专利名称：核酸等温扩增方法
技术领域：
本发明涉及核酸等温扩增方法，具体地涉及这样的核酸等温扩增方法，其中靶RNA 链到模板DNA链中的逆转录反应在具有该模板DNA链的扩增反应的一系列步骤(程序， procedure)中实施。
背景技术：
PCR(聚合酶链反应)已被用作核酸扩增方法的一种方法。在PCR中，模板DNA链通过包括(1)热变性、(2)退火和( 延伸反应的三个温度步骤的重复循环进行扩增。在第一个热变性步骤中，模板DNA链从双链离解成单链。用于该热变性的反应温度通常为约94°C。在第二个退火步骤中，寡核苷酸引物结合(退火)至单链模板DNA 链。退火温度通常为约50°C至60°C。在第三个延伸反应中，利用该寡核苷酸引物作为起源(origin)，DNA聚合酶合成与单链部分互补的DNA。用于延伸反应的反应温度通常为约 72 "C。对于基因表达水平分析和cDNA克隆，使用了 RT-PCR (逆转录-聚合酶链反应)，其中mRNA到cDNA中的逆转录反应在PCR之前实施。在RT-PCR中，已广泛使用单步骤RT-PCR， 其中在前的逆转录反应和接下来的扩增反应在一系列步骤中实施。在单步骤RT-PCR方法中，与处于表达分析或被克隆的RNA链(mRNA)互补的DNA 链(cDNA)首先通过逆转录反应合成。该反应利用保持在通常约42°C温度下的包含RNA链、 逆转录酶和逆转录寡核苷酸引物的反应溶液实施。在接下来的扩增反应中，利用合成的DNA 链作为模板实施PCR反应。通常选择用于该扩增反应的引物以在不同于用于逆转录的寡核苷酸引物的结合位点的位点处结合至RNA链(或模板DNA链)碱基序列。近年来，一种更容易的方法，称为等温扩增，已经被用作能够消除对于重复温度循环的需要的一种核酸扩增方法。例如，在LAMP(环介导等温扩增)中，模板核酸链与诸如寡核苷酸引物、链置换型DNA合成酶和核酸单体的试剂混合，并将该混合物保持在恒定温度 (在65°C附近)以进行该反应。关于本发明，Light-Triggered Polymerase Chain Reaction，Chem. Commun.， 2008,462-464描述了一种用于控制PCR反应的技术，其中利用在其碱基序列中包括连接了光可降解保护基团的胸腺嘧啶的寡核苷酸引物。在这种技术中，通过UV射线照射而离解的 6-硝基胡椒基氧甲基(6-nitropiperonyloxymethyl) (NPOM)基团用作光可降解保护基团 (光P華角军 呆护基，photodegradable protecting group)
发明内容
在等温扩增中也广泛采用在一系列步骤中实施逆转录反应和扩增反应的技术，如在单步骤RT-LAMP的情况下。然而，与PCR不同，LAMP参与在逆转录反应之后在恒定温度下进行的扩增反应。如已知的，单步骤RT-LAMP的一个缺点是较差的逆转录反应效率，其由通过链置换型DNA合成酶进行的扩增反应同时利用由逆转录酶促进的逆转录反应引起。降低的逆转录反应效率降低扩增反应中用作模板的核酸链的量，其结果是基因表达水平分析的准确性或克隆的效率可能会降低。因此，需要能够改善等温扩增中的逆转录反应的效率的方法，其中逆转录反应和扩增反应在一系列步骤中实施。本发明的一个实施方式提供了一种核酸等温扩增方法，其包括(1)实施逆转录反应以将靶RNA链逆转录到模板DNA链中；(2)用光照射反应溶液以离解结合至寡核苷酸引物的序列中的核苷酸的光可降解保护基团；以及⑶对该模板DNA链实施扩增反应。在本发明实施方式的核酸等温扩增方法中，寡核苷酸引物包括在其序列中的连接了光可降解保护基团的核苷酸，并因此该寡核苷酸引物与互补链的结合在(1)中被所述光可降解保护基团抑制。寡核苷酸引物仅在光可降解保护基团在O)中离解之后才在(3)中结合至该互补链。在该核酸等温扩增方法中，优选光可降解保护基团结合至该核苷酸的碱基部分， 并且例如使用6-硝基胡椒基氧甲基基团。扩增反应可以是LAMP。在这种情况下，连接了光可降解保护基团的核苷酸优选包括在寡核苷酸引物的序列中，该寡核苷酸参与使靶RNA链从模板DNA链脱离的同时合成互补DNA链的链置换反应。如本文中使用的，“核酸等温扩增反应”涵盖不涉及温度循环的各种各样的核酸扩增反应。