专利名称：一种山羊传染性胸膜肺炎的快速检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及检测山羊支原体山羊肺炎亚种基因组DNA的环介导等温扩增技术，具体说是一种山羊传染性胸膜肺炎的快速检测试剂盒，本发明还包括该试剂盒的制备方法。
背景技术：
目前常用的诊断山羊传染性胸膜肺炎的方法包括凝集和PCR，这些方法都有一定的缺点。凝集试验主要是间接血凝法，该方法的缺点是检测灵敏度低，会出现漏检的情况； 而且这种方法是针对山羊传染性胸膜肺炎抗体检测，检测为阳性的动物可能是接种支原体疫苗引起的。PCR和LAMP方法都是基于分子生物学基础上的灵敏、特异、高效新型诊断技术。但山羊传染性胸膜肺炎PCR过程比较复杂，在扩增以后要进行酶切鉴定才能确定是否为阳性，并且该方法需要昂贵的PCR仪来配合使用，反应的时间长，反应后需要进行琼脂糖凝胶电泳用凝胶呈像仪观察结果，且在动物基因组DNA提取过程中，可能会有一些遗留的 PCR反应的抑制因子影响其特异性和敏感性。
发明内容
本发明的目的是为了克服当前山羊传染性胸膜肺炎诊断技术中的不足，提供一种基于分子生物学领域的的高敏感性、高特异性、高效性、操作简单的山羊传染性胸膜肺炎快速检测试剂盒，同时提供该试剂盒的制备方法。一种山羊传染性胸膜肺炎的快速检测试剂盒，包括2XLAMP反应液、引物混合物、 BstDNA聚合酶、显色剂、标准阳性模板以及dd H2O,所述引物混合物包括上游内部引物 FIP、下游内部引物BIP、上游外部引物F3、下游外部引物B3，各引物的配比为FIP =BIP :F3 B3=8 8 1 :1ο所述引物针对山羊支原体山羊肺炎亚种标准株F38 Η2基因设计，引物序列为 上游内部引物FIP (Flc+F2)
5 ‘ -TGCTGGTGAATATTTTGTAGCAGGT-TTTT-AAGCCCAAAGTTAATATACCTTGA -3 ‘ 下游外部引物BIP (Blc+B2)
5 ‘ -CAACACCAGATTCAAAGAAAGGTTT-TTTT-GAGTTGAAAGCTTTTTAGATTGT -3 ‘ 上游外部引物 F3: 5 ‘ -ACAACCTAAAGAGATTATTCACTC-3 ‘ 下游外部引物 Β3: 5 ‘ -AACTTGACTTCCAACAACAA-3 ‘
所述2XLAMP反应液包括4% pH8. 8的三羟甲基氨基乙烷(Tris-HCl )、20mM氯化钾 (KCl)、16mM 硫酸镁(MgSO4)、20mM 硫酸铵((NH4) 2S04)、0· 2% 吐温 20 (Tween 20)、2· 8mM 脱氧核苷酸混合物(dNTPs)和1.6M甜菜碱。所述山羊传染性胸膜肺炎的快速检测试剂盒的制备方法如下
(1)制备2 X LAMP反应液①配置Tris-HCl 配置浓度为12. 11% Tris，并用HCl调节pH8. 8，备用 逸配置含有终浓度为22. 2mM的KCl、17. 8mM的MgSO4、22. 2mM的(NH4)2SO4和
1. 78M的甜菜碱的混合溶液，并加入0. 22% Tween 20和4. 4%的Tris-HCl，备用；③将②中配置的溶液与25mM dNTPs按照体积比为9 1的比例混合；
a、制备2 X LAMP反应液①配置1Tris-HCl 配置浓度为12. 11% Tris,并用HCl调节
pH8. 8，备用(2)配置含有终浓度为 22. 2mM 的 KCl、17. 8mM 的 MgSO4、22. 2mM 的(NH4)2SO4 和
1. 78M的甜菜碱的混合溶液，并加入0. 22% Tween 20和4. 4%的Tris-HCl，备用；③将Cg中配置的溶液与25mM dNTPs按照体积比为9 1的比例混合；
(2)制备引物混合物(!)针对山羊支原体山羊肺炎亚种H2基因的一段高度保守的区
域设计引物；②混合引物中FIP =BIP :F3 :B3为8 :8 :1 :1，按照如上体积比例混勻。(3)制备标准阳性模板①将山羊支原体山羊肺炎亚种标准株F38接种于改良
KM2液体试管培养基，置37°C培养箱培养，待颜色发生变化，由红色变为黄色后进行扩大培养接种于30ml液体培养基中，置37°C培养箱中进行培养，待颜色发生变化，由红色变为黄
色后收集菌体；将培养物置4°C离心机12000rpm离心30min，弃上清，用PH7. 2PBS缓冲
