一种检测西尼罗病毒的环介导等温扩增试剂盒及其应用的制作方法

专利名称：一种检测西尼罗病毒的环介导等温扩增试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉 及一种检测西尼罗病毒的环介导等温扩增试剂盒及其应用。
背景技术：
西尼罗病毒感染导致的西尼罗热是蚊媒传播的人畜共患病。多数患者呈亚临床症状，约20%感染者会在3-14d后出现西尼罗热。其病症可能包括发烧、头痛、身体疼痛、淋巴腺肿胀，有时有出疹症状。病症通常持续约一周。西尼罗病毒感染可导致病毒性脑炎，引起高烧、头痛、神志错乱、虚弱无力，有时亦会出现麻痹，偶然会导致死亡。西尼罗病毒1999年以前主要在非洲、中东、西亚和欧洲流行。1996年罗马尼亚暴发欧洲首次西尼罗热大流行。流行集中在多瑙河流域的14个地区，病毒感染率约为1214/10万。1999年俄罗斯南部也暴发大范围西尼罗脑炎流行，约有1000病例，至少40人死亡。1999年美国首次爆发西尼罗热流行，这是西半球首次西尼罗热流行。自此，美国历年均暴发西尼罗热/西尼罗脑炎流行，且西尼罗病毒分布已从1999年4个州蔓延到2004年近50个州，并传播到加拿大中南部和加勒比海地区。时至今日，西尼罗病毒感染已成为全球性严重的公共卫生健康问题。西尼罗脑炎诊断主要依赖检测病毒及其抗体，由于病毒血症时病毒载量低，且恢复期病毒已被清除，因此从血液或者脑脊液中分离病毒较为困难。新的诊断技术包括用ELISA方法测抗原、或者用PCR和实时PCR测定西尼罗病毒核酸。其中实时PCR是这些诊断技术方法中最为敏感的，但仍不能检测出所有的西尼罗脑炎患者。传统的这些方法等常需要花费较长时间或者需要特定的仪器，难以满足暴发疫情快速诊断的需要。环介导等温扩增法(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)法具有在等温条件下即可高速、快速、高特异、高灵敏的扩增靶序列的特点。核酸大量合成时，dNTP会析出大量的焦磷酸根离子，焦磷酸根离子与LAMP体系中的Mg2+(或Mn2+)结合，产生焦磷酸镁或焦磷酸锰沉淀，从而引起反应液的浊度变化，非常易于判断。此外，利用一些荧光燃料，如SYBR green I染料或者与钙黄绿素指示LAMP反应。SYBRgreen I染料可与双链DNA产物结合，当有产物大量扩增时，反应体系呈现显著的荧光信号变化。钙黄绿素在反应初始时与Mn2+结合，反应液显示透明的橙色，当有核酸产物大量合成时，会生成副产物焦磷酸根，使Mg2+游离出来，与钙黄绿素结合，最终使反应液显示微浊的黄绿色。由于LAMP方法试验要求条件低，结果易于判断，非常适宜基层病毒的排查，开展及时的动物卫生防控工作。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测西尼罗病毒的专用引物。本发明提供的专用引物，包括引物I、引物2、引物3和引物4，所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别为序列表中的序列I、序列2、序列3和序列4。
所述专用引物还包括引物5，所述引物5的核苷酸序列为序列表的序列5。所述专用引物由所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4和所述引物5组成；所述西尼罗病毒具体为西尼罗病毒Chin-Ol毒株。所述专用引物中，F3、B3、FIP、BIP、LB的5’端和/或3’端还可根据靶序列进行延长；所述专用引物中，F3、B3、FIP、BIP、LB还可进行碱基的替换和/或取代，保持3’末端序列6个碱基100%的同源性即可。FIP和BIP中TTTT(下划线者)为连接序列，其长度一般为4个，数目可相应缩短和延长。