中，将转化产物涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上， 在30°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中， 在30°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为pLUHelpH。构建pLUHelp 用限制内切酶HindIII对pLUHelpH作酶切，用溶液法回收酶切产物，用T4 DNA连接酶对分离产物进行连接，将连接产物电转化到E. coli DH5 α制成的感受态中，将转化产物涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，在30°C培养至可见单克隆， 挑取平板上的克隆接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，在30°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为pLUHelp。(2)单元载体和组装宿主插入位点 引物合成
CNFAATAGTCGACCTTCGGAATAGGAACTTCATTTA CNRAATATCTAGAGCCTACCTGTGACGGAAGA pUFATAAGGTACCGGATTGCGAGGCTTTGCC pURTATAGTCGACGCAAGATCCGCAGTTCAACC KNFATTAGTCGACGATCCCCTTATTAGAAGAACTCG KNRTTCATCTAGAAGAGCGCTTTTGAAGCTCA ydeQFTTATTCATAGATAAAAGTGACACCAATGA ydeQRGTCGATTCGATTTTCTTAGCCTT 基因合成
CN (连接在 pQLV 中)[JF748716. 1 3633-3757]GGCCTCGACGGCCACGTTACTTAGTCATCGGC CTACGAGGCC[GU574773. 11425-1326]GGATCCGCAGCAGTAGAGCTCCTCGAGAGTGCAACGACTAGTCAC ATGGTG[AF064539. 124474-25037]CACACGGTGGGTACC
KN (连接在 pQLV 中)[JF748716. 1:2177-2053]GGCCTCGACGGCC[CP000948. 1: 1675439-1675498][AY048737. 12029-1922]TGCACCGACCGTGAATTTAAGGCCTACGAGGCC[GU931384. 1750-849]GGATCCGCAGCAGTAGAGCTCCTCGAGAGTGCAACGACTAGTCACATGGTG [A F064539.124474-25037]CACACGGTGGGTACC[CP000948. 1:1676351-1676410]
N15 (连接在 pQLV 中)GGATCC [FJ160465. 1:3530-6278] CCATGGGGCGCGTACTGAGAGCTC par (连接在 pQLV 中)CCATGG [FJ160465. 1 8082-9448] GCTC 实验步骤
构建pN15Par 用限制内切酶NcoI和&icl对附5作酶切，并加入CIAP去磷酸化处理， 用溶液法回收酶切产物，用限制内切酶NcoI和Mel对par作酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中1375bp的片段，用T4 DNA连接酶对分离产物进行连接，将连接产物转化到E. coli DH5a制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，在 37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，在 37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为pN15Par。准备Cm5Par 用限制内切酶BamHI和^icI对Pm5Par作酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中4130bp的片段，标记为cm5Par。准备CR6Ky 以pKD13为模板用引物pUF和pUR进行PCR，用限制内切酶MlI和 KpnI对PCR产物作酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中427bp的片段，标记为cR6K γ。构建pN12C 用限制内切酶SpeI和B10I对CN作酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中3308bp的片段，标记为cCN。以pKD3为模板用引物CNF和CNR进行PCR，用限制内切酶Mil和^CbaI对PCR产物作酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中905bp的片段，标记为cCHL。用T4 DNA连接酶对cCHL和cCN进行连接，将连接产物转化到E. coli DH5 α 制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为PN12C。构建pR12C 用限制内切酶MlI和KpnI对pN12C作酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中1804bp的片段，标记为cN12C。用T4 DNA连接酶对cN12C和cR6K γ进行连接， 将连接产物转化到Ε. coli S17-1 Pir制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有氯霉素的LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有氯霉素的LB 液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为 pR12C。构建pLSU21C 用限制内切酶BamHI和&icl对pR12C作酶切，并加入CIAP去磷酸化处理，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中2212bp的片段，用T4 DNA连接酶对分离产物和cN15Par进行连接，将连接产物转化到E. coli S17-1 Pir制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有氯霉素的LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有氯霉素的LB液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为PLSU21C。构建pN21K 以pKD13为模板用引物KNF和KNR进行PCR，用限制内切酶SalI和 XbaI对PCR产物作酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中1182bp的片段，标记为cKAN。 用限制内切酶SpeI和B10I对KN作酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中3540bp的片段，标记为cKN。用"Γ4 DNA连接酶对cKN和cKAN进行连接，将连接产物转化到E. coli DH5 α制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37°C 培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为PN21K。构建pR21K 用Mil和KpnI对pN21K作酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中 2253bp的片段，标记为cN21K。用T4 DNA连接酶对cR6Ky和cN21K进行连接，将连接产物转化到E. coli S17-1 Pir制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为pR21K。构建pLSUH 用BamHI和&icl对pR21K作酶切，并加入CIAP去磷酸化处理，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中2661bp的片段，用T4 DNA连接酶对分离产物和Cm5Par进行连接，将连接产物转化到E. coli S17-1 Pir制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为PLSU12K。构建E. coli MG1655 HI 以 pN21K 为模板用引物 ydeQF 和 ydeQR 进行 PCR，将 PKD46转化到E. coli MG1655制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，在30°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有氨苄青霉素的 LB液体培养基中，在30°C培养至菌液浑浊，将PCR产物电转化到菌液制成的感受态中，将转化产物在LB培养基中重悬，在37°C培养1小时，诱导长出的克隆进行λ Red重组，将重组产物涂布于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，标记为E. coli MG1655 H2K0(3)组装宿主线性化 引物合成
