专利名称：罗氏沼虾双顺反子病毒的lamp检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明属于靶DNA片断的检测技术领域，具体涉及一种利用环介导等温扩增 (Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术快速检测罗氏沼虾双顺反子病毒所用的试剂盒及检测方法。
背景技术：
罗氏沼虫下双顺反子病毒 Ofecro^racAi腫 rosenbergii dicistrovirus, MRDV)是引起罗氏沼虾幼体综合症(ifecro^racAi腫rosenbergii larval Syndrome, MRLS)的主要病原，对罗氏沼虾育苗产业危害极大。MRDV为单正链RNA病毒，归为双顺反子病毒科。该病毒在国内外文献上未有报道，其基因组序列仅公开了 900个碱基。该病毒于2009年和2010 年引起我国罗氏沼虾幼体的疾病，造成罗氏沼虾在幼体期出现大量死亡，特别是在幼体6-9 日龄死亡尤为严重，死亡率一般为80-90%，严重的达到100%，近2年造成的经济损失无法估量。被发现以来，因缺少检测方法，严重阻碍了该病毒引起疾病的预防工作，因此该病毒检测试剂盒的开发和检测技术的研究显得尤为重要。RT-LAMP是一种新型的核酸等温扩增技术，该技术针对靶基因的6个区域设计6条特异引物，利用AMV逆转录酶和DNA聚合酶同时作用，使得病毒cDNA合成和核酸扩增同时进行，并且DNA聚合酶是一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒温条件下即可完成核酸扩增反应，扩增出LAMP特征性梯状条带。RT-LAMP技术在保持PCR技术优点的基础上，进一步增强了反应的特异性并缩短了检测时间；特别是它不需使用昂贵的热循环仪， 在等温条件下就能使反转录和核酸扩增同时完成反应，且扩增产物用肉眼能观察，可用于病原微生物的现场快速检测。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供罗氏沼虾双顺反子病毒的 RT-LAMP检测试剂盒和检测方法的技术方案，该试剂盒特异性强，敏感性高，该方法方便、灵敏、准确、快速，为罗氏沼虾幼体综合症的预防奠定基础。所述的罗氏沼虾双顺反子病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于包括RNA提取试剂和RT-LAMP反应试剂，
所述的RNA提取试剂含有Trizol试剂、氯仿、异丙醇、无RNase的70%乙醇和DEPC水； 所述的RT-LAMP反应试剂含有
1)RT-LAMP 预反应液20 25mM pH 为 8. 2 9. 0 的 Tris-HCl、6 IOmM硫酸镁、10 12mM 氯化钾、8 12mM 硫酸铵、0. 1 0. 2% Triton X-100 或 Tween 20、1 1. 6 mM dNTP、 0.6 1.0 M 甜菜碱、1. 5 2. 2μΜ 引物 MRDV-FIP、1. 5 2. 2μΜ 引物 MRDV-BIP、0. 15 0. 3 μ M 引物 MRDV-F3、0. 15 0. 3 μ M 引物 MRDV-B3， 引物MRDV-FIP核苷酸序列如SEQ No. 1所示， 引物MRDV-BIP核苷酸序列如SEQ No. 2所示，引物MRDV-F3核苷酸序列如SEQ No. 3所示， 引物MRDV-B3核苷酸序列如SEQ No. 4所示；
2)逆转录酶每微升含10个活性单位的AMV逆转录酶；
3)聚合酶每微升含8个活性单位的BstDNA聚合酶；
4)RT-LAMP反应稳定液由矿物油或液体石蜡油组成；
5)RT-LAMP反应显色液含有10 % SYBR Green I的荧光染料。所述的罗氏沼虾双顺反子病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于所述的RT-LAMP预反应液含有21 MmM pH为8. 2 9. 0的iTris-HClJ 9mM硫酸镁、11 12mM氯化钾、 9 IlmM 硫酸铵、0. 1 0. 2% Triton X-100 或 Tween 20、1. 2 1. 4 mM dNTP、0. 7 0. 9 M 甜菜碱、1. 6 2. ΟμΜ 引物MRDV-FIP、1. 6 2. 0 μ M 引物 MRDV_BIP、0. 2 0. 25 μ M 引物 MRDV-F3、0. 2 0. 25 μ M 引物 MRDV-B3。所述的罗氏沼虾双顺反子病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于所述的RT-LAMP预反应液中还含有0. 6 1. 2 μ M引物MRDV-LB和0. 6 1. 2 μ M引物MRDV-LF，
