专利名称：一种过氧化物酶-纳米磁铁颗粒功能材料的合成方法
技术领域：
本发明属于精细化工清洁生产领域，具体涉及一种过氧化物酶-纳米磁铁颗粒功能材料的合成方法，该过氧化物酶-纳米磁铁颗粒功能材料可用于工业废水处理和污染修复领域。
背景技术：
过氧化物酶一般由植物或真菌分泌一类重要的细胞体外酶。它们具有较高的氧化还原电位，广谱的底物范围，能够降解多种污染物。它们在污染治理、环境修复上有独特的优势和广阔的应用前景。近年来，过氧化物酶在含酚废水的处理上、印染废水的脱色上的应用已经得到广泛的重视与深入的研究。跟现有方法相比，用过氧化物酶处理有机废水，尤其是含有酚或苯胺类化合物的有机废水，具有适用范围广，高效经济的优势。跟一般的生化处理不同，细胞体外酶不受底物和介质生物毒性的影响，因此酶处理不受污染物本身和水中其他有毒成分的干扰，可以用于高浓度、高毒性的有机废水；而对于普通的生物处理，高浓度的废水中容易导致微生物中毒，活性受到抑制。由于酶催化的高选择性，即使底物浓度很低，也同样可以维持较高的反应速率，获得满意的去除效率。所以，用酶处理的效率不易受到污染物浓度高低的影响，可以在很大的浓度范围内起作用，并且过程容易控制，基本不产生二次污染。然而，在水溶液反应过程中过氧化物酶的活性通常难以长时间保留，蛋白质的催化活性容易受到反应自由基中间体或者反应产物的抑制，在水处理的过程中容易失活，从而降低了处理效率。而且，水溶性酶属于一次性消耗，一旦投入水中，很难将其回收利用，导致处理成本的增加。基于游离酶不稳定和易变性等特点，固定化酶的概念和技术得以提出和发展。酶的固定化可定义为通过物理或化学的方法将酶分子固定到载体表面。物理固定主要有吸附法，包埋法。吸附法操作简单，条件温和，不会引起酶的变性失活，但由于是靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不太牢固而易脱落。包埋法根据载体材料和方法的不同，可以分为凝胶包埋法和微胶囊包埋法。凝胶包埋法是将酶和含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶的方法。最常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、海藻酸钙、卡拉胶、聚丙烯酰胺等。微胶囊包埋法是将酶包埋在高分子半透膜中，制成微胶囊固定化酶的方法。包埋法可以固定大量的酶，但在酶和底物反应过程中造成较大的传质阻力。化学固定化是目前应用最多的酶固定化技术，一般通过酶分子上的氨基酸(通常是赖氨酸的氨基) 和载体表面的活性基团反应，形成共价键。这种方法的优点是酶与载体牢固，制得的固定化酶稳定性好，是目前应用最多的酶固定化技术。缺点是制备过程中反应条件较为强烈，难以控制。由于酶蛋白分子表面含有大量赖氨酸残基，化学固定常常导致一个酶分子通过若干赖氨酸残基和载体键合，导致蛋白质分子无规律无序地和载体键合，从而难以控制被固定酶的生化活性。由于无序的固定，酶分子的活性中心可能被临近的酶分子或者载体遮挡，影响它们和底物的结合。另外，酶分子通过多个氨基酸残基和载体键合导致蛋白子分子天然构像的变形。所有这些因素导致酶被固定化后相当程度的失去活性，跟自由酶相比，常常只有不到20%的原始活性得以保留。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足之处提供一种通过层层自组装技术合成过氧化物酶-纳米磁铁颗粒功能材料的方法。本发明的目的是通过以下方式实现的—种过氧化物酶-纳米磁铁颗粒功能材料的合成方法，该方法包括以下步骤a)载体的预处理将纳米磁铁颗粒分散到含壳聚糖的冰醋酸溶液中，在搅拌条件下缓慢加到含乳化剂的石蜡油中，继续搅拌20 40min，然后加入浓度为5 10%戊二醛水溶液进行交联反应；b)清洗交联反应结束后，加碱液调节pH至9 10，然后用有机溶剂洗涤，干燥得到表面包裹壳聚糖的磁铁颗粒载体；洗涤采用的有机溶剂可以为弱极性有机溶剂，优选石油醚，乙醇。C)交替吸附将载体交替置于水溶性聚电解质缓冲溶液和过氧化物酶缓冲溶液中，使得水溶性聚电解质和过氧化物酶交替沉积在载体表面。