PGlFCGTTCGCAGAATTGGGAATC PG1RGGGATAGCAAGCCCAATAGG 基因合成
sopAB(连接在 pQLV 中)CTCGAG [AF064539. 1 22114-24973] AGCTT TacTelN (连接在 pQLV 中)ACTAGTGAAT [DQ997052. 1:49-228] [AF064539. 1:24981-26890]
实验步骤
构建pBSTacTelN 以TacTelN为模板用引物PGlF和PGlR进行PCR，用限制内切酶SpeI 和HindIII对PCR产物作酶切，用溶液法回收酶切产物，标记为cTacTelN。用限制内切酶 SpeI和HindIII对pBlueSCript2KS (-)作酶切，并加入CIAP去磷酸化处理，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中^^bp的片段，标记为cBS。用T4 DNA连接酶对cBS和cTacTelN进行连接，将连接产物转化到E. coli DH5 α制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为pBSTacTelN。构建pBSTacTeINSop 用限制内切酶 XhoI 和 HindIII 对 pBSTacTelN 作酶切， 并加入CIAP去磷酸化处理，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中5043bp的片段，标记为cBSTacTelN。用限制内切酶)(hoI和HindIII对sopAB作酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中^69bp的片段，标记为cSop。用T4 DNA连接酶对cSop和cBSTacTelN进行连接，将连接产物转化到E. coli DH5 α制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有氨苄青霉素的 LB液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒，标记为pBSTacTelNSop。构建pAHTacTelNSop 用EcoRI和BioI对pBSTacTelNSop作酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中4998bp的片段，标记为CBSTaCjTelNSop。用Mil和EcoRI对pAH153作酶切，并加入CIAP去磷酸化处理，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中2306bp的片段，标记为cAH153。用T4 DNA连接酶对cAH153和cBSTacTelNSop进行连接，将连接产物转化到E. coli S17-1 Pir制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有庆大霉素的LB琼脂平板上， 在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有庆大霉素的LB液体培养基中，在 37 °C培养至菌液浑浊，提取质粒，标记为pAHTacTeINSop。构建E. coli MG1655 H2KTS 将 pAH123 电转化到 E. coli MG1655 HI 制成的感受态中，将转化产物涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，在30°C培养至可见单克隆， 挑取平板上的克隆接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，在30°C培养至菌液浑浊，将 pAHTacTeINSop电转化到菌液制成的感受态中，将转化产物在LB培养基中重悬，在30°C培养30分钟，在42°C培养30分钟，在30°C培养30分钟，诱导菌液进行Φ80 BP重组， 将重组产物涂布于含有庆大霉素的LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，标记为E. coli MG1655 H2KTS。在 iTelN 作用下，E. coli MG1655 H2KTS 形成端粒，标记为 E. coli MG1655 H2KTSL0(4)构建回收载体 引物合成
pUEFATAAGAGCTCGGATTGCGAGGCTTTGCC pUERTATAACTAGTGCAAGATCCGCAGTTCAACC KNFATTAGCGGCCGCGATCCCCTTATTAGAAGAACTCG KNRTTCAGGATCCAGAGCGCTTTTGAAGCTCA CNFAATAGCGGCCGCCTTCGGAATAGGAACTTCATTTA CNRAATAGGATCCGCCTACCTGTGACGGAAGA 基因合成
repl (连接在 pQLV 中)[EF397941. 1 3128-5246] TCCATAAGGACGTC r印2(连接在 pQLV 中)[EF583812. 1 8100-6349] ACGTC
rep3(连接在 pQLV 中)[EF397941.16985-7916]TGCTCGCAAAGTTGAAAAGAC AACAATTGAAGTAGATCGTGACCTCGACTTGAACATTGACATCCACGGAAATCCGCGTAGTAAAACT[E F397941. 1:8005-8515]GACGTC
KE(连接在 pQLV 中)GAGCTCATTAGCACGACCATGGTAGATTATGATTAATTAA[J F748716. 13633-3757]CGCTTTGCGACTCAACCTTT[AY048737. 11932-1784]GACGTCATCTTAGAT ACACTAGTAGATCTTATCGATGATCGCGGCCGCCACATGGTG [AF064539. 124474-25037]CACACGGTG
CE(连接在 pQLV 中)GAGCTCATTAGCACGACCATGGTAGATTATGATTAATTAA[JF748716.12177-2053]CGCTTTGCGACTCAACCTTT[AY048737. 11932-1784]GACGTCATCTTAGAT ACACTAGTAGATCTTATCGATGATCGCGGCCGCCACATGGTG[AF064539. 124474-25037]CACACGGTG 实验步骤
准备cR6K γ 以pKD13为模板用引物pUEF和pUER进行PCR，用SpeI和&icl对PCR产物作酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中427bp的片段，标记为cR6Ky。构建pCBREP12 用AatII和PciI对r印2作酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中1755bp的片段，标记为cREP2。用AatII和PciI对r印1作酶切，并加入CIAP去磷酸化处理，用溶液法回收酶切产物，标记为cREPl。用T4 DNA连接酶对cREPl和cREP2进行连接，将连接产物转化到E. coli DH5 α制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为PCBREP12。构建pCBREP 用AatII和BioI对r印3作酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中1535bp的片段，标记为cREP3。用AatII和XhoI对pCBREP 12作酶切，并加入CIAP去磷酸化处理，用溶液法回收酶切产物，标记为CREP12。用T4 DNA连接酶对cREP12和cREP3进行连接，将连接产物转化到E. coli DH5 α制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为pCBREP。