专利名称：烈性传染病病毒检测试剂盒及检测方法
烈性传染病病毒检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种烈性传染病病菌检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
烈性传染病病毒可引发人类感染性疾病，有较高的死亡率，包括汉坦病毒、西尼罗病毒、黄热病病毒、克里米亚-刚果热病毒、拉萨病毒、裂谷热病毒、马尔堡病毒、埃博拉病毒。对烈性传染病病毒的检测对于人类感染性疾病诊断及防治是至关重要的。传统的烈性传染病病毒的检测，主要是采用细菌培养的方法，这种方法检测结果较准确，但是耗费时间长，操作步骤繁琐；此外，还可以采用实时荧光PCR法检测，此方法特异性强，但是一次实验只能检测一种病原目标物，同时检测大量的病原菌则不能很好地应付。但是，这两种方法在检测多种烈性传染病病毒时，往往需要耗费较长的时间，这也延误了诊断和治疗的最佳时机。
发明内容基于此，有必要提供一种可以在短时间内检测多种烈性传染病病毒的烈性传染病病毒检测试剂盒及采用上述烈性传染病病毒检测试剂盒的烈性传染病病毒检测方法。一种烈性传染病病毒检测试剂盒，包括选自如下8组引物中的至少一种第1组引物用于扩增汉坦病毒的如SEQ ID NO. 1所示的核酸片段；第2组引物用于扩增西尼罗病毒的如SEQ ID NO. 2所示的核酸片段；第3组引物用于扩增黄热病病毒的如SEQ ID NO. 3所示的核酸片段；第4组引物用于扩增克里米亚-刚果热病毒的如SEQ ID NO. 4所示的核酸片段；第5组引物用于扩增拉萨病毒的如SEQ ID NO. 5所示的核酸片段；第6组引物用于扩增马尔堡病毒的如SEQ ID N0. 6所示的核酸片段；第7组引物用于扩增裂谷热病毒的如SEQ ID N0. 7所示的核酸片段；第8组引物用于扩增埃博拉病毒的如SEQ ID N0. 8所示的核酸片段。优选的，所述第1组引物上游引物序列如SEQ ID N0. 9所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 17 所示；所述第2组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 10所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 18所示；所述第3组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 11所示，下游引物序列如SEQID N0. 19所示；所述第4组引物上游引物序列如SEQ ID N0. 12所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 20所示；所述第5组引物上游引物序列如SEQ ID N0. 13所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 21所示；
所述第6组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 14所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 22所示；所述第7组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 15所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 23所示；所述第8组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 16所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 24所示。优选的，还包括检测探针，所述检测探针为如下8个与所述8组引物对应的核酸片段至少一种第1个检测探针与如SEQ ID NO. 1所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID N0. 25所示；第2个检测探针与如SEQ ID N0. 2所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID N0. 26所示；第3个检测探针与如SEQ ID N0. 3所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID N0. 27所示；第4个检测探针与如SEQ ID N0. 3所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID N0. 28所示；第5个检测探针与如SEQ ID N0. 4所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID N0. 29所示；第6个检测探针与如SEQ ID N0. 5所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID N0. 30所示；第7个检测探针与如SEQ ID N0. 6所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID N0. 31所示；第8个检测探针与如SEQ ID N0. 7所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID N0. 32所示。