专利名称：一种植物表达载体及其在棉花纤维性状改良中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植物表达载体及其应用，具体涉及表达生长素合成相关基因的植物表达载体及其在棉花纤维性状改良中的应用，属于植物基因工程领域。
背景技术：
棉花是世界上最重要的天然纤维作物，也是最重要的经济作物。我国是世界上最大的纺织品生产国和消费国，棉花产业在我国的国民经济中具有举足轻重的地位。近年来，随着人民生活水平的提高和纺织技术的革新，对棉花纤维品质的要求也相应提高；尤其是近年来以气流纺纱取代环锭纺纱的技术革命，要求更长、更强、更细和更整齐的纤维。但是，目前我国棉花推广品种大都纤维品质偏低，长度单一，纤维强度偏低，纤维较粗，缺乏纺 60支以上的高档棉纱的品种，远不能满足市场的需要。这直接导致了我国原棉在国际市场上缺乏竞争力。同时也导致了我国棉花生产近年来一直处于一种结构性矛盾的困境一方面原棉产量逐年下降，而库存原棉仍不断增加，造成大量资金积压；另一方面进口棉花数量却不断上升。随着我国加入世界贸易组织，我国原棉的结构性矛盾变得更为突出。能否迅速提高我国棉花品种的纤维产量和品质，直接关系到我国棉花产业的兴衰和纺织品生产加工业的生存与发展。马克隆值是指棉花纤维成熟度和细度的综合指标，是棉纤维重要的内在质量指标之一。根据棉花使用价值的高低，将马克隆值分为A、B、C三级。A级马克隆值范围为 3. 7^4. 2，品质最好；B级马克隆值范围为3. 5 3. 6和4. 3^4. 9 ；马克隆值在3. 4及以下和5. 0 及以上的为C级。现在美国规定马克隆值在3. 7、. 2的棉花，每磅加1.1美分；马克隆值在2. 5以下的，每磅扣15. 6美分。棉花栽培品种主要是陆地棉，而优良纤维品质基因主要源于二倍体的瑟伯氏棉(纤维强度)、异常棉(纤维强度与细度)以及四倍体的海岛棉(纤维强度与细度)等。这些优良性状基因的利用，却在常规育种中受到诸多限制，单靠现有的棉花遗传种质资源和常规育种手段已经难以大幅度提高棉花产量，难以满足快速发展的纺织工艺革命对纤维品质的要求。利用基因工程技术育种可以打破物种间的遗传障碍，实现优良目的基因的定向转移，同时具有后代易于稳定，育种周期短等优点，这为棉花纤维产量和品质的改良提供了新的途径。但是目前人们还未得到与棉花纤维形成，以及产量和品质 (强度、细度和长度等)直接相关的基因，使得利用基因工程改良棉花纤维缺乏有效的目的基因。人们对棉花纤维发生、发育和品质形成的分子机理也知之甚少。这些都极大地阻碍了对棉花纤维进行产量和品质改良的进程。现有研究表明，棉花纤维是由棉花胚珠的外珠被表皮细胞经分化起始、伸长(初生壁合成)、增厚(次生壁合成)和成熟脱水四个过程发育而成的单细胞纤维.棉花纤维细胞的最终长度可达20-30mm，高的可达35-40mm，其长径比达1，000-3，000。这样高的径长比是纤维细胞剧烈伸长的结果，其中必然有促进细胞生长和伸长的植物激素参与。纤维细胞的起始与伸长都与生长素(Auxin，如吲哚乙酸indole-3-acetic acid, IAA)密切相关。利用离体培养的棉花胚珠，人们发现未受精的胚珠培养后不能产生纤维，但在培养基中添加GA和IAA能诱导纤维的生长；生长素拮抗剂处理表明生长素是纤维原始体伸长的关键因素 (Beasley CA,1973, Science，1791003—1005 ；Beasley CA 等，1973，American J Bot,60, 130-139)。Giavalis等2001年报道了 GA3和IAA处理对培养的未受精胚珠纤维数量的影响，研究结果表明，在开花前或开花后施用外源GA和IAA，可以使培养的未受精胚珠纤维的数量显著增加(Giavalis S 等，2001，J Cotton Sci, 5, 252-258). Seagull 和 Giavalis 2004年进一步发现，在自然生长状态下，GA3* IAA处理棉花的蕾或铃，可以明显增加纤维细胞的数量。