专利名称：解淀粉芽孢杆菌凝乳酶冻干粉的制备方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，具体的说是一种解淀粉芽孢杆菌凝乳酶冻干粉的制备方法。
背景技术：
凝乳酶是干酪和干酪素生产过程中的关键性酶，其主要作用是专一性的剪切酪蛋白Wie 105-Met 106的肽键，从而使酪蛋白胶粒发生沉淀。凝乳酶主要有三种来源，分别为动物凝乳酶，植物凝乳酶和微生物凝乳酶。动物凝乳酶中使用最广泛的是小牛皱胃酶。随着干酪工业的发展，小牛皱胃酶来源不稳定，而且价格昂贵。植物凝乳酶分布于植株的果实、叶、茎和根等部位，但制成的干酪带有一定的苦味，而且成品得率较低，质地也稍软，致使商品价值很低。自1964年Arima首先发现了微小毛霉(Mucor microus)可以产凝乳性的蛋白酶， 并对其作了详细的研究以来，微生物凝乳酶就成为动物性凝乳酶替代品的研究重点。微生物具有生长周期短，生长速度快，生长条件易于控制，生产成本低等特点，目前各国的发酵工业都比较发达，发酵产物的提取工艺比较完善。因此，对由微生物所分泌的凝乳酶的研究和开发有广阔的前景。但目前已报道的细菌产生的凝乳酶很少，且大多活力较低。
发明内容
本发明的目的是提供一种凝乳酶液酶活高的解淀粉芽孢杆菌凝乳酶冻干粉的制备方法。使用的微生物
用来生产本发明所述的解淀粉芽孢杆菌凝乳酶冻干粉是一种解淀粉芽孢杆菌 (.Bacillus amyloliquefaciens) D4 CGMCC NO. 3290,在本申请人 2010. 01. 15 提交的 CN102041237A专利申请中已经提交微生物保藏。本发明提供的解淀粉芽孢杆菌凝乳酶的制备方法，是利用麸皮汁作为液体发酵培养基，采用本实验室分离的解淀粉芽孢杆菌为菌种制备发酵液，得到的发酵液经高速冷冻离心、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sephadex A-25离子交换层析和冷冻干燥得到凝乳酶。该制备方法为下列步骤
(1)种子液制备
将解淀粉芽孢杆菌D4 CGMCC NO. 3290的种子液接种到液体发酵培养基中，在37°C温度下，转速140 r/min的摇床中培养M小时，得到菌种种子液； 液体发酵培养基的制法如下
将麸皮按每20 g麸皮加入100 mL自来水的比例加水后煮沸10 min，过滤后用自来水补足原体积，得到麸皮汁，将所得的麸皮汁，115°C灭菌20min，室温下冷却至30°C作为液体发酵培养基；
(2)发酵液制备按3%的接种量，将菌种种子液加入到液体发酵培养基中，在37°C温度下，转速200 240r/min振荡培养48 60小时，得到菌种发酵液；
(3)发酵液的离心
将菌种发酵液在4°C、8000r/min条件下离心lOmin，得到菌种粗酶液；
(4)酶的分级沉淀
将硫酸铵烘干研细，取菌种粗酶液，向其中缓慢加入硫酸铵粉末至菌种粗酶液饱和度达到30%，在4°C温度下静置2小时后，以7000转/分钟转速离心lOmin，取上清液，继续加入硫酸铵粉末至菌种粗酶液饱和度达到70%，在4°C温度下静置2小时后，以8000转/分钟转速离心lOmin，沉淀溶于浓度0. Olmol/L的磷酸盐缓冲液中，磷酸盐缓冲液的pH值为 6. 8，在4°C温度下透析48小时；
(5)酶的膜过滤浓缩
将透析过的菌种粗酶液，用截留分子量为2万道尔顿的超滤膜除去大量的水分，即得菌种浓缩凝乳酶液；
(6)酶的冷冻干燥
在菌种浓缩凝乳酶液中加入冻干保护剂，冻干保护剂的加入比例按每IOOmL菌种浓缩凝乳酶液加入30g冻干保护剂的，与-20°C温度下预冷8小时，然后保持物料温度在-30°C 下干燥M小时，得到凝乳酶冻干粉；
(7)粉碎、包装
将凝乳酶冻干粉粉碎后进行包装。作为本发明制备方法的进一步改进，所述步骤(6)中采用的冻干保护剂的重量比组成为，甘氨酸环糊精甘露醇氯化钠=1 2 2 1。本发明将解淀粉芽孢杆菌凝乳酶发酵液，经硫酸铵分级沉淀、膜过滤浓缩、低温冷冻干燥和粉碎后得到凝乳酶冻干粉，其凝乳活力较CN102041237A直接发酵得到的凝乳酶液的酶活高190 200倍，同时由于使发酵生成的酶由液体变成固体，便于酶制剂的保存和运输。