优选的，还包括固相载体，所述固相载体包括基体和固定在所述基体上的附着层， 所述检测探针固定在所述附着层上。优选的，所述检测探针的5’端连接有15个胸腺嘧啶。优选的，还包括阳性质控探针以及与所述阳性质控探针互补的阳性检测探针；所述阳性质控探针序列如SEQ ID N0. 33所示，所述阳性检测探针的序列如SEQ ID N0. 34所示。一种烈性传染病病毒的检测方法，包括下述步骤步骤一、提取待测样品中的核酸；步骤二、扩增待测样品中的核酸得到核酸片段，所述核酸片段为如下核酸片段中的至少一种汉坦病毒的如SEQ ID NO. 1所示的核酸片段；西尼罗病毒的如SEQ ID N0. 2所示的核酸片段；黄热病病毒的如SEQ ID N0. 3所示的核酸片段；克里米亚-刚果热病毒的如SEQ ID N0. 4所示的核酸片段；拉萨病毒的如SEQ ID N0. 5所示的核酸片段；
马尔堡病毒的如SEQ ID NO. 6所示的核酸片段裂谷热病毒的如SEQ ID NO. 7所示的核酸片段埃博拉病毒的如SEQ ID NO. 8所示的核酸片段步骤三、用检测探针进行检测，所述检测探针与步骤二扩增产物中的一种特异性杂交。优选的，步骤二使用如下8组寡核苷酸片段的至少一组作为引物进行扩增所述第1组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 9所示，下游引物序列如SEQID NO. 17所示；所述第2组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 10所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 18所示；所述第3组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 11所示，下游引物序列如SEQID N0. 19所示；所述第4组引物上游引物序列如SEQ ID N0. 12所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 20所示；所述第5组引物上游引物序列如SEQ ID N0. 13所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 21所示；所述第6组引物上游引物序列如SEQ ID N0. 14所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 22所示；所述第7组引物上游引物序列如SEQ ID N0. 15所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 23所示；所述第8组引物上游引物序列如SEQ ID N0. 16所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 24所示。优选的，步骤三中所述检测探针为具有如下序列的8个核酸片断中的至少一个第1个检测探针与如SEQ ID NO. 1所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID N0. 25所示；第2个检测探针与如SEQ ID N0. 26所示；第3个检测探针与如SEQ ID N0. 27所示；第4个检测探针与如SEQ ID N0. 28所示；第5个检测探针与如SEQ ID N0. 29所示；第6个检测探针与如SEQ ID N0. 30所示；第7个检测探针与如SEQ ID N0. 31所示；第8个检测探针与如SEQ ID N0. 32所示。
N0. 2所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID N0. 3所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID N0. 3所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID N0. 4所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID N0. 5所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID N0. 6所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID N0. 7所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID
优选的，步骤三中所述检测探针与所述扩增产物的杂交在固相载体上进行；所述固相载体包括基体和固定在所述基体上的附着层，所述检测探针固定在所述
附着层上。根据烈性传染病病毒的基因保守区设计扩增引物和检测探针，提取待测样品中的核酸片段并通过扩增引物进行扩增，最后使用检测探针与扩增产物进行特异性结合，检测样品中是否含有待检测的烈性传染病病毒，采用这种试剂盒的检测方法检测时间短且灵敏度高，具有很强的实用性。
图1为一实施方式的烈性传染病病毒的检测方法的流程图；图2为汉坦病毒样品核酸提取后扩增产物的电泳图；图3为一实施方式的烈性传染病病毒的检测点阵示意图；图4为图3示检测点阵检测汉坦病毒的检测结果示意图。