而且IAA处理开花前或开花后的棉铃可使单个棉籽上的纤维细胞数量增加 58%( Seagull RW 等，2004，J Cotton Sci，，8，105-111)。以上研究都表明 IAA 能促进棉花纤维的产生，与纤维发育生长的关系密切。外源生长素施用虽然有很好的效果，但在生产上往往难以做到将生长素逐一涂抹在花或蕾铃上，工作量甚大，劳动力成本高，大面积推广难以实现。而且，生长素的大量使用，既增加了生产成本，又会带来环境污染。相比之下，通过控制生长素生物合成酶基因，从内源的角度来调节特定器官中的生长素含量，促进收获器官的发育，是个十分有效的策略。 这一策略至少具有下述几方面的优点1)效率高、成本低，因为一旦将生长素生物合成酶基因导入植物，就无需外加施用生长素或其它处理。而且，外源施用生长素是通过扩散进入细胞，而内源激素则产生自细胞内。因此，用转基因内源控制生长素的效果往往比外源施用更好；2)对作物负面影响小，由于生长素的作用浓度很低，浓度过高或过低均会对植物的发育带来不良影响。而内源表达生长素合成酶基因，在表达水平和表达部位合适的情况下，就可以做到只对特定目标器官(组织)起作用，而不影响植物的其它部分的正常发育；3)与外源施用生长素和人工合成生产调节物质相比，内源调控生长素合成酶基因对环境污染小， XiA^^j^itj^W^^iii^ (Li Y ^,2004, Transgenics of plant hormones and their potential application in horticultural crops. In: Genetically Modified Crops: their development, uses, and risks. New York: Food Products Press,101-112)。然而，利用内源植物生长素合成酶基因难以改良棉花纤维产量和品质。1999年 John ME将涉及生长素IAA生物合成的两个酶基因iaaM和iaaH置于纤维特异性启动子E6 下，通过农杆菌介导转入陆地棉DP50中，结果发现IAA含量在大多数转基因株系里都有2-8 倍的增加，然而纤维长度，细度和强度等品质与对照野生型相比并没有显著差异(Basra AS 等，1999，Cotton Fiber, New York: Food Products Press，271-292)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植物表达载体，将本发明植物表达载体应用于棉花纤维性状的改良中，能有效地提高棉花纤维的产量与品质。本发明的另一目的在于提供上述植物表达载体在棉花纤维性状改良中的应用。本发明的又一目的在于提供一种编码表达生长素合成相关的基因，将所述基因整合到棉花基因组中，可得到高产量和品质的转基因棉花纤维。本发明的再一目的在于提供含上述植物表达载体的转化体。本发明的再一目的在于提供含上述植物表达载体的转基因植物的制备方法。本发明的目的是通过如下技术方案实现的
一种植物表达载体，其至少含有由植物生长素IAA生物合成相关的基因和植物纤维、种皮特异性启动子BAN基因启动子组成的表达生长素合成相关基因的核苷酸，所述植物生长素IAA生物合成相关基因为土壤根癌农杆菌tms (tumour morphology shooty)基因，也称iaal基因。本发明植物表达载体，其核苷酸具有如SEQ ID No. 11所示的序列。本发明植物表达载体，其具有如图1 (b)所示的结构。上述植物表达载体在棉花纤维性状改良中的应用。一种编码表达生长素合成相关基因的核苷酸，其具有如SEQ ID No. 11所示的核苷酸序列。一种含上述植物表达载体的转化体。一种含上述植物表达载体的转基因植物的制备方法，包括以下步骤