准备cREP 用限制内切酶AatII和)(baI对pCBREP作酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中5392bp的片段，标记为cREP。构建pREPCE 用限制内切酶AatII和SpeI对CE作酶切，并加入CIAP去磷酸化处理，用溶液法回收酶切产物，标记为cCE。用T4 DNA连接酶对cCE和cREP进行连接，将连接产物转化到E. coli DH5 α制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有氨苄青霉素的 LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有氨苄青霉素的LB 液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为 pREPCE。构建P15aExlRC 用限制内切酶BglII和NotI对pREPCE作酶切，并加入CIAP去磷酸化处理，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中8743bp的片段，标记为cREPCE。以pKD3为模板用弓I物CNF和CNR进行PCR，用限制内切酶BamHI和NotI对PCR产物作酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中906bp的片段，标记为cCHL。用T4 DNA连接酶对cCHL和cREPCE 进行连接，将连接产物转化到E. coli DH5 α制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为pl5aExlRC。构建pLSExlRC 用限制内切酶)(bal和^icI对P15aExlRC作酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中7253bp的片段，标记为cExlRC。用T4 DNA连接酶对cExlRC和cR6K γ 进行连接，将连接产物转化到Ε. coli S17-1 Pir制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有氯霉素的LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有氯霉素的LB液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为pLSExlRC。构建pREPKE 用限制内切酶AatII和SpeI对KE作酶切，并加入CIAP去磷酸化处理，用溶液法回收酶切产物，标记为cKE。用T4 DNA连接酶对cREP和cKE进行连接，将连接产物转化到E. coli DH5 α制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有氨苄青霉素的 LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有氨苄青霉素的LB 液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为 pREPKE。构建P15aEx2RK 用限制内切酶BglII和NotI对pREPKE作酶切，并加入CIAP去磷酸化处理，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中8743bp的片段，标记为cREPKE。以pKD13 为模板用弓丨物KNF和KNR进行PCR，用限制内切酶BamHI和NotI对PCR产物作酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中1183bp的片段，标记为cKAN。用T4 DNA连接酶对cKAN和 cREPKE进行连接，将连接产物转化到E. coli DH5 α制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为pl5aEx2RK。构建pLSEx2RK 用限制内切酶)(bal和^icI对P15aEx2RK作酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物中7530bp的片段，标记为cEx2RK。用T4 DNA连接酶对cEx2RK和cR6K γ 进行连接，将连接产物转化到Ε. coli S17-1 Pir制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为pLSEx2RK。(5)将基因连接到单元载体
此处引物 IuxCF> luxCR、IuxAF> IuxAR> IuxBF> luxBR、luxEF、luxER、luxDF、luxDR、基因 luxA、luxB、luxC、luxD、IuxE 与实施例 1 中一致。实验步骤
准备CLSU21C 用SfiI对pLSU21C作酶切，并加入CIAP去磷酸化处理，用溶液法回收酶切产物，标记为CLSU21C。准备CLSU12K:用限制内切酶SfiI对pLSUia(作酶切，并加入CIAP去磷酸化处理， 用溶液法回收酶切产物，标记为CLSU12K。构建pLSU21CC:以IuxC为模板用引物IuxCF和IuxCR进行PCR，用限制内切酶 DraIII对PCR产物作酶切，用溶液法回收酶切产物，用T4 DNA连接酶对cLSU21C和分离产物进行连接，将连接产物转化到E. coli S17-1 Pir制成的化转感受态中，将转化产物涂布于含有氯霉素的LB琼脂平板上，在37°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有氯霉素的LB液体培养基中，在37°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒并测序验证，验证正确的标记为PLSU21CC。构建pLSU21CA 与构建 cLSU21C 相同，其中 luxC、luxCF、luxCR、cLSU21C 分别替换为luxA、IuxAF, luxAR、cLSU21C。构建pLSU21CE 与构建 cLSU21C 相同，其中 luxC、luxCF、luxCR、cLSU21C 分别替换、luxER、cLSU21C。构建PLSU12KB :与构建 cLSU21C 相同，其中 luxC、luxCF、luxCR、cLSU21C 分别替换为luxB、luxBF、luxBR、cLSU12K。构建pLSU12KD :与构建 cLSU21C 相同，其中 luxC、luxCF、luxCR、cLSU21C 分别替换为luxD、luxDF、luxDR、cLSU12K。(6)组装过程
实验步骤
构建 Ε. coli MG1655 H2KTSLHost 将 pLUHelp 电转化到 Ε. coli MG1655 H2KTSL 制成的感受态中，将转化产物涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，在30°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，在30°C培养至菌液浑浊，标记为 E. coli MG1655 H2KTSLHost。构建Ε. coli MG1655 HITSLluxA 将 pLSU21CA 电转化到 Ε. coli MG1655 H2KTSLHost制成的感受态中，诱导转化产物形成端粒，诱导重组产物进行λ LR重组，将重组产物涂布于含有氯霉素和氨苄青霉素的LB琼脂平板上，在30°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有氯霉素和氨苄青霉素的LB液体培养基中，在30°C培养至菌液浑浊，标记为 E. coli MG1655 H2KTSLluxA。构建E. coli MG1655 H2KTSLluxAB 将 pLSU12KB 电转化到 E. coli MG1655 H2KTSLluxA制成的感受态中，诱导转化产物形成端粒，诱导重组产物进行λ LR重组，将重组产物涂布于含有卡那霉素和氨苄青霉素的LB琼脂平板上，在30°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有卡那霉素和氨苄青霉素的LB液体培养基中，在30°C培养至菌液浑浊，标记为 E. coli MG1655 H2KTSLluxAB。