本发明的第二个目的是提供一种检测西尼罗病毒的环介导等温扩增(LAMP)试剂。本发明提供的试剂，包括RNA逆转录酶、Bst DNA聚合酶、2X环介导等温扩增缓冲 液、所述的专用引物。所述扩增试剂还包括钙黄绿素；所述扩增试剂由RNA逆转录酶、Bst DNA聚合酶、2X环介导等温扩增缓冲液、所述的专用引物和钙黄绿素组成；所述的专用引物中的引物I和引物2在对应的所述环介导等温扩增试剂中的终浓度均为5pmol/L ;所述的专用引物中的引物3和引物4在对应的所述环介导等温扩增试剂中的终浓度均为40pmol/L ;所述的专用引物中的引物5在对应的所述环介导等温扩增试剂中的终浓度均为20pmol/L ；所述的引物5可与茎环结构结合启动链置换合成，提高扩增效率。扩增的最后产物是具有不同个数的茎环结构、不同长度DNA的混合物，其产量可达10 yg以上，是普通PCR反应DNA产率的至少50倍。所述RNA逆转录酶在所述环介导等温扩增试剂中的浓度为O. 004U/ μ L ；所述RNA逆转录酶具体为AMV逆转录酶；所述Bst DNA聚合酶在所述环介导等温扩增试剂中的浓度为O. 32U/ μ L ；所述钙黄绿素在所述环介导等温扩增试剂中的浓度为50 μ mol/L ；所述2X环介导等温扩增缓冲液按照如下方法制备将氯化钾(KCl)、硫酸镁(MgSO4)、硫酸铵((NH4)2SO4)、吐温 20 (Tween-20)、甜菜碱(Betaine)、氯化锰(MnCl2)和dNTPs (脱氧核苷三磷酸混合物dATP、dCTP、dGTP和dTTP)溶于浓度为40mmol/L、PH值为
8.8的Tris盐酸盐缓冲液得到；在所述2 X环介导等温扩增缓冲液中，所述氯化钾的浓度为20mmol/L，所述硫酸镁的浓度为16mmol/L，所述硫酸铵的浓度为20mmol/L，所述吐温20的浓度为O. 2% (质量百分含量)，所述甜菜碱的浓度为1.6mol/L，所述氯化锰的浓度为lmmol/L，每种所述脱氧核苷三磷酸的浓度均为2. 8mmol/Lo所述西尼罗病毒具体为西尼罗病毒Chin-Ol毒株。本发明的第三个目的是提供一种检测西尼罗病毒的试剂盒。本发明提供的试剂盒，包括所述的环介导等温扩增试剂；所述西尼罗病毒具体为西尼罗病毒Chin-Ol毒株。所述专用引物或所述的环介导等温扩增试剂或所述的试剂盒在鉴定和/或辅助鉴定西尼罗病毒中的应用也是本发明保护的范围。所述西尼罗病毒具体为西尼罗病毒Chin-Ol毒株。本发明的第四个目的是提供一种鉴定和/或辅助鉴定待测样品中西尼罗病毒的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤用所述专用引物或所述的环介导等温扩增试剂或所述的试剂盒中的所述专用引物对待测样品进行环介导等温扩增，检测环介导等温扩增反应产物；所述环介导等温扩增中，以待测样品的RNA为模板；所述环介导等温扩增反应条件为先60°C _65°C反应35-60min，然后75°C 2min终止反应。所述环介导等温扩增反应条件为先63°C反应45min或60min,然后75°C 2min终止反应；所述待测样本为小鼠的脑。本发明的检测对象不局限于小鼠脑组织样本，还可涉及蚊虫样本、动物或人的血清、脑脊液、尸解脑组织或脏器组织等；所述西尼罗病毒为西尼罗病毒Chin-Ol毒株。