本发明采用载体预处理的目的是使载体表面带上电荷，以便聚电解质和酶的组装。优选乳化剂在石蜡油中的体积比浓度为0. 5 1%，乳化剂优选为司盘-80，易于纳米磁铁颗粒更好的分散。然后加入戊二醛(优选用量为Ig纳米磁铁颗粒与IOml浓度为5 10% (体积比)戊二醛水溶液作为交联剂的比例)进行交联反应，从而在磁铁颗粒表面生产一层壳聚糖膜。由于壳聚糖分子链上带有的氨基，在酸性条件下，磁铁颗粒表面带正电荷。优选按照Ig纳米磁铁颗粒分散到20mL浓度为10 50g/L的壳聚糖的1 %冰醋酸溶液中的比例。交联反应温度为35 45°C;优选交联反应温度40°C，反应时间为1小时。纳米磁铁颗粒粒径优选50 lOOnm。所述的水溶性聚电解质为聚磺化苯乙烯钠盐，或者将聚磺化苯乙烯钠盐(PSS)和聚盐酸烯丙胺(PAH)交替使用。上述水溶性聚电解质缓冲溶液配制方法为将水溶性聚电解质溶解在pH 4 6 的柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液中，浓度为1 3g/L，加NaCl控制溶液的离子强度为0. 1 0.2mol/L0上述过氧化物酶缓冲溶液配制方法为将过氧化物酶溶解在pH4 6柠檬酸-磷酸盐的缓冲溶液中，浓度为0. 5 2g/L，过氧化物酶的等电点为大于7，在弱酸性溶液中，酶分子带正电荷。交替吸附的具体方法为载体首先置于水溶性聚电解质缓冲溶液中，10 30分钟后用去离子水洗涤，然后将处理后的载体再置于过氧化物酶缓冲溶液中，1 3小时后用去离子水洗涤，接着重复以上步骤。交替吸附反应在温度为15 35°C之间进行，优选在室温下进行。水溶性的聚电解质作为成膜材料十分关键，这是因为不同膜层之间是通过静电吸引相互聚合的，膜材料需要带有足够数量的电荷。根据层层自主装方法，本发明优选聚磺化苯乙烯钠盐和聚盐酸烯丙胺(PAH)作电解质材料，其中，磺化苯乙烯钠盐(PSS)的分子链上含有负电基团(-S03_)，聚盐酸烯丙胺(PAH)的分子链上含有正电基团(-NH3+)。
因为载体带正电荷，可将载体交替置于聚电解质和过氧化物酶溶液中，使它们通过静电作用，交替沉积在载体表面。根据沉积的次序，分别制得“磁铁/(PSS/酶)η”和“磁铁/PSS/PAH/ (PSS/酶)η”体系，其中η优选为1 5，然后再测定相应的过氧化物酶-纳米磁铁颗粒功能材料(简称固定化酶)活性。通过在10 60°C的范围内，测定不同温度下市售过氧化物酶(简称游离酶)和固定酶的活性，比较两者的热稳定性，确定本发明固定化酶的最适合温度在15 35°C之间。以柠檬酸-磷酸盐为缓冲体系，在pH3 10范围内测定市售过氧化物酶(简称游离酶)和固定酶的活力变化，确定固定酶和游离酶在PH5 6时作用活性最强。本发明优选将水溶性聚电解质配制在pH5. 0的柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液中，浓度为2g/L，并加适量NaCl控制溶液的离子强度为0. lmol/L。过氧化物酶缓冲溶液也优选配置在柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液中，浓度为lg/L，并调节溶液pH低于氧化物酶的等电点(pi)， 从而使溶液中蛋白质带正电荷。本发明通过在不同溶液浓度、离子强度、吸附时间以及酶的层数(η)条件下比较过氧化物酶-纳米磁铁颗粒功能材料的活性，从而确定最佳固定化 (交替吸附)条件为pH5，PSS浓度2g/L，HRP浓度lg/L，PSS中反应20分钟，过氧化物酶溶液中反应2小时。层层自组装是基于静电相吸而产生多层膜自我组装体系的技术，通过轮流地交换吸附溶液，使两种带相反电荷的离子相互吸引结合构成多层膜结构。本发明利用基于静电吸引的层层自组装技术，将过氧化物酶固定到纳米磁铁颗粒表面。该技术可以有效实现酶的回收和循环利用，大大降低酶使用的成本。该技术有效克服了物理吸附法酶易脱落，凝胶包埋法传质阻力大，化学固定法可控性差、固定化酶失活现象严重等缺陷。由于过氧化物酶属于蛋白质，分子在水溶液中容易带上电荷，并可通过改变PH来控制其分子所带电荷的性质和密度。