引物MRDV -LF核苷酸序列如SEQ No. 5所示， 引物MRDV -LB核苷酸序列如SEQ No. 6所示。所述的罗氏沼虾双顺反子病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于检测试剂盒还具有阳性对照试样和阴性对照试样，所述阳性对照试样为罗氏沼虾双顺反子病毒基因组RNA， 所述的阴性对照试样为无核酸去离子水。所述的罗氏沼虾双顺反子病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于所述的RT-LAMP预反应液中还含有0. 8 1. 0 μ M引物MRDV-LB和0. 8 1. 2 μ M引物MRDV-LF。所述的罗氏沼虾双顺反子病毒的LAMP检测方法，其特征在于包括以下步骤
1)罗氏沼虾RNA抽提利用RNA提取试剂抽提罗氏沼虾RNA；
2)罗氏沼虾双顺反子病毒的RT-LAMP扩增
a)根据待检测样品的数目，设置所需RT-LAMP反应管数N，N=样品数+2，其中1管为阳性对照，1管为阴性对照；
b)吸取RT-LAMP预反应液的体积为NX22.5 μ L，加入1. 5mL离心管中，然后加入N μ L Bst DNA聚合酶和Ν/2 μ L AMV逆转录酶，混合均勻，1500 2000转/分钟离心10秒，取上清的混合液；
c)向上述设定的N个反应管中分别加入Mu L步骤b)所得的混合液，并向N个反应管内按顺序依次分别加入阴性对照、待检模板RNA和阳性对照RNA各1 μ L ；
d)在每个反应管中再分别加入30u L RT-LAMP反应稳定液，盖紧管盖并做好标记， 2000转/分钟离心5秒；
e).在61°C 67°C下恒温反应40 70分钟；
3)显色检测
取出RT-LAMP反应管，冷却至室温，2000转/分钟离心5秒，按照阴性对照、待检样品和阳性对照的顺序依次分别加入1 μ L RT-LAMP反应显色液，轻轻混勻，直接用肉眼观察颜色变化。所述的罗氏沼虾双顺反子病毒的LAMP检测方法，其特征在于所述的步骤1)罗氏沼虾RNA提取包括以下步骤取罗氏沼虾幼体头胸部或是成虾鳃组织0. 1 0. 2g，于冰上用研磨棒研磨，加300 μ L Trizol后，继续研磨充分后加Trizol至lmL，旋涡震荡1分钟，室温5分钟，加入200 μ L氯仿，旋涡震荡30秒，室温静置3分钟，12000g离心10分钟；取上层水相于新的EP管中，加入500 μ L异丙醇，室温放置10分钟后，12000g离心IOmin ；移去上清，沉淀用70%乙醇洗涤2次，室温干燥5 IOmin后以DEPC处理的去离子水重悬，得到待测罗氏沼虾RNA。本发明所述的引物是根据在线软件I^rimerExplorer V4(http:// primerexplorer. jp/e/)设计和手工修改而得，这六条引物能特异识别靶序列的八个不同位点，增加了扩增的特异性，并在反应中产生茎环结构。本发明中引物MRDV-FIP 核苷酸序列(SEQ No. 1)为TCACGCAACACAAATTCTCGCTTTT TTCCACCTCCTTATCGCTCT ；
引物 MRDV-BIP 核苷酸序列(SEQ No. 2)为 GGTTGCTCCATTGGCCAAGAACATTTTGCAACAACGC TTCCTGTG ；
引物 MRDV-F3 核苷酸序列(SEQ No. 3)为 CTGATGAAACAAAGAGTGGGTC ； 引物 MRDV-B3 核苷酸序列(SEQ No. 4)为 TTCAAACGAAGCAATCCGTG ； 引物 MRDV -LF 核苷酸序列(SEQ No. 5)为 TTAGAAACGACACTTCAGACAA ； 引物 MRDV -LB 核苷酸序列(SEQ No. 6)为 CGATTGAAGATATGTGTATGTGG。与现有技术相比，本发明具有如下优点
(1)本发明根据靶基因序列设计了罗氏沼虾双顺反子病毒检测用引物组，该靶基因序列如SEQ No. 7所示。本发明中设计的引物组能特异性识别靶序列上的八个独立区域，在 BstDNA聚合酶的作用下启动循环链置换反应，在靶标cDNA区启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎一环DNA混合物，由于LAMP技术只有在四条引物完全识别靶序列六个结合区的情况下才能顺利进行，所以本发明的引物组在很大程度上减少了扩增反应的背景影响，大大增强了罗氏沼虾双顺反子病毒检测的特异性；