所述检测环介导等温扩增反应产物的方法为如下I) _4)中的至少一种I)观察所述环介导等温扩增反应产物，若所述产物在自然光下为黄绿色，且在紫外光下有亮黄色荧光，则待测样本中含有或者候选含有西尼罗病毒；若所述产物在自然光下为橙黄色，且在紫外光下无荧光，则待测样本中不含有或者候选不含有西尼罗病毒；2)用实时浊度仪检测所述环介导等温扩增反应产物，若有特异扩增曲线，则待测样本中含有或者候选含有西尼罗病毒；若无特异扩增曲线，则待测样本中不含有或者候选不含有西尼罗病毒；3)电泳检测所述环介导等温扩增反应产物，得到梯度样条带的扩增反应产物，则待测样本中含有或者候选含有西尼罗病毒；若环介导等温扩增反应产物不为梯度样条带，则待测样本中不含有或者候选不含有西尼罗病毒；所述梯度样条带的大小为200bp_2000bp，所述梯度样条带的大小主要分布在200bp-2000bp 间；4)用Sca I酶切所述环介导等温扩增反应产物，电泳检测所述酶切产物，若所述酶切产物为244bp产物和164bp产物，则待测样本中含有或者候选含有西尼罗病毒；若所述酶切产物不为244bp产物和164bp产物，则待测样本中不含有或者候选不含有西尼罗病毒。所述检测环介导等温扩增反应产物采用肉眼观察浊度变化、肉眼观察荧光染料变化或实时浊度仪检测，具体如下I)肉眼观察浊度若肉眼观察浊度增大，则环介导等温扩增反应为阳性，表明样本中含有或者候选含有西尼罗病毒；反之为阴性。具体为核酸大量合成时，dNTP会析出大量的焦磷酸根离子，焦磷酸根离子与LAMP体系中的Mg2+(或Mn2+)结合，产生焦磷酸镁或焦磷酸锰沉淀，从而引起反应液的浊度变化；基于该原理，可以直接肉眼观测，根据反应液的浊度变化判断是否有特异性扩增发生和特异核酸大量合成，从而判断模板是否为靶序列。2)肉眼观察荧光染料变化当采用钙黄绿素荧光染料进行反应时，若LAMP反应产物在自然光下由开始的橙色变为黄绿色且在紫外光下显荧光，则LAMP反应阳性，即表明待测样本含有或候选含有西尼罗病毒。具体为应用荧光染料颜色变化进行判定时，可采用SYBR green I染料或钙黄绿素。SYBR green I染料可与双链DNA结合，但反应中有大量产物产生时，反应体 系颜色变为黄绿色。核酸大量合成时，会生成副产物焦磷酸根，焦磷酸根离子的存在，使得Mg2+游离出来，钙黄绿素和Mg2+结合，反应液呈现微浊的黄绿色。基于该原理，可以根据反应液的颜色变化判断是否有核酸大量合成，从而判断模板是否为靶序列。也可根据反应原理，选择本领域其他荧光染料进行LAMP反应的判定。3)实时浊度仪检测采用实时浊度仪及其配套程序软件实时检测反应液的浊度变化，若实时浊度仪上观察到典型的扩增曲线，则LAMP反应阳性，即表明待测样本含有或候选含有西尼罗病毒。还可以用如下方法进行检测4)电泳将LAMP反应产物用Sca I酶切，得到酶切产物，琼脂糖凝胶电泳检测LAMP反应产物和酶切产物；若LAMP反应产物呈现梯状带型(200 2000bp)，且酶切产物为244bp和164bp的双带，则LAMP反应阳性，即表明待测样本含有或候选含有西尼罗病毒。5)当采用SYBR green I染料时，可通过实时PCR仪及其配套程序软件实时检测反应液的荧光进行判定，当检测到荧光信号时，表明LAMP反应为阳性。本发明的实验证明，本发明提供的专用引物和方法，适用于对西尼罗病毒(WNV)进行特异性检测和定量分析，其优点如下(I)只需在恒定温度就能扩增反应，不需要特殊设备;(2)特异性高；(3)快速高效，扩增反应在35分钟内即可完成；(4)灵敏度高；(5)鉴定方便简单。本发明特别适用于临床标本的快速检测。


图I为在自然光(A)和紫外灯⑶下各个样本LAMP结果图2为LAMP反应产物和酶切产物琼脂糖凝胶电泳图3为实时浊度仪扩增曲线图4为病毒特异性检测的实时浊度仪扩增曲线图5为样本的实时浊度仪扩增曲线图6为RT-PCR检测样本结果