层层组装技术基于静电吸引，因此本发明方法适用于市售可得的所有过氧化物酶，如辣根过氧化物酶，锰过氧化物酶，木质素过氧化物酶，还适用于酚氧化物酶，如漆酶。与现有技术比较本发明的有益效果1)结构可控，可以形成多层酶结构，达到较高酶上载量；2)可在常温水溶液中进行，不形成共价键，可以最大程度保证蛋白质分子维持生物活性的天然构像，从而最大程度的保留其催化活性。通过本发明制备的固定化酶，其活性为游离酶的90%以上，而通常的化学固定法，酶活性保留一般低于70%。3)实现酶的回收和循环利用，固定化酶可通过磁场方便的回收。
图1为本发明过氧化物酶_纳米磁铁颗粒功能材料的合成过程。图2为固定化酶和游离酶的存储稳定性比较图。图3为固定化酶和游离酶的pH稳定性比较图。图4为固定化酶和游离酶的热稳定性比较图(70°C条件下)。
具体实施例方式下面结合具体实施例来详细说明本发明，在此本发明的示意性实施例以及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。纳米磁铁颗粒(50 IOOnm粒径)由Sigma-Aldrich购得。过氧化物酶(HRP)购自Sigma-Aldrich。聚磺化苯乙烯钠盐(PSS)、聚盐酸烯丙胺(PAH)均购自Sigma-Aldrich。实施 例1利用超声波，将l.Og磁铁颗粒分散到20mL含20g/L壳聚糖的冰醋酸的溶液中(即20g壳聚糖溶解在IL质量百分比浓度为的醋酸水溶液中)，混合均勻，然后在充分搅拌的条件下逐滴加到IOOmL含0. 5 ImL乳化剂(Span-80)的石蜡油中，继续搅拌 30min，加入IOmL 8%的戊二醛水溶液作为交联剂，35 45°C反应lh。然后加入适量NaOH 溶液，调节pH至9 10，依次用石油醚，乙醇洗去多余的壳聚糖和石蜡油，干燥得到表面包裹壳聚糖的磁铁颗粒载体。用pH5. 0的柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液配制浓度为2g/L聚磺化苯乙烯钠盐(PSS)缓冲溶液，并加NaCl控制溶液的离子强度为0. lmol/L,这样的条件下溶液中PSS带负电荷。辣根过氧化物酶(HRP)溶液也配置在pH5.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液中，浓度为lg/L，HRP 的等电点(Pl)为8. 8，所以在pH5.0的溶液中蛋白质带正电荷。将载体交替置于聚电解质和酶溶液中，使它们通过静电作用，交替沉积在载体表面。沉积的次序为磁铁-PSS-HRP。 反应在室温下进行，载体首先置于20mL PSS溶液中，并放入摇床充分摇勻，20分钟倒出溶液，并用IOmL去离子水洗涤10分钟，这样，载体表面覆盖了一层PSS。然后将处理后的载体再置于IOmL HRP溶液中，同样的条件反应2小时，去离子水洗涤10分钟。经过这样处理后，载体表面覆盖了第一层酶分子。接着重复以上步骤2次，使载体带上3层酶分子，得到过氧化物酶_纳米磁铁颗粒功能材料(又称固定化酶或磁铁/ (PSS/HRP) 3)。实施例2将按照实施例1方法制备得到的固定化酶交替置于浓度为lg/L聚盐酸烯丙胺 (PAH)缓冲溶液和浓度为3g/L聚磺化苯乙烯钠盐(PSS)缓冲溶液中，使它们通过静电作用， 交替沉积在载体表面，沉积的次序为磁铁-PSS-PAH。反应在室温下进行，载体首先置于 20mL PSS溶液中，并放入摇床充分摇勻，20分钟倒出溶液，并用IOmL去离子水洗涤10分钟， 这样，载体表面覆盖了一层PSS。接着将载体置于20mL PAH溶液中，20分钟后取出，用去离子水洗涤10分钟，使载体上加载上一层PAH。然后用同样的条件，加载第二层PSS，然后将处理后的载体再置于IOmLHRP缓冲溶液中反应2小时，去离子水洗涤10分钟。经过这样处理后，载体表面覆盖了第一层酶分子。接着重复以上步骤2次，使载体带上3层酶分子。最后，经过这样处理后，制备得到过氧化物酶_纳米磁铁颗粒功能材料(又称固定化酶或磁铁 /PSS/PAH/ (PSS/HRP) 3)。以下通过固定化酶(按照实施例1方法制备得到)和游离酶(市售过氧化物酶 HRP)的性能比较说明本发明的效果a.热稳定性分别取游离酶和固定化酶置于70°C水浴中保温，定时取样监测其活性，从而确定酶的热稳定性(见图4)。结果70°C水浴中保温8小时后，游离酶的残留活性仅为15%左右，而固定化酶的残留活性在45%左右。b.pH稳定性取适量游离酶和固定化酶，分别置于pH值不同的缓冲溶液中，25°C 保温，一周取样测定残留活性(见图3)。结果表明，在所有pH条件下，固定化酶的失活程度均小于游离酶，说明固定化有利于保持酶的活性。