1)种皮和纤维特异表达启动子BAN的获得；
2)生长素IAA合成相关基因的获得；
3)将步骤1)中分离克隆到的特异启动子与步骤2)中分离克隆到的生长素合成相关基因进行融合，构建特异表达生长素合成相关基因的植物表达载体；
4)将步骤幻得到的特异表达生长素合成相关基因的植物表达载体整合到棉花基因组
中；
5)将通过步骤4)获得的棉花进行进一步的培养，栽培，并获得转基因的棉花植株。其中，步骤3中所述的特异启动子与生长素合成相关基因融合以构建特异表达生长素合成相关基因的表达载体的方法为本领域的常规方法，使用的载体可以是植物转基因领域所使用的常规载体。其中，步骤4中所述的将表达载体整合到棉花的基因组所使用的方法为常用的植物转基因方法，比如根癌农杆菌介导法或基因枪法。本发明中所指的“棉花纤维性状”是指棉花纤维的数量和品质性状，包括纤维的数量多少、长度、成熟度、细度、强度、整齐度等。本发明中所指的“转基因棉花”是指通过分子生物学、生物技术手段，将其他生物的基因转移到棉花中，从而使被改造棉花的遗传物质得到改造的棉花。用于改造的基因可以来源于植物、动物以及微生物或者人工合成改造。本发明中所指“衣分”是指籽棉上纤维重量对籽棉重量之比，以百分率表示。也就是纤维重量占整个种子及纤维总重量的比例。本发明中所指“纤维强度”是指拉伸一束纤维在即将断裂时所能承受的最大负荷， 以厘牛/特克斯(cN/tex)表示，特克斯是1000米纤维的克重数。本发明通过大量研究和分析以及前期实验，认为John等未能成功并不意味着利用植物激素生物合成酶基因来提高棉花产量和改善纤维品质的策略是不可行的。因为，既然外源施用IAA等植物激素对棉花纤维细胞数量的增加和纤维品质的提高有明显的作用， 那么，通过控制植物激素合成酶基因，从内源角度来调节激素含量，促进棉花纤维发育，应该是可行的。而现有研究的结果未能取得预期效果的原因关键在于未能找到合适的启动子。因此选择适当的启动子，在棉花的特定部位、发育的特定时间、以适宜的强度控制与植物激素合成相关基因的表达，精准的调控植物体内激素的作用浓度、作用时间与作用部位，才可以有效的影响棉花纤维的生长发育，获得预期的效果。但是，启动子种类极为繁多，不可能预料哪种启动子连接上生长素相关基因后就能对棉花纤维有效。本发明根据棉花纤维发育的特点，在大量筛选启动子的基础上，创造性地采用了纤维、种皮特异启动子 BAN(Anthocyanidin reductase, BANYULS)基因启动子(来源于拟南芥)为主要元件构建新的基因表达载体，并建立起了一整套与之相适应的改良棉花纤维性状的方法。本发明方法在选定了启动子和目的基因的情况下，可将本发明选用的启动子和目的基因融合成的新基因转入本领域常用的载体中构建成表达载体再转入棉花中。显然，上述表达载体可以构建成含单个基因的单价载体，也可以构建含多基因的双价或三价等类型的载体。在使用本发明方法改良棉花的过程中，既可以只在一个部位表达一个目的基因，也可以在多个部位和多个发育阶段表达多个基因，本发明方法已经提供了技术方案。本发明改良棉花纤维性状的方法，是通过在棉花的种皮和纤维特异表达生长素合成相关基因，进而调控生长素合成酶的表达，通过内源调控棉花特定组织器官中相应激素的含量的方式，控制棉花种子发育以及纤维发育的起始和伸长，达到改良棉花纤维产量和品质(细度和成熟度)的目的。试验结果证明，经本发明改良棉花纤维性状的方法所改良的棉花纤维的数量明显增多，产量明显增加，棉花纤维品质明显改良；其种子数量增加，衣分明显提高。本发明方法简便易行，效果显著，能为纺织工业带来高产，高品质的纤维原料，产生巨大的经济效益。