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。所用无机化学试剂和有机试剂均符合分子生物学实验的要求。引物由上海英骏技术公司合成AMV逆转录酶(Avian Myeloblastosis VirusReverse Transcriptase):普洛麦格(北京)生物技术有限公司(Promega), cat. No. M5101。脱氧核糖核苷磷酸盐混合物(dNTPs):普洛麦格(北京)生物技术有限公司(Promega)，cat. No. U1515。BstDNA 聚合酶NEB (北京)有限公司，cat. No. M0275。RNA 提取试剂盒RNeasy Mini Kit, QIAgen 公司产品，Cat No. 74014。RNA 酶抑制剂(Ribonucleaseinhibitor):大连宝生物(TAKARA)公司产品，cat. No. D2310。Tris 盐酸盐(Tris-HCl)ρΗ8· 8 :Sigma 公司，cat. No. T9443。氯化钾(KCl) :Sigma 公司，cat. No. P9514。硫酸镁(MgSO4) :Sigma 公司，cat. No. M3409、硫酸铵((NH4)2SO4) :Sigma 公司，cat. No. A4418。吐温20 (Tween20) :Sigma 公司，cat. No. P9416。甜菜喊(Betaine) :Sigma 公司，cat. No. B0300。氯化锰(MnCl2) :Sigma 公司，cat. No. M3634。钙黄绿素Sigma 公司，cat. No. 17783。DMEM培养基上海英骏生物技术有限公司，Cat No.C11885。LA-320C实时浊度仪，日本荣研公司产品。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。西尼罗病毒Chin-Ol毒株记载在姜涛，邓永强，范宝昌，等。西尼罗病毒Chin -Ol株基因组编码区序列测定及分析。军事医学科学院院刊。2003.27(6) :401-403，公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得，该所保证，可在符合国家和军队有关生物安全管理规定下，且经相关部门批准后向有资质从事第二类病毒病原体以上的单位提供。实施例I、LAMP反应鉴定西尼罗病毒 一、专用弓丨物的设计以及各个专用引物的制备根据西尼罗病毒病毒基因组序列设计特异性引物序列如下，人工合成F3 (序列 I，引物 I) CTGTGACAGCAGCTAGTGC ；B3 (序列 2，引物 2) TTTTCACGCTCTGGTTGGTA ；FIP (序列 3，引物 3) TCTTCATTCGTGTGCCCCCCTTTTACGTGGACGCATCGGTAG ；BIP (序列 4，引物 4) GACTCGAACTTCGCCCATTGGATTTTAATTGAGCGATCAGTCCGTT ；LB (序列 5，引物 5) CTGAGGCACGAATCATGCTGGA ；二、病毒样本的制备I、病毒样本的制备西尼罗病毒Chin-Ol毒株的病毒液，通过蚀斑试验计算蚀斑滴度(蚀斑形成单位/毫升，PFU/ml)。使用DMEM培养基将病毒液进行梯度稀释，得到7种不同浓度的病毒液(浓度分别为 1000PFU/ml、1000PFU/ml、100PFU/ml、10PFU/ml、lPFU/ml、0. lPFU/ml 和 O. OlPFU/ml) ο2、病毒基因组RNA的提取(采用RNA提取试剂盒)将210 μ I病毒样本加入I. 5ml离心管中，补加700 μ I RLT溶液和7 μ I β _巯基乙醇，振荡混匀后加入490μ I无水乙醇，剧烈振荡后分两次加至硅胶柱中，进行硅胶柱过滤。硅胶柱过滤将加样后的硅胶柱10，OOOg离心15s ；加700 μ I Rffl缓冲液，10，OOOg离心15s ;用500 μ I RPE缓冲液离心洗硅胶柱两次；将硅胶柱转至新的离心管中，10，00(^离心21^11 ;将硅胶柱转至新的离心管中，加入50 μ I无核酸酶水，室温静置2min，然后10，OOOg离心2min，收集洗脱液；在洗脱液中加入I μ I RNA酶抑制剂，即为待测RNA，-80°C保存。
