专利名称：花生发育基因及其应用和检测方法
技术领域：
本发明涉及农业生物技术领域，特别涉及一种花生发育基因Ah56，本发明还涉及所述花生发育基因的用途以及利用荧光定量PCR检测所述基因表达量的方法。
背景技术：
花生是我国主要的油料作物和经济作物，是我国最具竞争力的出口创汇农产品， 其主要分布在亚热带的干旱及半干旱地区。花生的生长发育过程中会经历多种非生物胁迫，如干旱、高盐和极端温度等，这些逆境胁迫都对花生的生长发育产生不利的影响而最终影响其产量和品质。当花生感应到胁迫信号后，会通过一系列信号转导最后启动相关基因表达，协助花生适应或抵御逆境。开关基因是指其编码的产物包括信号传递和调控基因表达的转录因子、感应和传导胁迫信号的蛋白激酶以及在信号传导中起重要作用的蛋白酶。 而转录因子也称为反式作用因子，是指能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性作用的DNA结合蛋白，通过它们之间以及与其它相关蛋白之间的相互作用，激活或抑制转录。据研究报道，抗性基因的研究已由抗生物逆性如抗病、抗虫的基因，向抗非生物逆性如抗寒、抗旱、抗盐等基因转移，而非生物逆性的研究又由编码某种特定产物的功能基因向信号传导和基因表达调控等开关基因的方向发展。AP2/EREBP转录因子家族是植物所特有的一类转录因子，这一家族在植物的生长、 发育以及生理生化的信号传导中发挥着重要的作用，在逆境诱导基因的表达中也起着信号转导的作用。根据其因子中所含AP2功能域数量的不同，将其分为3类，第一类是AP2亚家族；第二类是EREBP亚家族；第三类是RAVl和RAV2。当中AP2亚家族成员与植物的发育有密切联系，如花器官形态和发育的决定、控制形成花序分生组织及胚珠和种子的正常发育等。但目前，AP2基因EREBP亚家族的研究比较透彻，包括结构、结合位点和参与作用等，相比较而言对AP2亚家族基因在植物花发育中的作用的研究比较少，而且研究深度不够。
发明内容
为了研究花生的发育状况，本发明采用如下的技术方案本发明一方面涉及一种花生发育基因，其全序列为ACGCGGGGTCAACAGCTTCAAAGCCCACGAAGCTTTACAGAGGGGTGAGGCAGAGGCACTGGGGAAAGT GGGTGGCTGAGATCAGACTCCCCAAGAACCGTACAAGGCTCTGGCTCGGAACCTTCGACACCGCAGAAGGGGCTGCT TTGGCTTACGACAAAGCCGCTTACAAGCTCCGCGGCGACTTTGCCAGACTCAACTTCCCTAACCTCCGTCACAACGG CTCCTCCGTCGGCGGTGAATTCGGCGAGTACAAGCCGCTACACTCCTCTGTCGACGCAAAGCTTCAGGCCATATGCG AAGGCCTCGCCGAGATGCAGAAGCAGGGAAAGACGGAGAAGACGAAGCGGTCCAAAGCAGGCGCTGCTGGTTCCAAA GCTGCGGTTTCTAAGCCGGCGGCGGAGGACGTGAAGGCTTGTTGCAAGGTGGAAGAAGCCGCAGCGTCGCCGCCCCC CGAGAGCGATGGTGGTTCGTCGGAGGATTCTTCGCCGCTGTCAGATCTGACGTTTGGTGATGTTGATGACGTTGGGG ATAATTTTAATCTTCAGAAGTTCCCTTCGTATGAGATTGATTGGGATTCTCTGTGAATTTGCTAATAAGGCCGTTGTTGATGCATGCATAAATAGTAATCTAGTTGTAGAGGGTGCCGCTGCAATGGAATTTTTGACACTTGCAGGGCTACTCC CCTTAGGTTATGCTCTATTTTATTTTATTTTATTTTTAGGCCCTTCCATAGATCTCATTATTCTGTTCATATGCTGT AGAAATCTCTATCCTTGGTCACAGCTTGTTTTTTTCTTGCTGCTTGACCTGGCTTTTATTACTTTATTATTATGTAA GTTTATTTTCTCTGTAATTCCATTCTCCCTTGTATCAAGCTTATTGTACTACTCATCTTCCTTGTTATTATTAAGCA TTTTGAAGAGATAATATAATACTAGTAAATATACTATTGTTCCGTAGTTTATGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAGT。本发明还涉及上述花生发育基因在构建载体、转基因以及检测花生发育状况中的应用。另外一方面，本发明还涉及利用荧光定量PCR检测所述基因表达量的方法，其特征在于包括如下步骤设计一对PCR引物Ah56f-4和Ah56r_4，提取花生种皮总RNA，反转录为cDNA， 以其为模板，进行PCR扩增，回收扩增产物，将PCR产物与pMD-18连接，然后转化大肠杆菌 DH5 α，经菌落PCR鉴定后，阳性克隆大量扩增，提取质粒，将取得的质粒依次稀释得到浓度梯度；利用罗氏荧光定量PCR软件分析并计算出相关的线性方程，作图得标准曲线；在Roche荧光定量PCR仪进行待测样品的荧光定量PCR，根据程序自动给出的Ct 值，对照标准曲线，即可得出所测样品的目的基因拷贝数。本发明公开了花生Ah56基因荧光定量检测方法，其优点如下1)实验设计简单应用STOR Green法测定目的基因表达量只需设计一对引物即可；2)通用性好不需要设计探针，无需设计多个探针即可快速检验多个基因；3)稳定性强荧光定量PCR结果相当稳定，因为域值设置在指数扩增期。在此阶段，各反应组分浓度相对稳定，没有副作用，Ct与荧光信号的对数呈线性关系。与终点法相比Ct值能更稳定，更精确地反映起始模板的拷贝数；4)能够进行熔点曲线分析，检验扩增反应的特异性，操作简单、自动化程度高，并且速度快、高通量。
图1花生Ah56基因的开放读码框分析结果
图2花生Ah56的Blast分析结果；
图3:Ah56基因的标准曲线；
图4花生Ah56基因在根中的相对表达量；
图5花生Ah56基因在叶中的相对表达量；
图6花生Ah56基因在茎中的相对表达量；
具体实施例方式
具体实施例方式实施例1 花生生长发育基因Ah56的获得1、花生组织总RNA的提取
实验准备所用器皿都需经过特殊处理。耐高温仪器用具200°C烘烤8小时，其他器皿用0. 1 %的DEPC浸泡12小时，然后高压灭菌去除DEPC。溶液试剂用0. 1 %的DEPC处理(37°C放置12小时后高压消毒)，不耐高温的试剂直接用DEPC-H2O配制。总RNA提取按 GIBCOL的Trizol Reagent的操作要求，具体步骤如下1)取花生幼嫩叶片在液氮中研磨成粉末后，每50mg组织加入1毫升Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。2) 12000g，2_8°C离心10分钟，将上清液转移入一干净离心管中，研磨液室温放置 5分钟，上清液15-30°C静置5分钟。3)以用勻浆的Trizol试剂计，每ImL加入0. 2mL的氯仿，盖紧离心管盖，剧烈摇晃 15 秒，15-30°C静置 2-3 分钟。12000g，2_8°C离心 15 分钟。4)上层水相约为用以勻浆的Trizol试剂体积的60%，将上层水相移入一干净离心管。按每毫升iTrizol液加0. 5mL异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。5)弃去上清液，以用勻浆Trizol试剂计，每ImL加入至少ImL的75%乙醇。涡旋混合，不超过7500g，2-8°C离心5分钟。6)小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度，甚至RNA不溶。加入少量无RNase水(约50 μ L)溶解，其间用枪头吹打数次，并置55-60°C的水浴中10分钟助溶。
7)电泳检测总RNA的纯度和亮度。
整个操作过程始终戴口罩与手套操作，并频繁更换手套，尽量避免RNase污染。 2.单链cDNA合成，具体参照Takara逆转录试剂盒MML-V方法 First strand cDNA合成试验操作方法 Microtube 管中