具体实施方式下面主要结合附图和实施例对烈性传染病病毒检测试剂盒及检测方法做进一步的解释说明。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1设计和制备引物、检测探针通过对常见的8种烈性传染病病毒基因序列进行分析，选择相对保守的序列为靶向扩增序列，并根据该靶向扩增序列设计用于扩增该靶向扩增序列的扩增引物和与该靶向扩增序列特异性结合的检测探针。8个靶向扩增序列及其对应的8组扩增引物和8个检测探针如下所示第1个靶向扩增序列为汉坦病毒的如SEQ ID NO. 1所示的核酸片段，对应的上游引物序列如SEQ ID NO. 9所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 17所示，检测探针序列如SEQ ID NO. 25 所示。第2个靶向扩增序列为西尼罗病毒的如SEQ ID NO. 2所示的核酸片段，对应的上游引物序列如SEQ ID NO. 10所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 18所示，检测探针序列如 SEQ ID N0. 26 所示。第3个靶向扩增序列为黄热病病毒的如SEQ ID N0. 3所示的核酸片段，对应的上游引物序列如SEQ ID NO. 11所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 19所示，检测探针序列如 SEQ ID N0. 27 所示。第4个靶向扩增序列为克里米亚-刚果热病毒的如SEQ ID N0. 4所示的核酸片段， 对应的上游引物序列如SEQ ID N0. 12所示，下游引物序列如SEQ IDN0. 20所示，检测探针序列如SEQ ID N0. 28所示。第5个靶向扩增序列为拉萨病毒的如SEQ ID N0. 5所示的核酸片段，对应的上游引物序列如SEQ ID N0. 13所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 21所示，检测探针序列如SEQID NO. 29 所示。第6个靶向扩增序列为马尔堡病毒的如SEQ ID NO. 6所示的核酸片段，对应的上游引物序列如SEQ ID NO. 14所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 22所示，检测探针序列如 SEQ ID NO. 30 所示。第7个靶向扩增序列为裂谷热病毒的如SEQ ID N0. 7所示的核酸片段，对应的上游引物序列如SEQ ID N0. 15所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 23所示，检测探针序列如 SEQ ID N0. 31 所示。第8个靶向扩增序列为埃博拉病毒的如SEQ ID N0. 8所示的核酸片段，对应的上游引物序列如SEQ ID N0. 16所示，下游引物序列如SEQ ID NO. M所示，检测探针序列如 SEQ ID N0. 32 所示。8个下游引物5’端标记有生物素，用于后续的显色反应。8个检测探针5’端连接有15个胸腺嘧啶(T)，使得检测探针能够更好的伸展开来， 利于检测探针和扩增产物的杂交。上述引物和探针通过上海生物工程公司合成。实施例2烈性传染病病毒检测试剂盒及检测方法检测试剂盒包括上述8组引物和8个探针。在其他的实施方式中，检测试剂盒可以包括上述8组引物和8个探针中任意一种或几种。含有的引物和探针组合愈多，可以检测的相应的病毒种类愈多。本实施例中的检测试剂盒包括上述8组引物和8个探针。在优选的实施例中，检测试剂盒还包括阳性质控探针以及与阳性质控探针互补的阳性检测探针；阳性质控探针的序列如SEQ ID N0. 33所示，阳性检测探针的序列如SEQ ID N0. 34所示。如图1所示的烈性传染病病毒的检测方法包括如下步骤S10、提取待测样品中的核酸核酸提取采用北京天恩泽基因科技有限公司的柱式病毒RNAOUT提取试剂盒提取 (产品编号71001-50)。使用方法具体可以为1、对于液体病毒样品在1. 5mL离心管中加入0. 1 0. 2mL液体病毒样品。如果病毒需要富集，可以将1. 5mL液体在4°C 24，000g冷冻离心60min，移弃1. 3mL后剩下的0. 2mL
用于下一步处理。对于拭子样品将一个拭子放入离心管中，加入ImL自备的生理盐水，振荡器上充分振荡半分钟，然后转移0. 2mL到1. 5mL塑料离心管中，用于下一步处理。2、加入0. 6mL裂解液到第一步得到的0. 2mL样品中，振荡30秒混勻后室温放置10 分钟。其中，裂解液在4°C放置后可能会产生沉淀，使用前必须放在65°C水浴使沉淀彻底溶解并充分摇勻后再取用。3、12，OOOrpm离心30秒，将500 μ L溶液转移到离心吸附柱中，室温放置2分钟。4、12，OOOrpm室温离心1分钟，弃含穿透液的收集管，把离心吸附柱放入到一个新的收集管中。穿透液为离心后甩到收集管中的液体。
5、步骤3后，将2中剩余溶液短暂离心后全部转移到离心吸附柱中，室温放置2分钟。6、12，OOOrpm室温离心1分钟，弃含穿透液的收集管，把离心吸附柱放入到一个新
的收集管中。7、加入0. 7mL通用洗柱液到离心吸附柱中，12，OOOrpm室温离心1分钟，弃含穿透液的收集管，把离心吸附柱放入到一个自备的RNase-free的1. 5mL离心管中。8、12，OOOrpm室温离心1分钟，弃含穿透液的离心管。9、将离心吸附柱套入到一个新的自备的RNase-free的1. 5mL离心管中，在离心吸附柱滤膜的中部加入30 100 μ L的RNA洗脱液，然后室温放置2分钟。 RNA。 S20、扩增待测样品中的核酸得到核酸片段 采用常规扩增体系，以50 μ L的扩增体系为例，扩增体系如下
50 μΜ的引物 各1uL
模板RNA 5 uL
IOmM d-NTPs 1uL
10 χ PCR buffer 1uL