将得到的7种病毒RNA作为7个样本，用于下述检测。样本I :自浓度为10000PFU/ml的Chin-Ol病毒液提取的RNA。样本2 自浓度为1000PFU/ml的Chin-Ol病毒液提取的RNA。样本3 自浓度为100PFU/ml的Chin-Ol病毒液提取的RNA。样本4 自浓度为10PFU/ml的Chin-Ol病毒液提取的RNA。样本5 自浓度为lPFU/ml的Chin-Ol病毒液提取的RNA。样本6 自浓度为O. lPFU/ml的的Chin-Ol病毒液提取的RNA。
样本7 自浓度为0. 01PFU/ml的Chin-ΟΙ病毒液提取的RNA。三、专用引物应用于西尼罗病毒的检测用步骤一得到的专用引物甲检测步骤二得到的待测样品，分别在7个0. 2ml反应管中进行LAMP反应。LAMP反应体系25 μ I :F3和B3的浓度均为5pmol/L，BIP和FIP的浓度均为40pmol/L, LB 的浓度为 20pmol/L, AMV 逆转录酶 0. 004U/ μ L, Bst DNA 聚合酶 0. 32U/ μ L,钙黄绿素50 μ mol/L, 12. 5ul的2X环介导等温扩增缓冲液，2. 5 μ I待测RNA，无核酸酶和脱氧核酶的去离子水补足25 μ I ;以上浓度均为体系中的终浓度。2 X环介导等温扩增缓冲液按照如下方法制备将氯化钾(KCl)、硫酸镁(MgSO4)、硫酸铵((NH4) 2S04)、吐温20 (Tween-20)、甜菜碱(Betaine)、氯化锰(MnCl2)和脱氧核苷三磷酸混合物(dNTPs :dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP)溶于浓度为 40mmol/L、PH 值为 8. 8 的 Tris盐酸盐缓冲液得到；在所述2 X环介导等温扩增缓冲液中，所述氯化钾的浓度为20mmol/L，所述硫酸镁的浓度为16mmol/L，所述硫酸铵的浓度为20mmol/L，所述吐温20的浓度为0. 2% (质量百分含量)，所述甜菜碱的浓度为1.6mol/L，所述氯化锰的浓度为lmmol/L，每种所述脱氧核苷三磷酸的浓度均为2. 8mmol/LoLAMP反应体系在63°C反应35min。恒温反应可按本领域常规方法进行，例如LA320C实时浊度仪，普通PCR仪、可控温度水浴锅等，终止反应后，自然光下反应管的照片见图1A，I至7依次为样本I至样本7，阳性为黄绿色，阴性为橙黄色；可以看出，管I至管5 (即样品I至样品5)为阳性(黄绿色)，管6至管7 (即样品6至样品7)为阴性(橙黄色)。终止反应后紫外灯照射下反应管的照片见图1B，I至7依次为样本I至样本7，阳性为黄绿色荧光，阴性无荧光；可以看出，管I至管5(即样品I至样品5)为阳性(黄绿色荧光)，管6至管7(即样品6至样品7)为阴性(无荧光)。采用肉眼观察，自然光下或紫外光下检测方法的灵敏度为lPFU/ml。待测RNA中病毒 RNA 的浓度=(lPFU/mlX200y I)/50 μ I = 0. 004PFU/ μ I。每个 LAMP 反应体系中病毒RNA 的含量=0. 004PFU/ μ 1X2. 5μ I = 0. 01PFU。即灵敏度为 0. 01PFU/ 反应体系。采用紫外灯照射下观察，检测方法的灵敏度为0. 01PFU/反应体系。四、专用引物应用于西尼罗病毒的检测(琼脂糖电泳观察)用步骤一得到的专业引物检测步骤二得到的样品I和样品7待测RNA。LAMP反应体系中可不加入钙黄绿素，其它同步骤三的LAMP反应体系。LAMP反应体系在63°C反应35min，然后75°C 2min终止反应。