该等温扩增反应涵盖用于核酸扩增的广泛的等温反应，包括例如LAMP(环介导等温扩增)、SMAP(Smart 扩增法(SMart Amplification Process)、NASBA(基于核酸序列的扩增，Nucleic Acid Sequence-Based Amplification)、ICAN (等温和嵌合弓I 物弓I 发的核酸扩增，Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids)、TRC(转录-逆转录协同，Transcription-Reverse Transcription Concerted)反应、SDA(链置换扩增，Strand Displacement Amplification)、TMA(转录介导扩增，Transcription-Mediated Amplification)和 RCA(滚环扩增，Rolling Circle Amplification)。这些核酸扩增反应包括这样的反应，如实时(RT) LAMP，其涉及核酸链的扩增与扩增的核酸链的量化。根据本发明实施方式的方法能够改善其中逆转录反应和扩增反应在一系列步骤中实施的等温扩增中的逆转录反应的效率。
图1是解释靶RNA链和寡核苷酸引物的序列的图示。图2是解释连接于核苷酸的6-硝基胡椒基氧甲基基团(NPOM)的光降解反应的图
7J\ ο图3是解释逆转录反应中的DNA合成的图示。图4A和图4B是解释在扩增反应早期的DNA合成反应的图示。
具体实施例方式以下参考附图描述本发明的优选实施方式。应当注意，以下描述的实施方式仅仅是本发明的举例说明，并且不应当解释为限制本发明的范围。将以以下顺序进行描述。
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1、根据第一实施方式的核酸等温扩增方法(1)寡核苷酸引物的设计(2)逆转录反应(3)光可降解保护基团的降解(4)扩增反应2、核酸等温扩增方法的变形例1、根据第一实施方式的核酸等温扩增方法根据本发明第一实施方式的核酸等温扩增方法包括(1)实施逆转录反应以将靶 RNA链逆转录到模板DNA链中；(2)用光照射反应溶液以离解结合至寡核苷酸引物序列中的核苷酸的光可降解保护基团；以及(3)对模板DNA链实施扩增反应。以下利用基于LAMP的RT-LAMP作为(3)中的扩增反应的一个实例，参考图1至图 4A和图4B具体地描述根据本发明第一实施方式的核酸等温扩增反应的步骤。(1)寡核苷酸引物的设计图1是示意性地举例说明靶RNA链(mRNA)和寡核苷酸引物(下文中，也简称为 “引物”)的序列的图示。在RT-LAMP，六个区域选自靶RNA链的序列，并设计了四种寡核苷酸引物。所选区域是从靶RNA链的5'端的F3、F2、Fl和Blc、B2c、B3c。具有与靶RNA链互补的碱基序列的模板DNA链(cDNA)具有分别与靶RNA链的六个区域互补的碱基序列的 F3c、F2c、Flc 和 B1、B2、B3。弓丨物BIP设计成具有与区域Blc和B2相同的碱基序列。序列B3具有与区域B3 相同的碱基序列。引物FIP具有与区域Flc和F2相同的碱基序列。引物F3设计成具有与区域F3相同的碱基序列。每个引物的链长度设置成具有根据逆转录反应和扩增反应的反应温度的恰当融化温度(Tm)。引物的融化温度设置成使得每个引物能够在逆转录反应和扩增反应的反应温度条件下结合至靶RNA或模板DNA。引物的链长度通常为约20个碱基(20mer)。引物B3和F3的序列包括结合至光可降解保护基团，具体地为6_硝基胡椒基氧甲基(NPOM)基团的核苷酸，如在附图中作为引物B3(笼状(Caged)和引物F3(笼状)示出的。图2表示连接至核苷酸的NPOM的光降解反应。NPOM结合至引物序列的核苷酸的碱基(这里，胸腺嘧啶(T))部分。核苷酸中的该碱基与互补碱基(这里，腺嘌呤(A))形成氢键。然而，氢键合(hydrogen bonding)在结合了 NPOM的核苷酸碱基处不发生，因为有助于氢键合的氢原子被NPOM取代。因此，在它们的序列中具有连接了 NPOM的核苷酸的引物与它们的互补链的键合力降低，并由此降低熔化温度。连接至碱基的NPOM通过在UV射线下发生降解而离解。离解NPOM使碱基游离 (free)，从而与其互补碱基形成氢键。因此，在NPOM已从引物序列中的核苷酸离解之后，引物恢复其与互补链的键合力，并且熔化温度升高。对引物序列中连接了 NPOM的核苷酸的数目没有特别限制，只要该引物的熔化温度在NPOM离解前后足够不同从而能够实现反应控制，如在下文描述的。连接了 NPOM的核苷酸的数目可以根据引物的链长度恰当选择。对于平均链长度(约20个碱基)，连接了 NPOM 的核苷酸的数目为1或2，或者甚至可以为3以上。