(2)采用本发明的引物组对罗氏沼虾双顺反子病毒进行检测，因为特异性高，所以可以根据是否扩增就能判断目标基因的存在与否；
(3)本发明的快速诊断试剂盒是利用反转录环介导等温扩增技术快速检测罗氏沼虾双顺反子病毒，检测灵敏度高，扩增模板仅需20拷贝；
(4)本发明的快速诊断试剂盒不但反应条件温和，且所需仪器简单，也不需要特殊试剂，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点；
(5)本发明的快速诊断试剂盒扩增快速且高效，在不到Ih即可完成扩增，且产率高；
(6)本发明的快速诊断试剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的 Mg2+结合，产生副产物——焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，验证率高，更加明显可靠；
(7)本发明的快速诊断试剂盒操作简单，对检测人员的技术素质要求较低，可建立成本低廉的快速筛选体系，实现现场高通量快速检测；
(8)本发明的快速诊断试剂盒建立了一套经过优化的反转录环介导等温扩增反应体系，不但使得罗氏沼虾双顺反子病毒定性检测更加简便快速、特异性高、灵敏度高，而且该试剂盒是检测罗氏沼虾双顺反子病毒的第一个试剂盒，填补了罗氏沼虾双顺反子病毒无检测方法的缺口，具有很高的科研和经济价值。
图1引物特异性测试M. IOObp DNA Marker ； 1.罗氏沼虾双顺反子病毒；2.罗氏沼虾诺达病毒(MRNV)； 3.对虾白斑综合症病毒(WSSV) ； 4.对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)； 5.阴性对照。图2灵敏性检测M. IOObp DNA Marker ； 1. 1. 5X IO5 copies ；2. 1. 5X IO4 copies ；3. 1. 5X IO3 copies ；4. 1. 5X IO2 copies ；5. 1. 5X IO1 copies ；6. 1. 5 copies ；7.阴性对照。
具体实施例方式以下结合具体实施例来进一步说明本发明。实施例1
1)用RNA提取试剂抽提RNA (RNA提取试剂为现有技术中的常规试剂，其含有Trizol 试剂、氯仿、异丙醇、无RNase的70%乙醇和DEPC水)
取罗氏沼虾幼体头胸部或是成虾鳃组织0. 1,0. 15或0. 2g，于冰上用研磨棒研磨，加 300 μ L Trizol后，继续研磨充分后加Trizol至lmL，旋涡震荡1分钟，室温5分钟，加入 200 μ L氯仿，旋涡震荡30秒，室温静置3分钟，12000g离心10分钟，取上层水相于新的EP 管中，加入500 μ L异丙醇，室温放置10分钟后，12000g离心IOmin ；移去上清，沉淀用70% 乙醇洗涤2次，室温干燥5、8或IOmin后以DEPC处理的去离子水重悬，分装，得到提罗氏沼虾RNA，置-80°C保存。2)反转录环介导等温扩增罗氏沼虾双顺反子病毒特异基因区
a)根据待检测样品的数目，设置所需RT-LAMP反应管数N(N大于等于1)，N=样品数 +1管阳性对照+1管阴性对照；
b)吸取RT-LAMP预反应液(RT-LAMP预反应液含有20 25mMpH为8. 2 9. 0的 iTris-HClj IOmM硫酸镁、10 12mM氯化钾、8 12mM硫酸铵、0. 1 0. 2% Triton X-100 或 Tween 20、1 1.6 mM dNTP、0. 6 1. 0 M 甜菜碱、1.5 2. 2 μ M 引物 MRDV-FIP、1. 5 2.2 口] 引物1 0￥-81卩、0.15 0.3 μ M 引物 MRDV_F3、0. 15 0. 3 口] 引物1 0￥-83，引物MRDV-FIP核苷酸序列如SEQ No. 1所示，引物MRDV-BIP核苷酸序列如SEQ No. 2所示，引物MRDV-F3核苷酸序列如SEQ No. 3所示，引物MRDV-B3核苷酸序列如SEQ No. 4所示)的体积为NX22.5 PL，加入一洁净的1. 5mL离心管中，然后加入N μ L Bst DNA聚合酶(每微升含8个活性单位的Bst DNA聚合酶)和Ν/2 μ L AMV逆转录酶(每微升含10个活性单位的AMV逆转录酶)，混合均勻，1500、1800或2000转/分钟离心10秒，取上清之混合液；