25mM MgCl2 3uL
5U/uL的DNA聚合酶 0.75uL 10U/uL的AMV反转录酶 0.25uL无菌水补足至50 μ L即可。
置于PCR反应仪内，反应条件为
权利要求
1.一种烈性传染病病毒检测试剂盒，其特征在于，包括选自如下8组引物中的至少一种第1组引物用于扩增汉坦病毒的如SEQ ID NO. 1所示的核酸片段； 第2组引物用于扩增西尼罗病毒的如SEQ ID NO. 2所示的核酸片段； 第3组引物用于扩增黄热病病毒的如SEQ ID NO. 3所示的核酸片段； 第4组引物用于扩增克里米亚-刚果热病毒的如SEQ ID NO. 4所示的核酸片段； 第5组引物用于扩增拉萨病毒的如SEQ ID NO. 5所示的核酸片段； 第6组引物用于扩增马尔堡病毒的如SEQ ID NO. 6所示的核酸片段； 第7组引物用于扩增裂谷热病毒的如SEQ ID NO. 7所示的核酸片段； 第8组引物用于扩增埃博拉病毒的如SEQ ID NO. 8所示的核酸片段。
2.如权利要求1所述的烈性传染病病毒检测试剂盒，其特征在于，所述第1组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 9所示，下游引物序列如SEQID NO. 17所示；所述第2组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 10所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 18 所示；所述第3组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 11所示，下游引物序列如SEQID NO. 19 所示；所述第4组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 12所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 20 所示；所述第5组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 13所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 21 所示；所述第6组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 14所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 22 所示；所述第7组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 15所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 23 所示；所述第8组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 16所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 24 所示。
3.如权利要求1或2所述的烈性传染病病毒检测试剂盒，其特征在于，还包括检测探针，所述检测探针为如下8个与所述8组引物对应的核酸片段至少一种第1个检测探针与如SEQ ID NO. 1所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID NO. 25 所示；第2个检测探针与如SEQ ID NO. 2所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID NO. 26 所示；第3个检测探针与如SEQ ID NO. 3所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID NO. 27 所示；第4个检测探针与如SEQ ID NO. 3所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID NO. 28 所示；第5个检测探针与如SEQ ID NO. 4所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID NO. 29 所示；第6个检测探针与如SEQ ID NO. 5所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID NO. 30 所示；第7个检测探针与如SEQ ID NO. 6所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID NO. 31 所示；第8个检测探针与如SEQ ID NO. 7所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID NO. 32 所示。
4.如权利要求3所述的烈性传染病病毒检测试剂盒，其特征在于，还包括固相载体，所述固相载体包括基体和固定在所述基体上的附着层，所述检测探针固定在所述附着层上。
5.如权利要求3所述的烈性传染病病毒检测试剂盒，其特征在于，所述检测探针的5’ 端连接有15个胸腺嘧啶。
6.如权利要求1所述的烈性传染病病毒检测试剂盒，其特征在于，还包括阳性质控探针以及与所述阳性质控探针互补的阳性检测探针；所述阳性质控探针序列如SEQ ID NO. 33所示，所述阳性检测探针的序列如SEQ ID NO. 34所示。