图1 (A)特异启动子BAN调控下的生长素合成基因表达载体Ban-iaaM的构建流程Km，卡那霉素抗性基因；Amp，氨苄青霉素抗性基因；NPTII，新霉素磷酸转移酶基因； GUS, b-葡萄糖酸苷酶基因；35S，来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；Pnos，冠瘿碱合成酶基因启动子；nos，冠瘿碱合成酶基因终止子；LB，T-DNA左边界；RB，T-DNA右边界。 用于构建植物表达载体的骨架载体为PBI121基础上改造的p5载体，具有CaMV 35S启动子调控下的GUS基因，便于在植物遗传转化的过程中对转化子进行GUS染色的筛选。图1 (B)本发明植物表达载体结构图2 特异表达的植物生长素合成酶基因iaaM在转BAN: :iaaM基因棉花中的RT-PCR分
析；
A, BAN: iaaM转基因棉花开花当天胚珠中iaaM表达量分析图。1、31、36、39、44、45和 53为不同BAN: iaaM转化子编号；WT为野生型棉花植株用作对照。结果在7个转化子中 1#，31#，36#，39#和44#株系中检测到了 ^^基因的明显表达；
B，BAN: iaaM转基因棉花39#胚珠不同发育时期iaaM表达量分析图。iaal的在纤维起始阶段有很高的表达，在开花后4天明显降低；
C，BANziaaM转基因棉花39#纤维不同发育时期iaaM表达量分析图。在纤维发育后期，纤维中iaaM基因表达持续到开花后30。图3 =BAN iaaM转基因棉花株系BM39与野生型棉花胚珠表面扫描电镜比较； 开花当天的胚珠直接冷冻后取相似部位用电镜放大500倍。BAN: iaaM转基因胚珠表
面纤维起始分布较对照明显增多。比例尺表示100 μ m,点间距为10 μ m。图4 =BAN: iaaM转基因棉花早期纤维数量统计结果表；转基因植株开花两天后的胚珠上纤维的数量均比野生型棉花有所增长。31#、39#和44# 三个转化子单胚珠纤维数分别比野生型提高21. 1%、29.4%和52.4%。其中39#和44#比野生型达到显著差异(t-test，P<0. 05)。图5 BAN: iaaM转基因棉花种子和野生型比较；BAN: iaaM转基因棉花籽棉经皮辊轧花机轧花后，种子较野生型略小，但其上覆着的短绒明显低于野生型。比例尺为Icm;
图6 :BAN: iaaM转基因棉与野生型花单株铃数对照图7: 8々^3311转基因植株8106和8109不同株系衣分比较图；Null表示不同株系的非转基因分离世代。WT，野生型。
具体实施例方式以下结合附图对本发明进行进一步的详细说明，但以下说明并不对本发明进行限定，任何对本发明的变形和改变，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。本发明实例中的试剂药品未做具体说明的均为普通市售，材料方法未做具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell，2001)。实施例一棉花基因组的制备 1. DNA的提取
选取棉花幼叶0.5-1 g,在液氮中迅速研磨成粉，加入3 mL 65°C预热的CTAB提取液 (100 mmol/L Tris-HCl (pH8. 0),20 mmol/L EDTA (ρΗ8· 0)，1.5 mol/L NaCl，2% CTAB (W/ V), 4% PVP40 (ff/V)和2%巯基乙醇(V/V)，PVP和巯基乙醇使用前加入)，快速振荡混勻。 65°C水浴30 min，然后加入1 mL 5 mol/L KAc，冰浴20 min后，用等体积的氯仿异戊醇 (24:1)抽提1次(10，000 r/min，4°C离心5 min)，取上清，加入2/3倍体积的_20°C预冷异丙醇，混勻，静置约30 min，用玻棒挑出絮状沉淀，用75%的乙醇反复漂洗数次，再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重悬于500 mL TE中。加入1 mL RNaseA (10 mg/mL)，37°C处理1 h。再用酚(pH8.0):氯仿异戊醇(25:24:1)和氯仿异戊醇(24:1)各抽提1次(10,000 r/min，4°C离心5 min)，取上清，乙醇沉淀。沉淀用75%的乙醇漂洗，风干，溶于200 mL TE 中，-20 °C保存备用。2. RNA 的提取