具体实施例方式实施例1
将麸皮按每20 g麸皮加入100 mL自来水的比例加水后煮沸10 min，过滤后用自来水补足原体积，得到麸皮汁。将所得的麸皮分装到500mL三角瓶，115°C灭菌20min，室温下冷却至30°C作为液体发酵培养基。将解淀粉芽孢杆菌D4接种于液体发酵培养基中，37 140 r/min摇床培养M 小时，得到种子液。将种子液按3%的接种量，加入液体发酵培养基中，37°C、200r/min振荡培养48小时，得到发酵液。将发酵液在4°C、8000r/min条件下离心lOmin，得到粗酶液，测得凝乳活力为2310. 5SU/mL。将硫酸铵烘干研细，向粗酶液中缓慢加入硫酸铵粉末至其饱和度达到30%，4°C静置2小时后，以7000转/分钟离心lOmin，取上清液，继续加入硫酸铵粉末至其饱和度达到 70%，4°C静置2小时后，以8000转/分钟离心lOmin，沉淀溶于0. Olmol/L, pH6. 8的磷酸盐缓冲液中，4°C透析48小时，测得凝乳活力为2276. 5SU/mL。
将透析过的粗酶液，用截留分子量为2万道尔顿的超滤膜除去大量的水分，即得浓缩酶液，凝乳活力达四594. 5SU/mL。在浓缩酶液中按每IOOmL酶液加入30g冻干保护剂的比例加入冻干保护剂，冻干保护剂的重量比组成为，甘氨酸环糊精甘露醇氯化钠=1 2 2 1，-20°C预冷8小时， 然后保持物料温度在-30°C干燥M小时，得到冻干物料粉碎后得到精制凝乳酶，凝乳活力达45^20. 5SU/g，是直接发酵后所得粗酶液酶活(2310. 5SU/mL)的195. 98倍。实施例2
将麸皮按每20 g麸皮加入100 mL自来水的比例加水后煮沸10 min，过滤后用自来水补足原体积，得到麸皮汁。将所得的麸皮分装到500mL三角瓶，115°C灭菌20min，室温下冷却至30°C作为液体发酵培养基。将解淀粉芽孢杆菌D4接种于液体发酵培养基中，37 140 r/min摇床培养M 小时，得到种子液。将种子液按3%的接种量，加入液体发酵培养基中，37°C、240r/min振荡培养讨小时，得到发酵液。将发酵液在4°C、8000r/min条件下离心lOmin，得到粗酶液，测得凝乳活力为2336. 5SU/mL。将硫酸铵烘干研细，向粗酶液中缓慢加入硫酸铵粉末至其饱和度达到30%，4°C静置2小时后，以7000转/分钟离心lOmin，取上清液，继续加入硫酸铵粉末至其饱和度达到 70%，4°C静置2小时后，以8000转/分钟离心lOmin，沉淀溶于0. Olmol/L, pH6. 8的磷酸盐缓冲液中，4°C透析48小时，测得凝乳活力为2318. 5SU/mL。将透析过的粗酶液，用截留分子量为2万道尔顿的超滤膜除去大量的水分，即得浓缩酶液，凝乳活力达30139. 5SU/mL。在浓缩凝乳液中按每IOOmL酶液加入30g冻干保护剂的比例加入冻干保护剂，冻干保护剂的重量比组成为，甘氨酸环糊精甘露醇氯化钠=1 2 2 1，-20°C预冷8小时，然后保持物料温度在-30°C干燥M小时，得到冻干物料粉碎后得到精制凝乳酶，凝乳活力达453418. 5SU/g，是直接发酵后所得粗酶液酶活(2336. 5SU/mL)的194. 05倍。实施例3
