专利名称：与aldh1a3基因相关的胶质母细胞瘤生存预后试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及疾病诊断领域，特别是涉及用于胶质母细胞瘤生存预后试剂盒。
背景技术：
胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme, GBM)是成人最为常见的原发性脑肿瘤，其生存预后极差，患者中位生存期约为12-14个月。尽管手术、放疗和化疗技术不断进步，但这一指标在过去20年内从未得到明显改善[1，2]。hteller的研究小组[3]首先报道了恶性胶质瘤中MGMT基因高甲基化对烷化剂治疗敏感性和生存预后的关系。MGMT基因甲基化状态是第一个可用于评估恶性胶质瘤临床预后的分子标记物，MGMT基因沉默与替莫唑胺(temozolomide，TMZ)疗效相关。GBM患者如果存在MGMT基因高甲基化，接受烷化剂 TMZ化疗后2年生存率将从显著提高至46% [4]0这项里程碑式的发现是恶性胶质瘤治疗领域近35年来取得的最重要进展，使人们对GBM的治疗理念发生了巨大的转变。在肿瘤起源与进展过程中，癌症相关基因的DNA编码区发生表观遗传学异常非常多见，尤其是甲基化导致抑癌基因的表达沉默[5，6]。在肿瘤细胞周期、侵袭、凋亡或DNA修复过程中，位于基因启动子区的CpG岛甲基化异常往往与基因的转录沉默相关[5，6]。目前在GBM中已经发现DNA甲基化可以导致多种基因的表达沉默，涉及的重要细胞功能包括细胞周期(pl6INK4a，pl5INK4b)、DNA修复和基因组完整性(MGMT，MLH1)、肿瘤抑制(RB1， VHL, EMP3，RASSF1A，BLU)、以及肿瘤侵袭和凋亡(DAPK，TIMP3，CDHl，PCDH-gamma-Al 1，TMSl/ ASC, CASP8)等等[7-13]。乙醛脱氢酶Kaldehyde dehydrog enase 1，ALDH1)是乙醛脱氢酶家族成员之一， ALDH1A3是ALDHl的一个亚型。ALDHl是催化细胞内乙醛氧化为乙酸的细胞溶质酶，参与肝脏的解毒作用，也是正常干细胞与肿瘤干细胞(tumorstem cell,TSC)生长和分化的必需物质。目前研究表明，ALDHl可以作为乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌、肺癌、结直肠癌以及胶质母细胞瘤等TSC的通用标记物之一 [14-18]，它是目前CSC标记物研究领域的热点之一，特别是作为乳腺癌干细胞的标记物。在乳腺癌临床研究中，ALDHl的高表达与乳腺癌的发生、发展、转移和预后密切相关。Ginestier等首次证实ALDHl是一种新型的乳腺癌肿瘤干细胞标志物，并且是乳腺癌患者预后的独立危险因素，与肿瘤分级、雌激素或孕激素表达有一定的相关性。Morimoto等[19]通过免疫组化技术对203例乳腺癌患者进行回顾性研究，也发现 ALDHl是乳腺癌侵袭性生物学行为的特征表型，与雌激素、孕激素、HER2及Ki67之间具有相关性，但Cox比例风险模型分析显示ALDHl不是独立的预后因子。本发明在此报道ALDH1A3作为在胶质母细胞瘤中作为新的诊断和预后生物标志物和潜在的治疗剂靶标的鉴定，还提供了其在胶质母细胞瘤发生中的应用。
发明内容
因此，本发明涉及与胶质母细胞瘤相关的甲基化表达水平的发现，以及开发人胶质母细胞瘤预后的靶标的发现。
在本发明的一个实施方式中提供一种用于胶质母细胞瘤生存预后试剂盒，其特征在于所述试剂包括(1)从原发性胶质母细胞瘤患者的肿瘤组织样品中提取DNA的试剂盒和任选地所述提取DNA的试剂盒使用说明书；和(2)分析所述提取DNA中的基因ALDH1A3 的甲基化水平的试剂盒和任选地所述基因ALDH1A3的甲基化水平的试剂盒的使用说明书。在本发明的另一个实施方式中，提供一种用于胶质母细胞瘤生存预后试剂盒，其中所述试剂盒进一步地包括检测ALDH1A3基因中CpG位点甲基化水平的试剂盒。在本发明的另一个实施方式中，检测ALDH1A3基因中CpG位点甲基化水平的试剂盒包括检测ALDH1A3基因CpG位点cgl9224278、cg23191950或cg26509022中的至少一个的甲基化水平的试剂盒。在还更一个实施方式中，检测ALDH1A3基因中CpG位点甲基化水平的试剂盒包括检测ALDH1A3基因CpG位点cgl92M278、cg23191950或cg^509022中至少二个的甲基化水平。在本发明的更进一步实施方式中，分析所述提取DNA中的基因ALDH1A3的甲基化水平的试剂盒是DNA芯片甲基化芯片试剂盒。在本发明的更进一步实施方式中，所述检测 ALDH1A3基因中CpG位点甲基化水平的试剂盒是甲基化焦磷酸测序试剂盒。在本发明的更进一步的实施方式中，检测ALDH1A3基因检测用PCR引物和测序引物为GGGTTTTGGGATGGAAG ；生物素-ACRTACCCTACTCTTAAATCCAA ；和 AGGGTTTAGGGGAGAT。