(2)逆转录反应图3示意性地表示逆转录反应中的DNA合成。在逆转录反应中，靶RNA链和反应溶液混合，并且该混合物保持在反应温度下以从靶RNA链合成模板DNA链。反应溶液包含例如链置换型DNA合成酶(例如Bst酶)、逆转录酶(例如AMV酶)、引物、核酸单体(dNTP)和缓冲溶质(buffer solute)。在逆转录反应中，引物BIP结合(退火)至靶RNA链的区域B2c，并且与靶RNA链互补的模板DNA链通过逆转录酶合成(参见图中的箭头)。注意，当图中所示的靶RNA链是由反义RNA链附带的有义链(sense strand)，相同逆转录反应从其中引物FIP已结合于反义RNA链的区域F2c的区域进行。逆转录反应在预定反应温度(例如40°C至65°C )下实施。能够选择任何反应温度，只要它落入在其中逆转录酶是活性的温度范围内。引物B3(笼状)和引物F3(笼状)由于在它们的序列中存在连接了 NPOM的核苷酸而具有低熔化温度。因此，引物B3和F3在逆转录温度下或在扩增反应温度下不能直接结合至靶RNA链(以下描述)。同样，仅引物BIP和FIP在逆转录反应中能够结合至靶RNA链，并且靶RNA链到模板DNA链中的逆转录反应利用这些引物作为起源有效地进行。(3)光可降解保护基团的降解在逆转录反应之后，反应溶液利用紫外射线照射以降解和离解连接于引物B3和 F3的序列中的核苷酸的ΝΡ0Μ。离解NPOM增高引物B3和F3的熔化温度。这使得引物B3和F3能够在扩增反应温度下结合至靶RNA链，如下描述的。(4)扩增反应图4A和图4B示意性地表示在扩增反应早期的DNA合成反应。在扩增反应中，NPOM离解之后的引物B3 (图中的引物B3 (未笼状化的 (uncaged)))结合在引物BIP的外侧上，并且当逆转录反应中从引物BIP延伸的模板DNA链从靶RNA链脱离时，合成新cDNA(参见图4A中的箭头)。当存在反义RNA链时，NPOM离解后的引物F3结合在引物FIP的外侧上，并且进行相同的链置换反应。为了简洁，以下仅描述有义链反应。然后，引物FIP结合至从弓丨物BIP延伸并从靶RNA链脱离的模板DNA链的区域F2c。 在引物FIP结合之后，与模板DNA链互补的DNA链利用引物FIP作为起源通过链置换型DNA 合成酶合成(参见图4B中的箭头)。然后，引物F3结合在引物FIP的外侧上，并且随着与模板DNA链互补且从引物FIP 通过链置换型DNA合成酶延伸的DNA链脱离而合成新DNA链(未示出)。脱离的与模板DNA 链互补的DNA链然后用作扩增循环的起源结构，从而以常规LAMP中的相同方式对该模板 DNA链进行扩增反应。扩增反应在预定反应温度(例如40°C至65°C )下实施。可以选择任意反应温度， 只要它落入其中链置换型DNA合成酶是活性的温度范围内。在根据本发明第一实施方式的核酸等温扩增方法中，NPOM连接于引物B3(和引物 F3)序列中的核苷酸以在逆转录中控制和防止引物B3(笼状)与靶RNA链结合(参见图3)。CN 102382814 A
说明书
5/5页 而且，通过在光可降解保护基团的降解中离解连接于引物B3序列中的核苷酸的ΝΡ0Μ，引物 B3 (未笼状化的)能够被控制而仅在扩增反应中结合至靶RNA链(参见图4A)。逆转录反应中引物B3与靶RNA链的结合，使得从引物BIP延伸的模板DNA链通过从已结合在引物BIP外侧上的引物B3延伸的cDNA脱离。而且，非特异性连接于靶RNA链的引物B3可以抑制从引物BIP合成模板DNA链。在这任一种情况下，逆转录反应的效率可能降低。根据本发明第一实施方式的核酸等温扩增方法控制NPOM的结合和离解，从而使得引物B3仅能够在扩增反应中结合至靶RNA链。因此可以通过引物B3与靶RNA链在逆转录反应中的结合而防止逆转录反应的效率降低。