7.一种烈性传染病病毒的检测方法，其特征在于，包括下述步骤 步骤一、提取待测样品中的核酸；步骤二、扩增待测样品中的核酸得到核酸片段，所述核酸片段为如下核酸片段中的至少一种汉坦病毒的如SEQ ID NO. 1所示的核酸片段； 西尼罗病毒的如SEQ ID NO. 2所示的核酸片段； 黄热病病毒的如SEQ ID NO. 3所示的核酸片段； 克里米亚-刚果热病毒的如SEQ ID NO. 4所示的核酸片段； 拉萨病毒的如SEQ ID NO. 5所示的核酸片段； 马尔堡病毒的如SEQ ID NO. 6所示的核酸片段； 裂谷热病毒的如SEQ ID NO. 7所示的核酸片段； 埃博拉病毒的如SEQ ID NO. 8所示的核酸片段；步骤三、用检测探针进行检测，所述检测探针与步骤二扩增产物中的一种特异性杂交。
8.如权利要求7所述的烈性传染病病毒的检测方法，其特征在于，步骤二使用如下8组寡核苷酸片段的至少一组作为引物进行扩增所述第1组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 9所示，下游引物序列如SEQID NO. 17所示；所述第2组引物所示；所述第3组引物所示；所述第4组引物所示；所述第5组引物所示；上游引物序列如SEQ ID NO. 10所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 18 上游引物序列如SEQ ID NO. 11所示，下游引物序列如SEQID NO. 19 上游引物序列如SEQ ID NO. 12所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 20 上游引物序列如SEQ ID NO. 13所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 21所述第6组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 14所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 22 所示；所述第7组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 15所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 23 所示；所述第8组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 16所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 24 所示。
9.如权利要求7所述的烈性传染病病毒的检测方法，其特征在于，步骤三中所述检测探针为具有如下序列的8个核酸片断中的至少一个第1个检测探针与如SEQ ID NO. 1所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID NO. 25 所示；第2个检测探针与如SEQ ID NO. 2所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID NO. 26 所示；第3个检测探针与如SEQ ID NO. 3所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID NO. 27 所示；第4个检测探针与如SEQ ID NO. 3所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID NO. 28 所示；第5个检测探针与如SEQ ID NO. 4所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID NO. 29 所示；第6个检测探针与如SEQ ID NO. 5所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID NO. 30 所示；第7个检测探针与如SEQ ID NO. 6所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID NO. 31 所示；第8个检测探针与如SEQ ID NO. 7所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID NO. 32 所示。
10.如权利要求7 9中任一项所述的烈性传染病病毒的检测方法，其特征在于，步骤三中所述检测探针与所述扩增产物的杂交在固相载体上进行；所述固相载体包括基体和固定在所述基体上的附着层，所述检测探针固定在所述附着层上。
全文摘要
本发明涉及一种烈性传染病病毒检测试剂盒同时提供一种采用该试剂盒的烈性传染病病毒检测方法。试剂盒包括根据烈性传染病病毒的基因保守区设计的扩增引物和检测探针，提取待测样品中的核酸片段并通过扩增引物进行扩增，最后使用检测探针与扩增产物进行特异性结合，检测样品中是否含有待检测的烈性传染病病毒，采用这种试剂盒的检测方法检测时间短且灵敏度高，具有很强的实用性。
文档编号C12Q1/68GK102277452SQ20111023797
公开日2011年12月14日 申请日期2011年8月18日 优先权日2011年8月18日 公开号201110237977.发明者刘春晓, 史蕾, 孙秋香, 季明辉, 徐云庆, 徐华, 李永进, 杨燕秋, 欧青叶, 谈书勤, 赵纯中, 顾大勇 申请人:深圳博尔美生物科技有限公司, 深圳国际旅行卫生保健中心