构建Ε. coli MG1655 H2KTSLluxABE 将 pLSU21CE 电转化到 Ε. coli MG1655 H2KTSLluxAB制成的感受态中，诱导转化产物形成端粒，诱导重组产物进行λ LR重组，将重组产物涂布于含有氯霉素和氨苄青霉素的LB琼脂平板上，在30°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有氯霉素和氨苄青霉素的LB液体培养基中，在30°C培养至菌液浑浊，标记为 E. coli MG1655 H2KTSLluxABE。准备pLSU21CABE 将 pLSEx2RK 电转化到 Ε. coli MG1655 H2KTSLluxABE 制成的感受态中，诱导转化产物形成端粒，诱导重组产物进行HK022 LR重组，将重组产物涂布于含有卡那霉素、氨苄青霉素和氯霉素的LB琼脂平板上，在30°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有卡那霉素、氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基中，在30°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒，用琼脂糖凝胶电泳分离质粒中9742bp的片段，标记为 pLSU2ICABE。构建Ε. coli MG1655 H2KTSLluxC 将 pLSU21CC 电转化到 Ε. coli MG1655 H2KTSLHost制成的感受态中，诱导转化产物形成端粒，诱导重组产物进行λ LR重组，将重组产物涂布于含有氯霉素和氨苄青霉素的LB琼脂平板上，在30°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有氯霉素和氨苄青霉素的LB液体培养基中，在30°C培养至菌液浑浊，标记为 E. coli MG1655 H2KTSLluxC。构建E. coli MG1655 H2KTSLluxCD 将 pLSU12KD 电转化到 E. coli MG1655 H2KTSLluxC制成的感受态中，诱导转化产物形成端粒，诱导重组产物进行λ LR重组，将重组产物涂布于含有卡那霉素和氨苄青霉素的LB琼脂平板上，在30°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有卡那霉素和氨苄青霉素的LB液体培养基中，在30°C培养至菌液浑浊，标记为 E. coli MG1655 H2KTSLluxCD。准备pLSUlICD将pLSExlRC 电转化到Ε. coli MG1655 H2KTSLluxCD制成的感受态中，诱导转化产物形成端粒，诱导重组产物进行HK022 LR重组，将重组产物涂布于含有氯霉素、氨苄青霉素和卡那霉素的LB琼脂平板上，在30°C培养至可见单克隆，挑取平板上的克隆接种于含有氯霉素、氨苄青霉素和卡那霉素的LB液体培养基中，在30°C培养至菌液浑浊，从菌液中提取质粒，用琼脂糖凝胶电泳分离质粒中9189bp的片段，标记为PLSU12KCD。构建E. coli MG1655 HITSLluxABECD 将 pLSUlICD 电转化到 E. coli MG1655 H2KTSLluxABE制成的感受态中，诱导转化产物形成端粒，诱导重组产物进行λ LR重组，将重组产物涂布于含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB琼脂平板上，在30°C培养至可见单克隆， 挑取平板上的克隆接种于含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB液体培养基中，在30°C培养至菌液浑浊，标记为 E. coli MG1655 H2KTSLluxABECD。实施例3 环形无宿主无回收系统组装Iux基因。(1)构建 pUC-Gate: 合成引物
PGlCGTTCGCAGAATTGGGAATC PG2GGGATAGCAAGCCCAATAGG M13FTGTAAAACGACGGCCAGT M13R:CAGGAAACAGCTATGACC 合成基因
Gate (克隆在 pQLV 中):AAGCTTGCGGCCGCGAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTA TAGGAACTTCTTAATTAACCAGCCTCGCAGAGCAGGATTCCCGTTGAGCACCGCCAGGTGCGAATAAGGGACAGTGA AGAAGGAACACCCGCTCGCGGGTGGGCCTACTTCACCTATCGGTACCTTCGAGAGCTCCACCGAGTGACTAGTATGA TGAATTCCACACGGTGGTCGACTACGTGCTAGCCTCGAGCAATTG
实验步骤用GPl和PG2对Gate进行PCR，得到的片段用MfeI和HindIII在!^ermentas T Buffer中酶切。酶切产物溶液回收。标记为片段cGate。在i^ermentas R Buffer中用 EcoRI和HindIII对pUC18载体进行酶切，同时加入!^astAP去磷酸。酶切产物溶液回收。 标记为片段cUC。用"Γ4 DNA Iigase对片段cfeite和cUC进行连接。连接产物转化到DH5 α 感受态当中，转化后涂布在氨苄抗性的LB平板上。生长出来的克隆用M13F和M13R引物做菌落PCR验证，筛选其中具有300bp的PCR产物的克隆。将得到的克隆培养并提取质粒，测序验证无突变。该质粒记为pUC-Gate。(2)制备抗性片段 合成引物
CRFATAACTCGAGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGAAC CRRATAAGCTAGCCTTCGGAATAGGAACTTCATTTAAAT CLF ATAAGGTACCGCCTACCTGTGACGGAAGATC CLRATAAGAGCTCACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTG GRFATAACTCGAGACAAGTTTGTACAAAAAAGCTGAACG
41GRRATAAGCTAGCGAATTGTTAGGTGGCGGTACTTG GLFATAAGGTACCGGAGACCCCACACTACCATCG GLRATAAGAGCTCAGCCTGCTTTTTTGTACAAAGTTG KRFATAACTCGAGAACCTTTTTCACCTAAAGGATGACA KRRATAAGCTAGCGATCCCCTTATTAGAAGAACTCGTC KLFATAAGGTACCAGAGCGCTTTTGAAGCTCACG KLRATAAGAGCTCGGTGCACTTTAGGTGAATAAGTTGT 合成基因
C (在 pQLV 载体中)[JF748716. 1:3757-3633][GU589574. 1:1023-129] [⑶931384. 1:849-750]
G (在 pQLV 载体中)[JF748716. 1:2053-2177][AY048737. 1:3265-2481] [⑶574773. 1:1326-1425]
K (在 pQLV 载体中)AACCTTT[AY048737. 1:2015-1927][AY048744.1:1272-101] [AY048737. 11932-1816]TAAAGTGCACC
pUC-Gate-Cut 片段在 i^ermentas Seal Buffer 中用 SalI 和 NheI 对 pUC-Gate 进行酶切处理，同时加AhstAP进行去磷酸。得到的片段用溶液回收，标记为片段pUC-Gate-Cut。片段RC 用 CRF 和 CRR 对 C 进行 PCR，在 i^ermentas SdaI Buffer 中用 XhoI 和 NheI 对PCR产物进行酶切。酶切产物用溶液回收，标记为片段RC。片段CL 用 CLF 和 CLR 对 C 进行 PCR，在 Fermentas BamHI Buffer 中用 SacI 和 KpnI对PCR产物进行酶切。酶切产物用溶液回收，标记为片段CL。片段RG:用 GRF 和 GRR 对 C 进行 PCI ,在 i^ermentas SdaI Buffer 中用 XhoI 和 NheI对PCR产物进行酶切。酶切产物用溶液回收，标记为片段RG。片段GL:用 GLF 和 GLR 对 C 进行 PCR,在 Fermentas BamHI Buffer 中用 SacI 和 KpnI对PCR产物进行酶切。酶切产物用溶液回收，标记为片段GL。片段RK:用 KRF 和 KRR 对 C 进行 PCI ,在 Fermentas SdaI Buffer 中用 XhoI 和 NheI对PCR产物进行酶切。酶切产物用溶液回收，标记为片段RK。片段KL:用 KLF 和 KLR 对 C 进行 PCI ,在 i^ermentas BamHI Buffer 中用 SacI 和 KpnI对PCR产物进行酶切。酶切产物用溶液回收，标记为片段KL。