图1是原发性GBM全基因组甲基化程度的分布情况的图，图IA是随机抽取的一例样本；图IB为所有样本的平均值。图2是原发性GBM不同生存预后分组的特征性DNA甲基化谱的图。图3是原发性GBM根据甲基化水平差异最为显著的10个基因的聚类分析图。图4是ALDH1A3甲基化与原发性GBM患者生存预后的关系的图，图4A为DNA甲基化焦磷酸测序结果；图4B为生存率分析曲线。图5是MGMT甲基化与原发性GBM患者生存预后的关系的图，图5A为DNA甲基化焦磷酸测序结果；图5B为生存率分析曲线。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。1.患者资料与标本来源总计100例原发性胶质母细胞瘤入组本项研究，全部来自北京天坛医院胶质瘤治疗中心。所有患者于2006年1月至2008年12月接受手术切除、放疗和烷化剂化疗，术后病理诊断均为原发性胶质母细胞瘤(依据2007年WHO中枢神经系统肿瘤分类标准)。所有患者中男性56例，女性44例；年龄17-70岁，平均(43. 8士 14. 5)岁。根据患者总生存期(0 ，随机选择长生存期组13例(OS > 18个月)和短生存期组20例(OS < 9 个月)完成全基因组DNA甲基化芯片；其余67例患者作为独立验证组。正常脑组织对照标本3例取自天坛医院同期脑外伤、脑皮质造瘘病例。该研究通过医院医学伦理委员会批准并签署患者知情同意书。2.标本基因组DNA提取
2. 1主要仪器
权利要求
1.一种用于胶质母细胞瘤生存预后试剂盒，其特征在于所述试剂包括(1)从原发性胶质母细胞瘤患者的肿瘤组织样品中提取DNA的试剂盒和任选地所述提取DNA的试剂盒使用说明书；和(2)分析所述提取DNA中的基因ALDH1A3的甲基化水平的试剂盒和任选地所述基因ALDH1A3的甲基化水平的试剂盒的使用说明书。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括检测ALDH1A3基因中位于基因启动子区的CpG岛甲基化水平的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括检测ALDH1A3基因CpG位点 cgl9224278、cg23191950或cg^509022中的至少一个的甲基化水平的试剂盒。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括检测ALDH1A3基因CpG位点 cgl9224278、cg23191950或cg26509022中至少二个的甲基化水平。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中分析所述提取DNA中的基因ALDH1A3的甲基化水平的试剂盒是DNA芯片甲基化芯片试剂盒。
6.根据权利要求2所述的试剂盒，其中所述检测ALDH1A3基因中CpG位点甲基化水平的试剂盒是甲基化焦磷酸测序试剂盒。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，检测ALDH1A3基因检测用PCR引物和测序引物为 GGGTTTTGGGATGGAAG ；生物素-ACRTACCCTACTCTTAAATCCAA ；和 AGGGTTTAGGGGAGAT。
8.一种用于胶质母细胞瘤生存预后的分子标志物，其是ALDH1A3基因。
全文摘要
本发明涉及与ALDH1A3基因相关的胶质母细胞瘤生存预后试剂盒，试剂盒包括从原发性胶质母细胞瘤患者的肿瘤组织样品中提取DNA的试剂盒和任选地所述提取DNA的试剂盒使用说明书；和分析所述提取DNA中的基因ALDH1A3的甲基化水平的试剂盒和任选地所述基因ALDH1A3的甲基化水平的试剂盒的使用说明书。本发明还提供一种用于胶质母细胞瘤生存预后的分子标志物ALDH1A3基因。
文档编号C12Q1/68GK102367474SQ20111024459
公开日2012年3月7日 申请日期2011年8月24日 优先权日2011年8月24日
发明者张伟, 江涛 申请人:江涛