选取约3 g新鲜棉花材料，在液氮中迅速磨成精细粉末，装入50 mL离心管，加入15 mL 65°C预热的 RNA 提取液 CTAB (ff/V), 2% PVP (ff/V), 100 mmol/L Tris-HCl (pH8. 0)， 0. 5g/L Spermidine, 2, 0mol/L恥(1二％巯基乙醇(V/V，使用前加入))，颠倒混勻。65°C水浴 3 10 min，期间混勻2 3次。氯仿异戊醇(24:1)抽提2次(10，000 r/min，室温，5 min)。 取上清，加入1/4体积10 mol/L LiCl溶液，4°C放置6 h，以氯仿异戊醇(25: : 1)各抽提 1次(10，000 r/min，室温，5 min)。加2倍体积的无水乙醇，在_70°C冰箱沉淀30 min以上。 12,000 r/min，4°C离心20 min，弃上清。沉淀用200 mL的DEPC处理水溶解。酚(pH4. 5): 氯仿异戊醇(25: : 1)、氯仿异戊醇(24:1)各抽提1次(10，000 r/min，室温，5 min)。 加1/10体积3 mol/L NaAc溶液和2. 5倍体积的无水乙醇，在_70°C冰箱沉淀30 min以上。 12，000 r/min，4°C离心20 min，弃上清。沉淀用70%的酒精漂洗一次，风干。加200 mL的 DEPC处理水溶解。用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测RNA的质量。
3.基因组序列的PCR扩增
权利要求
1.一种植物表达载体，其特征在于所述植物表达载体至少含有由植物生长素IAA生物合成相关的基因和特异性启动子BAN基因启动子组成的表达生长素IAA合成相关基因的核苷酸；所述植物生长素IAA生物合成相关基因为基因。
2.如权利要求1所述的载体，其特征在于所述核苷酸具有如SEQID No. 11所示的序列。
3.如权利要求1、2或3所述的植物表达载体，其具有如图1(b)所示的结构。
4.如权利要求1 3任一项所述的植物表达载体在棉花纤维性状改良中的应用。
5.一种编码表达生长素IAA合成相关基因的核苷酸，其具有如SEQ ID No. 11所示的核苷酸序列。
6.含如权利要求1 3任一项所述植物表达载体的转化体。
7.一种含权利要求1 3任一项所述植物表达载体的转基因植物的制备方法，包括以下步骤1)种皮和纤维特异表达启动子BAN的获得；2)生长素IAA合成相关基因的获得；3)将步骤1)中分离克隆到的特异启动子与步骤2)中分离克隆到的生长素合成相关基因进行融合，构建特异表达生长素合成相关基因的植物表达载体；4)将步骤幻得到的特异表达生长素合成相关基因的植物表达载体整合到棉花基因组中；5)将通过步骤4)获得的棉花进行进一步的培养，栽培，并获得转基因的棉花植株。
全文摘要
一种植物表达载体，其至少含有由植物生长素IAA生物合成相关的基因和特异性启动子BAN基因启动子组成的表达生长素IAA合成相关基因的核苷酸；所述植物生长素IAA生物合成相关基因为iaaM基因。所述植物表达载体在棉花纤维性状改良中的应用，实现了生长素合成酶基因在棉花种皮和纤维中的特异表达；从而显著提高了棉花纤维品质并增加了纤维数量，为棉花产业和纺织工业提供高品质的纤维。
文档编号C12R1/19GK102296085SQ20111024540
公开日2011年12月28日 申请日期2011年8月25日 优先权日2011年8月25日
发明者侯磊, 宋水清, 张瑞芝, 张觅, 李先碧, 裴炎, 魏媛 申请人:西南大学