终止反应后，取产物5μ I以Sca I限制性内切酶进行酶切。取LAMP反应产物
O.5μ I和酶切产物5μ I进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶浓度为2. 5%，电泳缓冲液为IXTris-硼酸(TBE)缓冲液，100V电泳40分钟，紫外光源下观察电泳结果。结果见图2，泳道3和泳道4分别为样品I的LAMP反应产物及其酶切产物，为阳性，LAMP产物可见典型梯度样的条带带型(200bp-2000bp),经酶切后仅可见2条条带(244bp和164bp);泳道I和2分别为样品7的LAMP反应产物及其酶切产物，为阴性，无典型梯度样带型。五、专用引物应用于西尼罗病毒检测(实时浊度仪)LAMP反应体系同步骤三的LAMP反应体系。将LAMP反应体系置于LA320C实时浊度仪，63°C反应35min，然后75°C 2min终止反应。反应体系中可不加入钙黄绿素。
实时浊度仪扩增曲线见图3 (从上到下的曲线依次为样本1-7)，样本I至样本5有特异的扩增曲线，为阳性，样本6和样本7为阴性。浊度仪观察的灵敏度为O. OlPFU/反应体系。六、LAMP反应特异性检测用步骤一得到的专用引物检测步骤二得到的样本I (西尼罗病毒Chin-Ol毒株)RNA,以登革病毒2型43株,黄热病毒17D株,蝶传脑炎病毒(或称森林脑炎病毒)Senzhang株，日本脑炎病毒(或称流行性乙型脑炎病毒)SA14-14-2株为对照。上述病毒(均为100000PFU/ml)提取RNA后，采用本发明所述引物进行LAMP反应(方法与步骤四相同)，结果为图4，仅西尼罗病毒Chin-Ol毒株反应有扩增曲线，结果呈阳性，其他病毒反应均无明显扩增曲线为阴性，表明本发明所述引物均有良好的特异性。登革病毒2型43株记载在尉雁，姜涛，李晓峰，等。基于登革2型病毒PrM基因的新型脱氧核酶对病毒RNA降解作用的初步观察.军事医学科学院院刊.2007. 31 (I) =16-19,23 ;核酸数据库登陆号AF204178。黄热病毒17D 株记载在 Co MD, Kilpatrick ED, Rothman AL. Dynamics ofthe CD8T_cell response following yellow fever virus 17D immunization.Immunology. 2009. 128 (ISuppl) :e718_27 ;核酸数据库登陆号 X03700。蜱传脑炎病毒Senzhang株记载在马新英，司炳银，高轩，等。我国森林脑炎病毒森张株编码区序列测定。中国病毒学。2003.18(4) :322-325 ;核酸数据库登陆号AY182009。日本脑炎病毒SA14-14-2株记载在李玉华，李海玲，吴永林，等。流行性乙型脑炎病毒活疫苗株SA14-14-2基因稳定性研究。中华微生物学和免疫学杂志。2003.23(11):858-861 ;核酸数据库登陆号AF315119。上述病毒公众均可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。该所保证，可在符合国家和军队有关生物安全管理规定且经相关部门批准后向有资质从事第二类病毒病原体以上的单位提供。上述病毒均属黄病毒属，与西尼罗病毒为同科属成员。实施例2、待检样品LAMP反应检测我国目前尚无西尼罗热病例。本发明以小鼠感染模拟样本代替，病毒感染方法记载在邓永强，姜涛，等，实时RT-PCR检测西尼罗病毒。中华微生物学和免疫学杂志。2005.25(6) :519-522。具体方法为在动物生物安全三级实验室中，取4 6周龄雌性BALB/c小鼠(SPF级，购自军事医学科学院实验动物中心)18只，经腹腔途径注射西尼罗病毒Chin-Ol毒株100 μ I (105PFU/ml)，于感染后第6天取小鼠脑组织样本，保存在_70°C备