权利要求
1.一种花生发育基因，其全序列为ACGCGGGGTCAACAGCTTCAAAGCCCACGAAGCTTTACAGAGGGGTGAGGCAGAGGCACTGGGGAAAGTGGG TGGCTGAGATCAGACTCCCCAAGAACCGTACAAGGCTCTGGCTCGGAACCTTCGACACCGCAGAAGGGGCTGCTTTG GCTTACGACAAAGCCGCTTACAAGCTCCGCGGCGACTTTGCCAGACTCAACTTCCCTAACCTCCGTCACAACGGCTC CTCCGTCGGCGGTGAATTCGGCGAGTACAAGCCGCTACACTCCTCTGTCGACGCAAAGCTTCAGGCCATATGCGAAG GCCTCGCCGAGATGCAGAAGCAGGGAAAGACGGAGAAGACGAAGCGGTCCAAAGCAGGCGCTGCTGGTTCCAAAGCT GCGGTTTCTAAGCCGGCGGCGGAGGACGTGAAGGCTTGTTGCAAGGTGGAAGAAGCCGCAGCGTCGCCGCCCCCCGA GAGCGATGGTGGTTCGTCGGAGGATTCTTCGCCGCTGTCAGATCTGACGTTTGGTGATGTTGATGACGTTGGGGATA ATTTTAATCTTCAGAAGTTCCCTTCGTATGAGATTGATTGGGATTCTCTGTGAATTTGCTAATAAGGCCGTTGTTGA TGCATGCATAAATAGTAATCTAGTTGTAGAGGGTGCCGCTGCAATGGAATTTTTGACACTTGCAGGGCTACTCCCCT TAGGTTATGCTCTATTTTATTTTATTTTATTTTTAGGCCCTTCCATAGATCTCATTATTCTGTTCATATGCTGTAGA AATCTCTATCCTTGGTCACAGCTTGTTTTTTTCTTGCTGCTTGACCTGGCTTTTATTACTTTATTATTATGTAAGTT TATTTTCTCTGTAATTCCATTCTCCCTTGTATCAAGCTTATTGTACTACTCATCTTCCTTGTTATTATTAAGCATTT TGAAGAGATAATATAATACTAGTAAATATACTATTGTTCCGTAGTTTATGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AGT。
2.权利要求1所述的花生发育基因在构建载体、转基因和/或检测花生发育状况中的应用。
3.利用荧光定量PCR检测权利要求1所述花生发育基因表达量的方法，其特征在于包括如下步骤设计一对PCR引物Ah56f-4和Ah56r-4，提取花生种皮总RNA，反转录为cDNA，以其为模板，进行PCR扩增，回收扩增产物，将PCR产物与pMD-18连接，然后转化大肠杆菌，经菌落 PCR鉴定后，提取质粒，将取得的质粒依次稀释得到浓度梯度；利用罗氏荧光定量PCR软件分析并计算出相关的线性方程，作图得标准曲线；在Roche荧光定量PCR仪进行待测样品的荧光定量PCR，根据程序自动给出的Ct值，对照标准曲线，即可得出所测样品的目的基因拷贝数；其中Ah56f-4 :5’ -CCAAAGCTGCGGTTTCTAAG-3’Ah56r-4 :5’ -ATCCCCAACGTCATCAACAT-3，。
全文摘要
本发明公开了特别涉及一种花生发育基因Ah56，该基因参与花生由苗期转换至开花期这段时间内的某种应答反应过程，在花生发育过程中发挥重要作用。此外，本发明还公开了该基因的用途和利用荧光定量PCR检测所述基因表达量的方法。
文档编号C12N15/63GK102367443SQ20111024473
公开日2012年3月7日 申请日期2011年8月25日 优先权日2011年8月25日
发明者刘登望, 单世华, 周西, 李春娟, 李林, 闫彩霞 申请人:山东省花生研究所