(3)构建质粒pUC-C:用T4 DNA连接酶将片段pUC-Gate-Cut和RC连接。连接产物转化到DH5ci感受态当中，转化后涂布到氯霉素抗性平板。得到克隆用M13F和M13R引物测序验证。序列正确的为标记为质粒PUC-C。(4)构建质粒pUC-G:用T4 DNA连接酶将片段pUC-Gate-Cut和RG连接。连接产物转化到DH5ci感受态当中，转化后涂布到庆大霉素抗性平板。得到克隆用M13F和M13R 引物测序验证。序列正确的为标记为质粒PUC-G。(5)构建质粒pUC-K:用T4 DNA连接酶将片段pUC-Gate-Cut和RC连接。连接产物转化到DH5ci感受态当中，转化后涂布到卡纳霉素抗性平板。得到克隆用M13F和M13R 引物测序验证。序列正确的为标记为质粒pUC-K。(6)构建质粒 pUC-GC:在 Fermentas BamHI Buffer 中用 McI 和 KpnI 对 pUC_C 进行酶切，同时加入i^astAP去磷酸化。得到的片段用溶液回收。用T4 DNA连接酶将该片段与GL片段连接。连接产物转化到DH5ci感受态当中，转化后涂布到庆大霉素氯霉素双抗平板。得到克隆用M13F和M13R引物测序验证。序列正确的为标记为质粒pUC_GC。(7)构建质粒 pUC-KC:在 Fermentas BamHI Buffer 中用 SacI 和 KpnI 对 pUC_C 进行酶切，同时加入i^astAP去磷酸化。得到的片段用溶液回收。用T4 DNA连接酶将该片段与KL片段连接。连接产物转化到DH5ci感受态当中，转化后涂布到卡纳霉素氯霉素双抗平板。得到克隆用M13F和M13R引物测序验证。序列正确的为标记为质粒pUC_KC。(8)构建质粒 pUC-CG:在 Fermentas BamHI Buffer 中用 SacI 和 KpnI 对 pUC_G 进行酶切，同时加入i^astAP去磷酸化。得到的片段用溶液回收。用T4 DNA连接酶将该片段与CL片段连接。连接产物转化到DH5ci感受态当中，转化后涂布到氯霉素庆大霉素双抗平板。得到克隆用M13F和M13R引物测序验证。序列正确的为标记为质粒pUC_CG。(9)构建质粒 pUC-KG:在 Fermentas BamHI Buffer 中用 SacI 和 KpnI 对 pUC_G 进行酶切，同时加入i^astAP去磷酸化。得到的片段用溶液回收。用T4 DNA连接酶将该片段与KL片段连接。连接产物转化到DH5ci感受态当中，转化后涂布到卡纳霉素庆大霉素双抗平板。得到克隆用M13F和M13R引物测序验证。序列正确的为标记为质粒pUC_KG。(10)构建质粒 pUC-CK:在 Fermentas BamHI Buffer 中用 SacI 和 KpnI 对 pUC_K 进行酶切，同时加入i^astAP去磷酸化。得到的片段用溶液回收。用T4 DNA连接酶将该片段与CL片段连接。连接产物转化到DH5ci感受态当中，转化后涂布到氯霉素卡纳霉素双抗平板。得到克隆用M13F和M13R引物测序验证。序列正确的为标记为质粒pUC_CK。(11)构建质粒 pUC-GK:在 Fermentas BamHI Buffer 中用 SacI 和 KpnI 对 pUC_K 进行酶切，同时加入i^astAP去磷酸化。得到的片段用溶液回收。用T4 DNA连接酶将该片段与GL片段连接。连接产物转化到DH5ci感受态当中，转化后涂布到庆大霉素卡纳霉素双抗平板。得到克隆用M13F和M13R引物测序验证。序列正确的为标记为质粒pUC_GK。(12)pUC-RFP 片段和 OriS 片段载体 J61031 来自 iGEM (http //partsregistry. org/Part:BBa_J61031)。在 BamHI Buffer 中用 EcoRI SpeI XhoI NotI 四个酶对 J61031 质粒进行酶切。胶回收其中4. IKbp片段(理论4141bp)为pUC-RFP片段；胶回收其中4. 5Kbp 片段(理论4548bp)为OriS片段。(13)构建环形无宿主无回收单元空载体pUC_GC、pUC_KC、pUC_CG、pUC_KG、 pUC-CK、pUC-GK 分别在 Fermentas SdaI Buffer 中用 EcoRI 和 SpeI 双酶切，同时加入 !^astAP去磷酸化。得到片段分别用溶液回收，分别与pUC-RFP片段连接。连接产物分别转化到DH5ci感受态当中，转化后6种分别涂布到AGC:氨苄青霉素+庆大霉素+氯霉素平板；AKC:氨苄青霉素+卡纳霉素+氯霉素平板；ACG:氨苄青霉素+氯霉素+庆大霉素平板；AKG:氨苄青霉素+卡纳霉素+庆大霉素平板；ACK:氨苄青霉素+氯霉素+卡纳霉素平板；AGK:氨苄青霉素+庆大霉素+卡纳霉素平板。以上六种克隆分别挑取5个，培养后提取质粒，用EcoRI和SpeI双酶切鉴定。取其中正确的各一个。将酶切验证正确的6 个载体分别用》ιοΙ和NotI在i^rmentas 0 Buffer中进行双酶切。片段分别溶液回收。 回收到的片段分别与OriS片段用T4 DNA连接酶连接。连接产物分别转化到DH5 α感受态当中，转化后6种分别涂布到AGC:氨苄青霉素+庆大霉素+氯霉素平板;AKC:氨苄青霉素+卡纳霉素+氯霉素平板；ACG:氨苄青霉素+氯霉素+庆大霉素平板；AKG:氨苄青霉素+卡纳霉素+庆大霉素平板；ACK:氨苄青霉素+氯霉素+卡纳霉素平板；AGK:氨苄青霉素+庆大霉素+卡纳霉素平板；六种平板上的克隆用如下引物进行两组PCR验证a) attR 验证FRVF CCGCAAAAAAGGGAATAAGG 和 FRVR TCAGGCATCGTGTGTAAGCA ；b) attL 验证 FLVF:TCGGTGTGCGGTTGTATGC 和 FLVR:GACGGTGCTCTGAAAGGTGA。其中含氯霉素抗性的片段应有约1. 3Kbp的PCR片段。含庆大霉素抗性的片段应有约1. 5Kbp的PCR片段。含卡纳霉素抗性的片段应有约ι. SKbp的PCR片段。验证正确的六种克隆分别为六种单元载体rec、 FKC、FCG、FKG、FCK、FGK。(14)合成 FLP 载体(合成片段在 pQLV 当中)，序列为CCATGGCATCACAGTATCGTGA TGACAGAGGCAGGGAGTGGGACAAAATTGAAATCAAATAAGGATCCTACTAAGGAGGTTGTATGCCACAATTTGA[F J797950.17321-6482]G[FJ797950. 16480-6064]TGATTTTATTTTGACTGATAGTGACCTGTTCGTT GCAACAAATTGATAAGCAATGCCGCTAGC
(15)构建辅助质粒pIXF:将实施实例2中的pLUHelp在Fermentas Buffer Tango当中用NheI和NcoI进行双酶切，同时加入!^astAP去磷酸化。酶切产物用溶液回收。用引物PGl和PG2对FLP载体进行PCR，将PCR产物在Fermentas Buffer Tango当中用NheI 和NcoI进行双酶切，酶切产物用溶液回收。将回收的两种片段用T4 DNA连接酶连接，连接产物转化到大肠杆菌DH5 α感受态当中，转化后涂布在氨苄青霉素平板，在30摄氏度培养。长出来的克隆用引物 FPF CGCACGAAAAGCATCAGG 和 FI3R CGCAAAAACAACGAACCACA 作菌落 PCR验证。验证取其中能得到1. 7Kbp片段的克隆，提取质粒用FPF和FPR引物测序验证。 测序验证为正确连接FLP的质粒标记为pIXFCl。在i^ermentas R Buffer中将pIXFCl用 HindIII酶切，溶液回收后自连。连接产物转化到大肠杆菌DH5 α感受态当中，转化后涂布在氨苄青霉素平板，在30摄氏度培养。长出来的克隆用引物C1F:ACCTGACCGCTATCCCTGA和 C1R:GCCCTTCAATCGCCAGA做菌落PCR验证。验证取其中能得到250bp片段的克隆，其质粒标记为PlXF。(16)构建宿主菌S17-1-IXF 将pIXF转化到E. coli S17-1当中，30摄氏度在氨苄青霉素平板筛选。得到宿主菌S17-1-IXF。(17)构建 FG-luxA-C、FC-luxB-K、FK-luxC-G、FG-luxD-C、FC-IuxE-K: 合成引物
GRGGGCATACGGGAAGAAGTG CFTCAACAGGGACACCAGGATTT CR:AGGGCGGGGCGTAAGG KFCGTTTCTGCGGACTGGC KR:CGCCTTCTTGACGAGTTCTTC GFGCCCCCGATGGTAGTGTG