c)向设定的N个反应管中分别加入MyL上述混合液，再向上述N个PCR反应管内按顺序依次分别加入阴性对照(无核酸去离子水)、待检模板RNA和阳性对照(罗氏沼虾双顺反子病毒基因组RNA)各1 μ L ；
d)然后在上述每个反应管中再分别加入30μ L PT-LAMP反应稳定液(由矿物油或液体石蜡油组成)，2000转/分钟离心5秒，盖紧管盖并做好标记；
6)在611、631、651或671下恒温反应40、50、60或70分钟，然后在80°C灭活5min。
3)取出RT-LAMP反应管，冷却至室温，2000转/分钟离心5秒，按照阴性对照、待检样品和阳性对照的顺序依次分别加入1 μ LPT-LAMP反应显色液(含有10 % SYBR Green I的荧光染料)，轻轻混勻，直接用肉眼观察颜色变化或用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳后用溴化乙锭染色。RT-LAMP预反应液电泳结果在紫外分析仪下观察，可发现阶梯状的扩增特征条带， 说明样品中有罗氏沼虾双顺反子病毒。实施例1中RT-LAMP预反应液也可以采用21 MmM ρΗ为8. 2 9. 0的Tris-HCl、 7 9mM硫酸镁、11 12mM氯化钾、9 IlmM硫酸铵、0. 1 0. 2% Triton X-100或Tween 20、1.2 1.4 mM dNTP、0. 7 0. 9 M 甜菜碱、1. 6 2. 0 μ M 引物 MRDV-FIP、1. 6 2. 0 μ M 引物 MRDV-BIP、0. 2 0. 25 μ M 引物 MRDV_F3、0. 2 0. 25 μ M 引物 MRDV-B3 ；
或采用20 25mM ρΗ为8. 2 9. 0的Tris_HCl、6 IOmM硫酸镁、10 12mM氯化钾、 8 12mM 硫酸铵、0. 1 0. 2% Triton X-100 或 Tween 20、1 1. 6 mM dNTP、0. 6 1. 0 M 甜菜碱、1. 5 2. 2 μΜ 引物 MRDV-FIP、1. 5 2. 2 μ M 引物 MRDV_BIP、0. 15 0. 3μ M 引物 MRDV-F3、。· 15 0. 3 μ M 引物 MRDV_B3、0. 6 1. 2 μ M 引物 MRDV-LB 和 0. 6 1. 2 μ M 引物 MRDV-LF，引物MRDV-LF核苷酸序列如SEQ No. 5所示，引物MRDV -LB核苷酸序列如SEQ No. 6 所示。采用上述快速诊断试剂盒和方法进行RT-LAMP检测罗氏沼虾双顺反子病毒特异性和灵敏性试验结果如附图1和2所示。图1引物种特异性测试图，如1图所示，仅罗氏沼虾双顺反子病毒能扩增出阶梯状的扩增特征条带，其它病毒无阶梯状的扩增特征条带，表明对其它病毒无交叉扩增性。图2罗氏沼虾双顺反子病毒灵敏性检测图，如图所示，经Real-time PCR定量后的罗氏沼虾双顺反子病毒RNA系列稀释的扩增特征条带显示，当反应体系中加入15个病毒拷贝的RNA，就能扩增出特征条带。本发明利用反转录环介导等温扩增技术快速检测罗氏沼虾双顺反子病毒的检测方法，在已试验的4种不同种的病毒进行了检测，结果都能达到与实施例1相同的技术效果。
权利要求
1.罗氏沼虾双顺反子病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于包括RNA提取试剂和 RT-LAMP反应试剂，所述的RNA提取试剂含有Trizol、氯仿、异丙醇、无RNase的70%乙醇和DEPC水；所述的RT-LAMP反应试剂含有URT-LAMP 预反应液20 25mM pH 为 8. 2 9. O 的 Tris-HCl、6 IOmM硫酸镁、10 12mM 氯化钾、8 12mM 硫酸铵、0. 1 0. 2% Triton X-100 或 Tween 20、1 1.6 mM dNTP、 0. 6 1. 0 M 甜菜碱、1. 5 2. 2 μ M 引物 MRDV-FIP、1. 5 2. 2 μ M 引物 MRDV_BIP、0. 15 0. 3 μ M 引物 MRDV-F3、0. 15 0. 3 μ M 引物 MRDV-B3，引物MRDV-FIP核苷酸序列如SEQ No. 1所示，引物MRDV-BIP核苷酸序列如SEQ No. 2所示，引物MRDV-F3核苷酸序列如SEQ No. 3所示，引物MRDV-B3核苷酸序列如SEQ No. 4所示；2)逆转录酶每微升含10个活性单位的AMV逆转录酶；3)聚合酶每微升含8个活性单位的BstDNA聚合酶；4)RT-LAMP反应稳定液由矿物油或液体石蜡油组成；5)RT-LAMP反应显色液含有10 % SYBR Green I的荧光染料。