2、核酸等温扩增方法的变形例在前述第一实施方式中，通过连接了 NPOM的核苷酸仅存在于引物B3(和引物F3) 的序列中的情形描述了核酸等温扩增方法。然而，连接了 NPOM的核苷酸也可以存在于引物 BIP(和引物FIP)中。然而，要求引物B3包括比引物BIP更大数量的连接了 NPOM的核苷酸。具体地，引物B3需要通过包括更大数量的连接了 NPOM的核苷酸而具有更低的熔化温度。在这种情况下，能够通过使逆转录反应的反应温度比引物B3的熔化温度更高而控制引物B3不结合至靶RNA链。而且，通过使扩增反应的反应温度低于从NPOM游离的引物B3的熔化温度，能够控制引物B3在光可降解保护基团降解之后在扩增反应中结合至靶RNA链。而且，在前述实施方式中，通过利用NPOM作为光可降解保护基团描述了核酸等温扩增方法。然而，对光可降解保护基团没有特别限制，只要它能够结合至引物序列中的核苷酸的碱基部分从而抑制该碱基和互补碱基之间形成氢键，以及它能够通过光照射而降解而消除抑制作用。连接了光可降解保护基团的碱基不局限于胸腺嘧啶(T)，并且可以是腺嘌呤 (A)、胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)，取决于使用的保护基团。可以使用响应于光而经历构象(顺-反)变化的光响应物质(photoresponsive substance)来代替光可降解保护基团。这样的光响应物质可以例如是偶氮苯，其在核酸双链形成的光调控中具有用途，如在Photoregulation of DNA Triplex Formation by Azobenzene, J Am Chem Soc. 2002，Vol. 124，No. 9，p. 1877-83 中报道的。碱基对之间的氢键能够通过将偶氮苯结合至核苷酸的碱基部分或结合至核苷酸的链结构部分，以及通过光照射转化构象而变得稳定或不稳定。连接于偶氮苯的引物由此能够在构象变化前后具有不同的熔化温度，并且该反应能够以与连接了光可降解保护基团的引物的情形的相同方式被控制。根据本发明第一实施方式的核酸等温扩增方法能够改善逆转录反应的效率，并由此能够改善基因表达水平分析和克隆的准确性和效率。本发明包含与于2010年9月2日向日本专利局提交的日本在先专利申请JP 2010-196609中公开的主题相关的主题，将其全部内容结合于此供参考。本领域技术人员应当理解，根据设计要求和其他因素可以发生各种更改、组合、子组合和变形，只要它们在所附权利要求或其等同替换的范围内。
权利要求
1.一种核酸等温扩增方法，包括实施逆转录反应以将靶RNA链逆转录到模板DNA链中；用光照射反应溶液以离解结合至寡核苷酸引物的序列中的核苷酸的光可降解保护基团；以及对所述模板DNA链实施扩增反应。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述光可降解保护基团结合至所述核苷酸的碱基部分。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述光可降解保护基团是6-硝基胡椒基氧甲基基团。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述扩增反应是LAMP。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，结合了所述光可降解保护基团的所述核苷酸包含在参与使所述模板DNA链从所述靶RNA链脱离的同时合成互补DNA链的链置换反应的所述寡核苷酸引物的序列中。
全文摘要
本发明涉及核酸等温扩增方法。更具体地，涉及一种核酸等温扩增方法，包括实施逆转录反应以将靶RNA链逆转录到模板DNA链中；用光照射反应溶液以离解结合至寡核苷酸引物序列中的核苷酸的光可降解保护基团；以及对该模板DNA链实施扩增反应。本发明提供了一种能在以一系列步骤进行逆转录反应和扩增反应的等温扩增方法中有效进行逆转录反应的方法。
文档编号C12N15/10GK102382814SQ20111024559
公开日2012年3月21日 申请日期2011年8月24日 优先权日2010年9月2日
发明者世取山翼 申请人:索尼公司