IuxA、IuxB, IuxC, IuxD, IuxE的酶切片段来自于实施示例2当中。将FGC、FCK、FKG 分别在Fermentas Buffer Tango当中用DraIII酶切，同时加入FastAP去磷酸化。回收KiC片段，分别与luxA、IuxD片段连接；回收FCK片段，分别与luxB、IuxE片段连接；回收FKG片段，与IuxC片段连接。连接产物分别转化到DH5ci感受态当中，转化后 5种分别按如下方式涂布并筛选reC+luxA 庆大霉素+氯霉素平板；引物筛选GR+CF ； FGC+luxD 庆大霉素+氯霉素平板；引物筛选GR+CF ；FCK+luxB 氯霉素+卡纳霉素平板；引物筛选CR+KF ；FCK+luxE 氯霉素+卡纳霉素平板；引物筛选CR+KF ；FKG+luxC 卡纳霉素+庆大霉素平板；引物筛选KR+GF。验证正确的质粒分别标记为fG-luxA-C、 FG-luxD-C、FC-luxB-K、FC-luxE-K、FK-luxC-G。将这些质粒分别转化到宿主菌 S17-1IXF 中，得到 5 中菌S17-1IXF(FG-IuxA-C)、S17-1IXF(FG-luxD-C)、S17-1IXF(FC-luxB-K)、 S17-1IXF(FC-IuxE-K)、S17-1IXF(FK-luxC-G)。(18)并行组装 a)第一轮
将 S17-IIXF (FG-IuxA-C)和 S17-1IXF (FC-IuxB-K)两种菌液各 2mL，分别析离心下来， 用500 μ L无抗生素LB培养基重悬；重复一次。将第二次重悬的两种菌液混合在一起，在30 摄氏度培养4个小时。4小时后，将混合菌液在庆大霉素+卡那霉素LB平板上划线。培养至可见单克隆。挑取单克隆，在氯霉素LB平板划线负筛，筛选其中不能在氯霉素中生长的克隆。标记为 S17-lIXF(FG-luxAluxB-K)。将S17-1IXF (FK-luxC-G)和 S17-1IXF (FG-luxD-C)两种菌液各 2mL，分别析离心下来，用500 μ L无抗生素LB培养基重悬；重复一次。将第二次重悬的两种菌液混合在一起， 在30摄氏度培养4个小时。4小时后，将混合菌液在卡那霉素+氯霉素LB平板上划线。培养至可见单克隆。挑取单克隆，在庆大霉素LB平板划线负筛，筛选其中不能在庆大霉素中生长的克隆。标记为 S17-lIXF(FK-luxCluxD-C)。b)将 S17-lIXF(FG-luxAluxB-K)和 S17-1IXF (FK-luxCluxD-C)两种菌液各 ^nL, 分别析离心下来，用500 μ L无抗生素LB培养基重悬；重复一次。将第二次重悬的两种菌液混合在一起，在30摄氏度培养4个小时。4小时后，将混合菌液在庆大霉素+氯霉素LB平板上划线。培养至可见单克隆。挑取单克隆，在卡那霉素LB平板划线负筛，筛选其中不能在卡那霉素中生长的克隆。标记为S17-lIXF(re-luxAluxBluxCluxD-C)。c)将 S17-lIXF(FG-luxAluxBluxCluxD-C)和 S17-1IXF(FC-luxE-K)两种菌液各 2mL,分别析离心下来，用500 μ L无抗生素LB培养基重悬；重复一次。将第二次重悬的两种菌液混合在一起，在30摄氏度培养4个小时。4小时后，将混合菌液在庆大霉素+卡纳霉素 LB平板上划线。培养至可见单克隆。挑取单克隆，在氯霉素LB平板划线负筛，筛选其中不能在氯霉素中生长的克隆。标记为S17-lIXF(re-luxAluxBluxCluxDluxE-K)。实施例4线形无宿主无回收系统。(1)全基因合成SopAB (连接在pQLV中)，序列为GGATCC[AF064539. 124970-22120]CTAGC
(2)构造线性辅助质粒pIXSop:将实施例3中的pIXFCl在i^ermentas Tango Buffer中用BamHI和NheI双切，同时加入!^astAP去磷酸化。酶切产物用溶液回收。将合成的SopAB 质粒在Fermentas Tango Buffer中用BamHI和NheI双切，胶回收其中约2. 9Kbp的片段。 将两个片段用T4 DNA连接酶连接，连接产物转化到大肠杆菌DH5 α感受态当中，转化后涂布在氨苄青霉素平板，在30摄氏度培养。挑取6个长出来的克隆，培养菌液提取质粒，酶切验证筛选其中用BamHI和NheI双切能产生约5. IKbp和2. 9Kbp的质粒。正确的质粒标记为 pIXSopCl。在Fermentas R Buffer中将pIXSopCl用HindIII酶切，溶液回收后自连。连接产物转化到大肠杆菌DH5 α感受态当中，转化后涂布在氨苄青霉素平板，在30摄氏度培养。长出来的克隆用引物 C1F:ACCTGACCGCTATCCCTGA 和 C1R:GCCCTTCAATCGCCAGA 菌落 PCR 验证，筛选取其中能得到约250bp片段的克隆，其质粒标记为pIXSop。
(3)构建宿主菌S17-l-IXSop 将pIXSop转化到E. coll S17-1当中，30摄氏度在氨苄青霉素平板筛选。得到宿主菌S17-1- IXSop0(4)构建线形无宿主无回收单元载体pJAU-0C来自于Lucigen。在!^ermentas Seal Buffer中用XbaI和PacI对pJAZZ-OC进行双酶切。回收其中IOKbp和0. 5Kbp的片段。在 Fermentas Seal Buffer 中用 NheI 和 PacI 分别对实施例 3 中的 pUC-GC、pUC-KC、 pUC-CG、pUC-KG、pUC-CK、pUC-GK 进行双酶切，分别用胶回收其中 2. lKbp、2. 5Kbp、2. IKbp, 2. 3Kbp、2. 5Kbp、2. 3Kbp的片段。回收的片段分别于pJAU_0C酶切产物中回收的两个片段相连接。连接产物分别转化到TSA感受态当中(来自Lucigen)，涂布在如下平板上进行培养和筛选:AGC:氨苄青霉素+庆大霉素+氯霉素平板；AKC:氨苄青霉素+卡纳霉素+氯霉素平板；ACG:氨苄青霉素+氯霉素+庆大霉素平板；AKG:氨苄青霉素+卡纳霉素+庆大霉素平板；ACK:氨苄青霉素+氯霉素+卡纳霉素平板；AGK:氨苄青霉素+庆大霉素+卡纳霉素平板。分别挑取将长出来的克隆分别，培养并提取质粒，挑选其中大于IOKbp的质粒，并且在i^ermentas Buffer R当中用BioI和DraIII双酶切筛选其中能够酶切得到三条片段 (其中一条接近IKbP)的质粒。则挑选出的六种质粒分别标记为LGC、LKC、LCG、LKG、LCK、 LGK。(5)构建 LG-luxA-C、LC-luxB-K、LK-luxC-G、LG-luxD-C、LC-IuxE-K: IuxA, luxB、 luxC、luxD、IuxE的酶切片段来自于实施例2当中。将LGC、LCK、LKG分别在!^ermentas Buffer Tango当中用DraI11酶切，同时加入!^astAP去磷酸化。回收LGC片段，分别与luxA、 IuxD片段连接；回收LCK片段，分别与1UXB、1UXE片段连接；回收LKG片段，与IuxC片段连接。连接产物分别转化到S17-l-IXS0p感受态当中，转化后在30摄氏度培养，5种转化物分别按如下方式涂布和筛选LGC+luxA 庆大霉素+氯霉素平板；引物筛选GR+CF ；LGC+luxD 庆大霉素+氯霉素平板；引物筛选GR+CF ；LCK+luxB 氯霉素+卡纳霉素平板；引物筛选 CR+KF ；LCK+luxE 氯霉素+卡纳霉素平板；引物筛选CR+KF ；LKG+luxC 卡纳霉素+庆大霉素平板；引物筛选KR+GF。筛选用的引物序列为与实施例3中相同。验证正确的质粒分别标记为LG-luxA-C、LG-luxD-C、LC-luxB-K、LC-luxE-K、LK-luxC-G。含有这些质粒的宿主菌记为S17-lIXSop (FG-IuxA-C)、S17-1 IXSop (FG-luxD-C)、S17-1 IXSop (FC-luxB-K)、 S17-lIXSop (FC-IuxE-K)、S17-1 IXSop (!7K-IuxC-G)。(6)并行组装 a)第一轮:
将 S17-lIXSop (LG-luxA-C)和 S17_lIXSop (LC-luxB-K)两种菌液各 2mL，分别析离心下来，用500 μ L无抗生素LB培养基重悬；重复一次。将第二次重悬的两种菌液混合在一起，在30摄氏度培养4个小时。4小时后，将混合菌液在庆大霉素+卡那霉素LB平板上划线。培养至可见单克隆。挑取单克隆，在氯霉素LB平板划线负筛，筛选其中不能在氯霉素中生长的克隆。标记为S17-lIXSop (LG-luxAluxB-K)。将S17_lIXSop (LK-luxC-G)和 S17_lIXSop (LG-luxD-C)两种菌液各 ^iiL,分别析离心下来，用500 μ L无抗生素LB培养基重悬；重复一次。将第二次重悬的两种菌液混合在一起，在30摄氏度培养4个小时。4小时后，将混合菌液在卡那霉素+氯霉素LB平板上划线。培养至可见单克隆。挑取单克隆，在庆大霉素LB平板划线负筛，筛选其中不能在庆大霉素中生长的克隆。标记为S17-lIXSop (LK-luxCluxD-C)。