用。 采用由实施例I步骤一获得的专用引物分别对采集自编号1-18的感染西尼罗病毒Chin-Ol毒株的小鼠脑组织样本进行检测，以实施例I步骤二的样本2为阳性对照(+)，以样本7为阴性对照(_)。分别将离体的感染西尼罗病毒Chin-Ol毒株小鼠脑组织样本充分研磨后，用ImlDMEM培养基重悬，5000g离心10分钟，取上清210 μ I，提取上清液的RNA (提取方法同实施例I的步骤二)，环等温扩增方法同实施例I的步骤三。检测结果见图5，#1至#18为鼠脑样本I至样本18。可以看出，#12，#18和阳性对照有特异扩增曲线，而其余样本和阴性对照，无特异扩增曲线为阴性。采用文献(邓永强，姜涛，等。实时RT-PCR检测西尼罗病毒。中华微生物学和免疫学杂志。2005. 25(6) 519-522)实时 RT-PCR方法(上游引物为TGATCCATGTAAGCCCTCAGAA，下游引物为ACATTGGGCTTTGAAGTTACAACA，探针为5’ FAM-CGTCTCGGAAGGAGGACCCCA-3’ BHQ1，退火温度为60°C )对#1至#18样本进行检测，检测结果见图6 (有明显扩增曲线的三条从上到下依次为阳性对照、#18、#12)，可以看出，#12,#18和阳性对照有特异扩增曲线，为阳性。其余样本和阴性对照无特异扩增曲线，为阴性。
权利要求
1.一种检测西尼罗病毒的专用引物，包括引物I、引物2、引物3和引物4，所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别为序列表中的序列I、序列2、序列3和序列4。
2.如权利要求I所述的专用引物，其特征在于所述专用引物还包括引物5，所述引物5的核苷酸序列为序列表的序列5。
3.如权利要求I或2所述的专用引物，其特征在于所述专用引物由所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4和所述引物5组成； 所述西尼罗病毒具体为西尼罗病毒Chin-Ol毒株。
4.一种检测西尼罗病毒的环介导等温扩增试剂，包括RNA逆转录酶、Bst DNA聚合酶、2X环介导等温扩增缓冲液、权利要求1-3所述的专用引物。
5.根据权利要求4所述的环介导等温扩增试剂，其特征在于 所述扩增试剂还包括钙黄绿素； 所述扩增试剂由RNA逆转录酶、Bst DNA聚合酶、2X环介导等温扩增缓冲液、权利要求1-3所述的专用引物和钙黄绿素组成； 所述的专用引物中的引物I和引物2在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度为5pmol/L ;所述的专用引物中的引物3和引物4在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度为40pmo I/L ;所述的专用引物中的引物5在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度为20pmol/L ； 所述RNA逆转录酶在所述环介导等温扩增试剂中的浓度为O. 004U/y L ； 所述RNA逆转录酶具体为AMV逆转录酶； 所述Bst DNA聚合酶在所述环介导等温扩增试剂中的浓度为O. 32U/ μ L ； 所述钙黄绿素在所述环介导等温扩增试剂中的浓度为50 μ mol/L ； 所述2X环介导等温扩增缓冲液按照如下方法制备将将氯化钾、硫酸镁、硫酸铵、吐温20、甜菜碱、氯化锰和dNTPs溶于浓度为40mmol/L、PH值为8. 8的Tris盐酸盐缓冲液得到； 在所述2X环介导等温扩增缓冲液中，所述氯化钾的浓度为20mmol/L，所述硫酸镁的浓度为16mmol/L，所述硫酸铵的浓度为20mmol/L，所述吐温20的浓度为O. 2% (质量百分含量)，所述甜菜碱的浓度为I. 6mol/L，所述氯化锰的浓度为lmmol/L，每种所述dNTP的浓度均为 2. 8mmol/L0 所述西尼罗病毒具体为西尼罗病毒Chin-Ol毒株。