c.储存稳定性将游离酶和固定化酶在4°C分别保藏1、2、3、4、5、6周后，测定酶活性(见图2)。结果表明，6周后游离酶的活性在79%左右，而固定化酶的活性在89%左右。因此，本发明过氧化物酶_纳米磁铁颗粒功能材料比市售游离酶有更好的热稳定性、PH稳定性和储存稳定性。
权利要求
1.一种过氧化物酶-纳米磁铁颗粒功能材料的合成方法，其特征在于该方法包括以下步骤a)载体的预处理将纳米磁铁颗粒分散到含壳聚糖的冰醋酸溶液中，在搅拌条件下缓慢加到含乳化剂的石蜡油中，继续搅拌20 40min，然后加入浓度为5 10%的戊二醛水溶液进行交联反应；b)清洗交联反应结束后，加碱液调节pH至9 10，然后用有机溶剂洗涤，干燥得到表面包裹壳聚糖的磁铁颗粒载体；c)交替吸附将载体交替置于水溶性聚电解质缓冲溶液和过氧化物酶缓冲溶液中，使得水溶性聚电解质和过氧化物酶交替沉积在载体表面。
2.根据权利要求1所述的过氧化物酶-纳米磁铁颗粒功能材料的合成方法，其特征在于Ig纳米磁铁颗粒分散到20mL浓度为10 50g/L的壳聚糖的冰醋酸溶液中。
3.根据权利要求1所述的过氧化物酶-纳米磁铁颗粒功能材料的合成方法，其特征在于交联反应温度为35 45°C。
4.根据权利要求3所述的过氧化物酶-纳米磁铁颗粒功能材料的合成方法，其特征在于交联反应温度40°C，反应时间为1小时。
5.根据权利要求1所述的过氧化物酶-纳米磁铁颗粒功能材料的合成方法，其特征在于所述的乳化剂在石蜡油中的体积浓度为0. 5 1%，乳化剂优选为司盘-80。
6.根据权利要求1所述的过氧化物酶-纳米磁铁颗粒功能材料的合成方法，其特征在于所述的水溶性聚电解质为聚磺化苯乙烯钠盐、或者将聚磺化苯乙烯钠盐和聚盐酸烯丙胺交替使用。
7.根据权利要求1所述的过氧化物酶-纳米磁铁颗粒功能材料的合成方法，其特征在于所述的水溶性聚电解质缓冲溶液配制方法为将水溶性聚电解质溶解在PH 4 6的柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液中，浓度为1 3g/L，加NaCl控制溶液的离子强度为0. 1 0. 2mol/ L0
8.根据权利要求1所述的过氧化物酶-纳米磁铁颗粒功能材料的合成方法，其特征在于所述的过氧化物酶缓冲溶液配制方法为将过氧化物酶溶解在PH4 6柠檬酸-磷酸盐的缓冲溶液中，浓度为0. 5 2g/L。
9.根据权利要求1所述的过氧化物酶-纳米磁铁颗粒功能材料的合成方法，其特征在于交替吸附的具体方法为载体首先置于水溶性聚电解质缓冲溶液中，10 30分钟后用去离子水洗涤，然后将处理后的载体再置于过氧化物酶缓冲溶液中，1 3小时后用去离子水洗涤，接着重复以上步骤。
10.根据权利要求1所述的过氧化物酶-纳米磁铁颗粒功能材料的合成方法，其特征在于交替吸附反应在温度为15 35°C之间进行。
全文摘要
本发明公开了一种过氧化物酶-纳米磁铁颗粒功能材料的合成方法，该方法基于静电吸引的层层自组装技术，将过氧化物酶固定到纳米磁铁颗粒表面。通过该方法可以形成多层酶结构，达到较高酶上载量；可以保证蛋白质分子维持生物活性的天然构像，从而最大程度的保留其催化活性；可以有效提高酶的热稳定性、化学稳定性。利用磁铁颗粒作为酶的载体，可有效的实现了酶的回收和循环利用，大大降低了酶的使用成本。
文档编号C12N11/10GK102304505SQ20111023873
公开日2012年1月4日 申请日期2011年8月19日 优先权日2011年8月19日
发明者宦志荣, 陆隽鹤 申请人:无锡市寰创环境科技发展有限公司