b)将 S17-lIXSop (LG-luxAluxB-K)和 S17_lIXSop (LK-luxCluxD-C)两种菌液各 2mL,分别析离心下来，用500 μ L无抗生素LB培养基重悬；重复一次。将第二次重悬的两种菌液混合在一起，在30摄氏度培养4个小时。4小时后，将混合菌液在庆大霉素+氯霉素 LB平板上划线。培养至可见单克隆。挑取单克隆，在卡那霉素LB平板划线负筛，筛选其中不能在卡那霉素中生长的克隆。标记为S17-lIXSop (LG-luxAluxBluxCluxD-C)。c)将 S17-1 IXSop (LG-luxAluxBluxCluxD-C)和 S17-1 IXSop (LC-IuxE-K)两种菌液各2mL，分别析离心下来，用500 μ L无抗生素LB培养基重悬；重复一次。将第二次重悬的两种菌液混合在一起，在30摄氏度培养4个小时。4小时后，将混合菌液在庆大霉素+ 卡纳霉素LB平板上划线。培养至可见单克隆。挑取单克隆，在氯霉素LB平板划线负筛，筛选其中不能在氯霉素中生长的克隆。标记为S17-lIXSop (LG-luxAluxBluxCluxDluxE-K) 实施例5体外重组反应实现组装。提取实施例4中的两种质粒LK-luXC-G、LG-luXD-C。将两种载体稀释到等摩尔浓度，各取4μ1，与2μ1的Invitrogen的LR Clonase II Enzyme Mix混合均勻，在25摄氏度反应1小时。转化到TSA感受态当中，涂布在卡那霉素和氯霉素的LB平板上培养。生长出来的克隆用庆大霉素负筛，取其中仅含有卡那霉素和氯霉素抗性的克隆。满足条件的克隆包含质粒LK-luxCluxD-C。此实施例证明组装重组可以在体外进行。本发明是一种多片段DNA组装的系统和方法。涉及不可逆反应的位点特异性重组、lambda red重组，线形质粒和线形基因组。不可逆反应的位点特异性重组以大肠杆菌Lambda噬菌体以及类似的噬菌体中的重组反应是在Int和IHF酶催化下，attB + attP attL + attR ；在Int、Xis和IHF酶催化下attL + attR attB + attP。这种类型的重组系统可以将环形质粒整合到染色体当中，并可以从染色体中回收。本发明当中环形单元载体的整合和筛选标记部分的切除、环形组装宿主、环形回收载体的整合和回收都利用了这个原理。本发明的特点
本发明中环形单元载体、环形组装宿主进行顺次组装过程与美国专利US7^7984有三点显著区别
1、US7267984是顺序组装方法，因此US7^7984不包确保组装的片段能够进一步组装的特征。2、US7267984并且也不包含进一步规范载体使组装过程简化的系统。3、US7267984的重组过程中顺序重组次序是先由两个拓扑重构位点反应使载体插入，然后再由反应端重组切出载体骨架使DNA相接；本专利描述过程可先由两个反应端反应直接使DNA相接，然后再通过拓扑重构位点反应切出载体骨架，也可以通过。
权利要求
1. 一种多段DNA并行组装的方法，其特征是 对待组装片段进行克隆，得到符合“广义单元载体”结构的单元载体； 根据单元载体的“组装职能”选出一系列含有不同待组装片段的广义单元载体，形成 “可组装队列”；对“可组装队列“进行“队列并行组装”； 具体步骤(1)首先，根据组装实施者的需要，将“待组装片段”克隆到“空单元载体”当中形成“单元载体”；取含有待组装片段的“单元载体”和其他“广义单元载体”构成至少一种“初始可组装队列”；然后，对“初始可组装队列”进行“队列并行组装”，直到形成的“可组装队列”中单元载体数量等于1 ；最后队列中所得的1个载体，包含按照组装实施者需要设计顺序排列的所有待组装片段的组装产物；并且，(2)组装若在细胞内发生，则所需的重组酶由“辅助质粒”表达；组装若在细胞外发生， 则所需的重组酶以蛋白形式直接加入；并且，(3)当“队列并行组装”需要时，组装过程中有“辅助质粒”、“组装宿主”、“回收载体”的辅助；所述“广义单元载体”包括“单元载体”和“组装宿主”；所述“单元载体”的结构特征如下“单元载体”结构具有以下2种可能性(1)一种是含有单重构位点“单元载体”，按序列顺序依次包括左臂、左反应端、待组装片段、右反应端、右臂、拓扑重构位点、接左臂；或者，(2)另一种是含有双重构位点单元载体，按序列顺序依次包括固定臂、回收重构位点、左臂、左反应端、待组装片段、右反应端、右臂、拓扑重构位点、接前述固定臂；所述“待组装片段”连接到“空单元载体”当中形成含有“待组装片段”的“单元载体”； 所述“组装宿主”是“待组装片段”长度为0的“单元载体”，具有如下结构特征固定臂、回收重构位点、左臂、左反应端和右反应端有至少其一、右臂、拓扑重构位点、接前述固定臂；所述“广义单元载体”具有如下特征(1)“广义单元载体”的“组装职能”类型的差别在于左反应端、右反应端、拓扑重构位点、回收重构位点的差别；并且，(2)“广义单元载体”有至少1种类型的“组装职能”； 并且，(3)不同种类型“组装职能”的“广义单元载体”的反应端和重构位点的选择要满足任何一种“组装职能”的“广义单元载体”，并且至少存在一种“组装职能”的“广义单元载体” 与其“互相匹配”；并且，(4)“广义单元载体”的“组装职能”的所有种类要满足对于任意数量待组装片段，至少存在一种“可组装队列”；所述“回收载体”的结构特征如下(1)“回收载体”具有回收重构位点、左反应端、右反应端、拓扑重构位点、接前述固定臂4个重组位点当中至少其中2个；并且，(2)“回收载体”与“匹配”的“广义单元载体”进行“载体置换”的目的产物仍然为“广义单元载体”；所述“待组装片段”，是组装实施者需要组装的片段；“待组装片段”的DNA序列，允许是任意不参与反应端、拓扑重构位点、回收重构位点的重组的，并且不参与复制子和筛选标记的筛选的DNA序列；所述待组装片段的“左反应端”和“右反应端”是具有发生重组能力的DNA序列；并且， 在“组装反应”中，同一个单元载体内的左反应端和右反应端不具有互相重组能力；并且，在 “组装反应”中，来自不同“组装职能”的“广义单元载体”的左反应端和右反应端重组后消失或者变为在该重组酶下没有重组活性的DNA序列；并且，“左反应端”和“右反应端”来自于空单元载体、或者来自于待组装片段；所述“拓扑重构位点”是序列特异性重组位点，或者是端粒酶位点，或者是相互断开的 2个端粒，并且在同一 “组装反应”中具有发生重组能力，并且在同一 “组装反应”中不具有与同一载体内的反应端或回收重构位点重组的能力；并且，当拓扑重构位点是相互断开的 2个端粒时，含有拓扑重构位点的载体DNA分子在拓扑结构上为线形；所述“回收重构位点”是在“组装反应”中具有发生重组能力的DNA序列，并且在同一 “组装反应”中不具有与同一载体内的任何反应端重组的能力，并且同一“组装反应”中不具有与同一载体内的拓扑重构位点重组的能力；所述“固定臂”、“左臂”、“右臂”，是任意在“组装反应”中不具有与反应端、拓扑重构位点、回收重构位点重组能力的DNA序列，其中包括至少一个复制子和至少一个筛选标记； 所述“置换臂”，是任意不参与反应端、拓扑重构位点、回收重构位点的重组的DNA序列；所述“回收载体”与“广义单元载体”的“位点匹配”具有如下3点特征(1)“回收载体”包含的重组位点中与“广义单元载体”的回收重构位点、左反应端、右反应端、拓扑重构位点重组位点当中至少2个具有发生重组的能力；并且，(2)“回收载体”与“广义单元载体”发生“载体置换”之后的目的产物符合“广义单元载体”的结构特征，并且具有区别于反应前的筛选特征；所述“回收载体”与“广义单元载体”的“载体置换”定义包括如下2个反应的 (1) “回收载体”与“广义单元载体”回收重构位点、左反应端、右反应端、拓扑重构位点 4个重组位点当中至少具有其中2个发生重组；所述“载体置换”的目的产物是“载体置换”反应后，得到反应物当中“广义单元载体” 的“待组装片段”的、并且符合“广义单元载体”特征的载体；所述“广义单元载体”的“互相匹配”定义为同时满足以下三个条件(1)满足反应端匹配2个单元载体，或者至多其中2个单元载体经过“载体置换”之后，其中一个单元载体的右反应端具有与另一个单元载体的左反应端重组的能力，或者其中一个单元载体的左反应端具有与另一个单元载体的右反应端重组的能力；上述两种情况在同一种酶催化下不同时发生；该重组定义为“反应端匹配重组”；并且，(2)满足重构位点匹配2个单元载体本身，或者至多其中两者单元载体经过“载体置换”之后，在同一种酶催化下，其中一个单元载体与另一个单元载体的拓扑重构位点具有重组能力，或者其中一个单元载体与另一个单元载体的拓扑重构位点同时为断开的端粒形式，或者其中一个单元载体与另一个单元载体的回收重构位点具有重组能力；上述三种情况在同一种酶催化下不同时发生；该重组定义为“重构位点匹配重组”；并且，(3)满足筛选特征匹配互相匹配的2个单元载体本身，或者至多其中两者单元载体经过“载体置换”之后，单元载体之间进行组装的每一步重组产物，都有区别于过反应前体的筛选特征变化；所述“匹配单元载体对”定义为满足“互相匹配”关系的2个“广义单元载体”；所述“组装反应”是“互相匹配”的2个“广义单元载体”之间发生的重组反应，其特征如下(1)在“互相匹配”需要的情况下先与“回收载体”进行所需的“载体置换”，然后发生 “反应端匹配重组”和“重构位点匹配重组” 2个重组；并且，(2)“组装反应”产物是重组反应产物当中含有其2个“广义单元载体”前体中所包含的所有待组装片段的载体；根据所述单元载体的结构，“组装反应”的产物，满足单元载体的定义，仍称为“单元载体”，具有继续与匹配的“广义单元载体”发生组装反应的能力；所述“可组装队列”是由“广义单元载体”构成的队列；并且满足当队列中“广义单元载体”数量为2N或者2N+1，且N为非负整数，队列中可挑选出不超过N个互不共用“广义单元载体”的“匹配单元载体对”，这不超过N个的“匹配单元载体对”发生“组装反应”后得到的“广义单元载体”替代原队列中的这些“匹配单元载体对”，得到的队列，仍然符合“可组装队列”的条件；所述“初始可组装队列”是一个“可组装队列”，由含有“待组装片段”的单元载体和“组装宿主”构成；并且，队列中含有“待组装片段”的“单元载体”的数量与所需组装的片段的数量一致，并且，每个“单元载体”含有一个待组装片段；并且，队列中的单元载体所含的待组装片段的顺序与组装实施者的目的组装顺序一致；所述“队列并行组装”定义为如下过程根据前述定义，在“广义单元载体”数量为2N或者2N+1 (N为非负整数)的“可组装队列，，中存在的不超过N个互不共用单元载体的“匹配单元载体对”，使这不超过N个“匹配单元载体对”同时并行进行“组装反应”，并用每个“匹配单元载体对”的“组装反应”产物或“宿主中间体”替代原“匹配单元载体对”；广义单元载体(1)所述“广义单元载体”的“组装职能”的所有种类进一步满足对于任意数量的“待组装片段”，至少存在一种“匹配组装队列”；并且，(2)通过挑选“匹配”的“广义单元载体”，使所述“初始可组装队列”满足“匹配组装队列”的要求；并且，(3)对满足“匹配组装队列”要求的“初始可组装队列”进行“队列并行匹配组装”；所述“匹配组装队列”是满足以下2个条件的“可组装队列”(1)当队列中“广义单元载体”数量为2N或者2N+1，且N为非负整数，则队列中存在N 个互不共用“广义单元载体”的“匹配单元载体对”；并且，(2)用前述N个“匹配单元载体对”发生“组装反应”后得到的“广义单元载体”替代原队列中的这些“匹配单元载体对”，得到的队列，仍然符合“匹配组装队列”的条件；所述“队列并行匹配组装”定义为如下过程根据前述定义，在“广义单元载体”数量为 2N或者2N+1，且N为非负整数的“匹配组装队列”中存在的N个互不共用“广义单元载体” 的“匹配单元载体对”，使这N个“匹配单元载体对”同时并行进行“组装反应”，并用每个“匹配单元载体对”的“组装反应”产物替代原“匹配单元载体对”；第一种筛选标记(1)筛选标记有至少1种，每种“单元载体”的左臂或右臂之一带有筛选标记；并且，(2)“组装反应”发生时，在“组装宿主”所在的细胞中，“单元载体”不具有复制能力； 并且，“组装宿主”为染色体；并且，回收载体在特定辅助质粒存在时具有在组装宿主中复制的能力；并且，(3)“单元载体”和“组装宿主”发生“反应端匹配重组”、“重构位点匹配重组”的其中一组后，利用“单元载体”的筛选标记筛选到中间体进行筛选含有单元载体的筛选标记的中间产物；中间产物再发生“反应端匹配重组”、“重构位点匹配重组”的其中的另一组后，利用 “单元载体”所带的筛选标记的丢失筛选“组装反应”产物；并且，(4)“载体置换”目的产物的筛选“广义单元载体”和“回收载体”发生“载体置换”反应的2个重组的其中一个后，利用“回收载体”的筛选标记筛选到中间体；中间体再发生“载体置换”反应的2个重组的其中的另一个，利用“回收载体”在特定复制蛋白下可复制筛选到“载体置换”产物；并且，(5)“辅助质粒”为温度敏感性载体；并且，在每一步重组前将辅助质粒转化到宿主细胞；并且，在每一步重组后在“辅助质粒”不具有复制能力的温度下培养，将辅助质粒从宿主细胞中去除；第二种筛选标记(1)筛选标记有至少2种，每种“组装职能”的“单元载体”的左臂或右臂各带有一种筛选标记，且两臂所带有的筛选标记互不相同；并且，“组装反应”发生时，在“组装宿主”所在的宿主细胞中，“单元载体”不具有复制能力；并且，“组装宿主”为染色体，有至少2种不同“组装职能”的组装宿主，每种含有一种不同的筛选标记；并且，“回收载体”在含有其复制所需的复制蛋白的“辅助质粒”存在时具有在宿主细胞中复制的能力；(2)“单元载体”和“广义单元载体”发生“组装反应”后，禾Ij用“广义单元载体”所带的筛选标记的被“单元载体”的筛选标记替换来筛选“组装反应”产物；(3)“广义单元载体”和“回收载体”发生“载体置换”反应的2个重组的其中一个后， 利用“回收载体”和“广义单元载体” 2个筛选标记筛选到“载体置换”产物；第三种筛选标记(1)筛选标记有至少3种，每种“单元载体”的左臂和右臂各带有一种筛选标记，且两臂所带有的筛选标记互不相同；并且，(2)“组装反应”所包含的2个重组同时进行；并且，“组装反应”的目的产物含有不同于其2个“单元载体”前前体的筛选标记组合，使该产物具有通过这种筛选标记组合从重组产物、副产物和未发生反应的单元载体的混合物种筛选出来的操作性；并且，(3)组装过程不需要“回收载体”和“组装宿主”；并且，(4)“辅助质粒”同时表达“组装反应”包含的2个反应所需的2个重组酶；反应端、回收重构位点、拓扑重构位点所述反应端、回收重构位点、拓扑重构位点为frt，IoxP, Lambda噬菌体的重组位 attB, attBl, attB2, attB3, attB4, attB5, attP, attPl, attP2 attP3, attP4, attP5, attL, attLl, attL2, attL3, attL4, attL5, attR, attRl, attR2, attR3, attR4, attR5，HK022噬菌体的重组位点attB, attP, attL, attR, phi80噬菌体的重组位点 attB, attP, attL, attR, P21 噬菌体的重组位点 attB, attP, attL, attR, P22 噬菌体的重组位点attB，attP, attL, attR ；所述反应端为lambda red重组所需的同源序列；端粒酶识别位点端粒酶识别位点或端粒为原核生物的端粒酶的识别位点或端粒，包括Enterobacteria phage N15、Vibrio phage VP882、Klebsiella phage phiK02、Yersinia phage PY54 等的端粒酶识别位点；端粒也为真核生物染色体的端粒；单元载体、组装宿主、回收载体所述单元载体、组装宿主、回收载体为原核生物或者真核生物的质粒、也为原核生物或者真核生物的基因组；单元载体、回收载体的转化位点所述单元载体、回收载体当中含有接合转化位点，且组装宿主微生物具备接合转化能力时，不需要宿主细胞外的分子操作；所述单元载体、回收载体当中不含有接合转化位点， 或且宿主微生物不具备接合转化能力时，需要有宿主细胞外的分子操作；重组位点重组酶当在细胞外使用重组位点的重组酶时，IoxP对应Cre重组酶，frt对应FLP重组酶， Lambda噬菌体的BP重组对应Lambda Int和IHF，Lambda噬菌体的BP重组对应Lambda Int、 Xis和IHF，，=HK022噬菌体的BP重组对应HK022 Int和IHF，HK022噬菌体的BP重组对应HK022 Int.Xis和IHF，phi80噬菌体的BP重组对应phi80 Int和IHF，phi80噬菌体的BP 重组对应phi80 Int.Xis和IHF，P21噬菌体的BP重组对应P21 Int和IHF，P21噬菌体的 BP重组对应P21 Int.Xis和IHF, P22噬菌体的BP重组对应P22 Int和IHF, P22噬菌体的 BP重组对应P22 Int. Xis和IHF，组装过程中的重组反应具有在细胞外进行的能力； 其中两个线形载体重组后的单侧端粒发生交换，视为在端粒位点发生了一次重组，因为此过程等效于环形载体的两次重组；例如线形载体A和B端粒标记为T，左右两个端粒分别用 L和R区分，在载体中X和Y之间发生重组，如下
全文摘要
本发明涉及的是一种多段DNA并行组装的方法。选择利用环形或线形单元载体置入到环形宿主或线形宿主，形成基因载体，再通过回收环形或线形载体，得到重组后的DNA遗传物质。其特点是，能够实现多段DNA的并行同时操作，从而提高DNA组装形成新的DNA结构的效率，并且防止DNA污染和歧化，保证组装后DNA的质量，使之达到设计目的。组装多段DNA所需时间与log(N)近似成正比。组装操作在细胞外或者细胞内进行，使多段DNA分子能够按照任意顺序拼接形成新的DNA结构体。适宜在遗传工程领域基因重组获得新的生物体中应用。
文档编号C12N15/66GK102296059SQ20111023591
公开日2011年12月28日 申请日期2011年8月17日 优先权日2011年8月17日
发明者石振宇 申请人:石振宇