6.一种检测西尼罗病毒的试剂盒，包括权利要求4或5所述的环介导等温扩增试剂； 所述西尼罗病毒具体为西尼罗病毒Chin-Ol毒株。
7.权利要求1-3中任一所述专用引物或权利要求4或5所述的环介导等温扩增试剂或权利要求6所述的试剂盒在鉴定和/或辅助鉴定西尼罗病毒中的应用； 所述西尼罗病毒具体为西尼罗病毒Chin-Ol毒株。
8.一种鉴定和/或辅助鉴定待测样品中西尼罗病毒的方法，包括如下步骤 用权利要求1-3中任一所述专用引物或权利要求4或5所述的环介导等温扩增试剂或权利要求6所述的试剂盒中的所述专用引物对待测样品进行环介导等温扩增，检测环介导等温扩增反应产物； 所述环介导等温扩增中，以待测样品的RNA为模板；所述环介导等温扩增反应条件为先60°C _65°C反应35-60min，然后75°C 2min终止反应。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于 所述环介导等温扩增反应条件为先63°C反应35min，然后75°C 2min终止反应； 所述待测样本为小鼠脑； 所述西尼罗病毒为西尼罗病毒Chin-Ol毒株。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于 所述检测环介导等温扩增反应产物的方法为如下I) _4)中的至少一种 1)观察所述环介导等温扩增反应产物，若所述产物在自然光下为黄绿色，且在紫外光下有亮黄色荧光，则待测样本中含有或者候选含有西尼罗病毒；若所述产物在自然光下为橙黄色，且在紫外光下无荧光，则待测样本中不含有或者候选不含有西尼罗病毒； 2)用实时浊度仪检测所述环介导等温扩增反应产物，若有特异扩增曲线，则待测样本中含有或者候选含有西尼罗病毒；若无特异扩增曲线，则待测样本中不含有或者候选不含有西尼罗病毒； 3)电泳检测所述环介导等温扩增反应产物，得到梯度样条带的扩增反应产物，则待测样本中含有或者候选含有西尼罗病毒；若环介导等温扩增反应产物不为梯度样条带，则待测样本中不含有或者候选不含有西尼罗病毒； 所述梯度样条带的大小为100bp-2000bp ； 4)用ScaI酶切所述环介导等温扩增反应产物，电泳检测所述酶切产物，若所述酶切产物为，则待测样本中含有或者候选含有西尼罗病毒；若所述酶切产物不为244bp和164bp的双带，则待测样本中不含有或者候选不含有西尼罗病毒。
全文摘要
本发明公开了一种检测西尼罗病毒的环介导等温扩增试剂盒及其应用。本发明提供的专用引物，包括引物1、引物2、引物3，引物4，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4。本发明的实验证明，本发明的专用引物适用于对西尼罗病毒进行特异性检测。本发明的优点(1)只需在恒定温度就能扩增反应，不需要特殊设备；(2)特异性高；(3)快速高效，扩增反应在35分钟内即可完成；(4)灵敏度高；(5)鉴定方便简单。本发明特别适用于临床标本和野外现场标本的快速检测。
文档编号C12Q1/68GK102952892SQ20111024123
公开日2013年3月6日 申请日期2011年8月22日 优先权日2011年8月22日
发明者秦成峰, 姜涛, 刘娟, 李晓峰, 邓永强, 秦鄂德 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所