将麸皮按每20 g麸皮加入100 mL自来水的比例加水后煮沸10 min，过滤后用自来水补足原体积，得到麸皮汁。将所得的麸皮分装到500mL三角瓶，115°C灭菌20min，室温下冷却至30°C作为液体发酵培养基。将解淀粉芽孢杆菌D4接种于液体发酵培养基中，37 °C,140 r/min摇床培养M 小时，得到种子液。将种子液按3%的接种量，加入液体发酵培养基中，37°C、220r/min振荡培养60小时，得到发酵液。将发酵液在4°C、8000r/min条件下离心lOmin，得到粗酶液，测得凝乳活力为2318. 5SU/mL。将硫酸铵烘干研细，向粗酶液中缓慢加入硫酸铵粉末至其饱和度达到30%，4°C静置2小时后，以7000转/分钟离心lOmin，取上清液，继续加入硫酸铵粉末至其饱和度达到 70%，4°C静置2小时后，以8000转/分钟离心lOmin，沉淀溶于0. Olmol/L, pH6. 8的磷酸盐缓冲液中，4°C透析48小时，测得凝乳活力为2312. 5SU/mL。将透析过的粗酶液，用截留分子量为2万道尔顿的超滤膜除去大量的水分，即得浓缩酶液，凝乳活力达30101. 5SU/mL。在浓缩凝乳液中按每IOOmL酶液加入30g冻干保护剂的比例加入冻干保护剂，冻干保护剂的重量比组成为，甘氨酸环糊精甘露醇氯化钠=1 2 2 1，-20°C预冷8小时，然后保持物料温度在-30°C干燥M小时，得到冻干物料粉碎后得到精制凝乳酶，凝乳活力达453220. 5SU/g，是直接发酵后所得粗酶液酶活(2318. 5SU/mL)的195. 48倍。
权利要求
1.一种解淀粉芽孢杆菌凝乳酶冻干粉的制备方法，其特征在于该制备方法为下列步骤(1)种子液制备将解淀粉芽孢杆菌D4 CGMCC NO. 3290的种子液接种到液体发酵培养基中，在37°C温度下，转速140 r/min的摇床中培养M小时，得到菌种种子液；液体发酵培养基的制法如下将麸皮按每20 g麸皮加入100 mL自来水的比例加水后煮沸10 min，过滤后用自来水补足原体积，得到麸皮汁，将所得的麸皮汁，115°C灭菌20min，室温下冷却至30°C作为液体发酵培养基；(2)发酵液制备按3%的接种量，将菌种种子液加入到液体发酵培养基中，在37°C温度下，转速200 240r/min振荡培养48 60小时，得到菌种发酵液；(3)发酵液的离心将菌种发酵液在4°C、8000r/min条件下离心lOmin，得到菌种粗酶液；(4)酶的分级沉淀将硫酸铵烘干研细，取菌种粗酶液，向其中缓慢加入硫酸铵粉末至菌种粗酶液饱和度达到30%，在4°C温度下静置2小时后，以7000转/分钟转速离心lOmin，取上清液，继续加入硫酸铵粉末至菌种粗酶液饱和度达到70%，在4°C温度下静置2小时后，以8000转/分钟转速离心lOmin，沉淀溶于浓度0. 01moI/L的磷酸盐缓冲液中，磷酸盐缓冲液的pH值为 6. 8，在4°C温度下透析48小时；(5)酶的膜过滤浓缩将透析过的菌种粗酶液，用截留分子量为2万道尔顿的超滤膜除去大量的水分，即得菌种浓缩凝乳酶液；(6)酶的冷冻干燥在菌种浓缩凝乳酶液中加入冻干保护剂，冻干保护剂的加入比例按每IOOmL菌种浓缩凝乳酶液加入30g冻干保护剂的，与-20°C温度下预冷8小时，然后保持物料温度在-30°C 下干燥M小时，得到凝乳酶冻干粉；(7)粉碎、包装将凝乳酶冻干粉粉碎后进行包装。
2.如权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌凝乳酶冻干粉的制备方法，其特征在于所述步骤 (6)中采用的冻干保护剂的重量比组成为，甘氨酸环糊精甘露醇氯化钠=1 2 2 1。
全文摘要
本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌凝乳酶冻干粉的制备方法。本发明采用解淀粉芽孢杆菌D4为菌种，进行液态发酵，发酵液经高速冷冻离心、硫酸铵分级沉淀、膜过滤浓缩、低温冷冻干燥和粉碎后得到凝乳酶。本发明以廉价的农副产品麸皮等为主要原料，采用液体发酵方法生产凝乳酶，工艺流程短、成本低、工业化生产效率高、酶活力高，同时由于使发酵生成的酶由液体变成固体，便于酶制剂的保存和运输。
文档编号C12N9/54GK102321601SQ201110248559
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月26日 优先权日2011年8月26日
发明者乔海军, 张卫兵, 张炎, 梁琪, 甘伯中, 米兰 申请人:甘肃农业大学