2.如权利要求1所述的罗氏沼虾双顺反子病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于所述的RT-LAMP预反应液含有21 MmM pH为8. 2 9. 0的Tris_HCl、7 9mM硫酸镁、11 12mM氯化钾、9 IlmM硫酸铵、0. 1 0. 2% Triton X-100或Tween 20、1.2 1.4 mM dNTP、 0. 7 0. 9 M 甜菜碱、1. 6 2. 0 μ M 引物 MRDV-FIPU. 6 2. 0 μ M 引物 MRDV_BIP、0. 2 0.25 口] 引物1 0￥-卩3、0.2 0.25 口1引物1 0乂-83。
3.如权利要求1所述的罗氏沼虾双顺反子病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于所述的 RT-LAMP预反应液中还含有0. 6 1. 2 μ M引物MRDV-LB和0. 6 1. 2 μ M弓丨物MRDV-LF，引物MRDV -LF核苷酸序列如SEQ No. 5所示，引物MRDV -LB核苷酸序列如SEQ No. 6所示。
4.如权利要求1或2或3所述的罗氏沼虾双顺反子病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于检测试剂盒还具有阳性对照试样和阴性对照试样，所述阳性对照试样为罗氏沼虾双顺反子病毒基因组RNA，所述的阴性对照试样为无核酸去离子水。
5.如权利要求3所述的罗氏沼虾双顺反子病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于所述的 RT-LAMP预反应液中还含有0. 8 1. 0 μ M引物MRDV-LB和0. 8 1. 2 μ M引物MRDV-LF。
6.罗氏沼虾双顺反子病毒的LAMP检测方法，其特征在于包括以下步骤1)罗氏沼虾RNA抽提利用RNA提取试剂抽提罗氏沼虾RNA；2)罗氏沼虾双顺反子病毒的RT-LAMP扩增a)根据待检测样品的数目，设置所需RT-LAMP反应管数N，N=样品数+2，其中1管为阳性对照，1管为阴性对照；b)吸取RT-LAMP预反应液的体积为NX22. 5 μ L，加入1. 5mL离心管中，然后加入NyL Bst DNA聚合酶和Ν/2 μ L AMV逆转录酶，混合均勻，1500 2000转/分钟离心10秒，取上清的混合液；c)向上述设定的N个反应管中分别加入MuL步骤b)所得的混合液，并向N个反应管内按顺序依次分别加入阴性对照、待检模板RNA和阳性对照RNA各1 μ L ；d)在每个反应管中再分别加入30u L RT-LAMP反应稳定液，盖紧管盖并做好标记， 2000转/分钟离心5秒；e).在61°C 67°C下恒温反应40 70分钟； 3)显色检测取出RT-LAMP反应管，冷却至室温，2000转/分钟离心5秒，按照阴性对照、待检样品和阳性对照的顺序依次分别加入1 μ L RT-LAMP反应显色液，轻轻混勻，直接用肉眼观察颜色变化。
7.如权利要求6所述的罗氏沼虾双顺反子病毒的LAMP检测方法，其特征在于所述的步骤1)罗氏沼虾RNA提取包括以下步骤取罗氏沼虾幼体头胸部或是成虾鳃组织0. 1 0. 2g，于冰上用研磨棒研磨，加300 μ L Trizol后，继续研磨充分后加Trizol至lmL，旋涡震荡1分钟，室温5分钟，加入200 μ L氯仿，旋涡震荡30秒，室温静置3分钟，12000g离心 10分钟；取上层水相于新的EP管中，加入500 μ L异丙醇，室温放置10分钟后，12000g离心 IOmin ；移去上清，沉淀用70%乙醇洗涤2次，室温干燥5 IOmin后以DEPC处理的去离子水重悬，得到待测罗氏沼虾RNA。
全文摘要
罗氏沼虾双顺反子病毒的LAMP检测试剂盒及检测方法，属于靶DNA片断的检测技术领域。该检测试剂盒包括RNA提取试剂和RT-LAMP反应试剂，该检测方法包括1)罗氏沼虾RNA抽提；2)罗氏沼虾双顺反子病毒的RT-LAMP扩增3)显色检测。该检测试剂盒特异性强，敏感性高，该检测方法方便、灵敏、准确、快速，为罗氏沼虾幼体综合症的预防奠定基础。
文档编号C12Q1/70GK102277453SQ20111023977
公开日2011年12月14日 申请日期2011年8月19日 优先权日2011年8月19日
发明者姚嘉赟, 尹文林, 徐洋, 曹铮, 沈锦玉, 潘晓艺, 郝贵杰 申请人:浙江省淡水水产研究所