液以同样条件离洗3次；③提取F38基因组DNA，此为标准阳性模板。反应体系为50% 2 X LAMP反应液、3. 6%引物混合物、0. 4% BstDNA聚合酶、8%标准阳性模板以及；34.4% dd H2O0反应条件为65°〇，211;801，51^11;41，永久保存。反应后按体积比为25 :1将LAMP产物与显色剂混合，观察颜色变化，判断结果。本发明是建立在分子生物学基础上，基于山羊支原体山羊肺炎亚种H2基因，应用环介导等温扩增(LAMP)的方法快速检测山羊传染性胸膜肺炎的试剂盒，具有敏感性高、特异性强、反应迅速、操作简单等特点，不需要特殊的仪器设备，解决了山羊传染性胸膜肺炎检测时间长、工作量大、操作复杂等缺陷，可以用于检测临床样本是否感染山羊支原体山羊肺炎亚种，以及山羊传染性胸膜肺炎的早期诊断和分子流行病学调查。
具体实施例方式一种山羊传染性胸膜肺炎的快速检测试剂盒，包括2XLAMP反应液、引物混合物、BstDNA聚合酶、显色剂以及标准阳性模板。2XLAMP 反应液包括4% Tris-HCl (pH8.8)、20mM KCl、16mM MgSO4,20mM (NH4) 2S04、0. 2% Tween 20,2. 8mM dNTPs 和 1· 6M 甜菜碱。
引物混合物包括
40pmol上游内部引物FIP、40pmol下游内部引物BIP、5pmol上游外部引物F3、5pmol下 游外部引物B3。下面结合实施例对本发明做进ー步详细说明 实施例1
(I)制备LAMP反应液
①配置Tris-HCl 称取121. Ig Tris于800mLddH20中溶解，用HCl调节pH8. 8，定容至 lOOOmL，备用；
称取 1. 49g KCl、3. 96g MgSO4 7H20、2. 64g (NH4) 2S04、187. 4g 甜菜碱，并加入 40mL①中配置的Tris-HCl以及2mL Tween 20，加dd H2O定容至900 mL，备用； 取900iiL(|)中配置的溶液，加入100iiL25mM dNTPs，混勻。⑵制备引物混合物
①针对山羊支原体山羊肺炎亚种H2的一段高度保守的区域，利用I^rimer Expolorer V4在线软件设计引物；
混合引物包括22. 4ii L FIP和BIP、2. 8iiL F3和B3，混勻。⑶制备标准阳性模板
①将山羊支原体山羊肺炎亚种标准株F38接种于改良KM2液体试管培养基，置37°C
培养箱培养，待颜色发生变化，由红色变为黄色后进行扩大培养接种于30ml液体培养基 中，置37°C培养箱中进行培养，待颜色发生变化，由红色变为黄色后收集菌体；
②将培养物置4°C离心机12000rpm离心30min，弃上清，用PH7.2PBS缓冲液以同样 条件离洗3次；
③提取F38基因组DNA，此为标准阳性模板。检测时按照如下反应体系 LAMP反应液 12. 5 U L BstDNA聚合酶 1 U L引物混合物0. 9 U L
权利要求
1.一种山羊传染性胸膜肺炎的快速检测试剂盒，包括2XLAMP反应液、引物混合物、 BstDNA聚合酶、显色剂、标准阳性模板以及dd H2O,其特征在于所述引物混合物包括上游内部引物FIP、下游内部引物BIP、上游外部引物F3、下游外部引物B3，各引物的配比为FIP: BIP :F3 :B3=8 :8 :1 :1。
2.根据权利要求1所述的山羊传染性胸膜肺炎的快速检测试剂盒，其特征在于所述的引物针对山羊支原体山羊肺炎亚种标准株F38 H2基因设计，所述引物序列为上游内部引物FIP (Flc+F2)5 ‘ -TGCTGGTGAATATTTTGTAGCAGGT-TTTT-AAGCCCAAAGTTAATATACCTTGA -3 ‘下游外部引物BIP (Blc+B2)5 ‘ -CAACACCAGATTCAAAGAAAGGTTT-TTTT-GAGTTGAAAGCTTTTTAGATTGT -3 ‘上游外部引物 F3: 5 ‘ -ACAACCTAAAGAGATTATTCACTC-3 ‘下游外部引物 B3: 5 ‘ -AACTTGACTTCCAACAACAA-3 ‘。
3.根据权利要求1所述的山羊传染性胸膜肺炎的快速检测试剂盒，其特征在于所述 2XLAMP 反应液包括 4% ρΗ8· 8 的 Tris-HCl、20mM KCl、16mM MgS04、20mM (NH4)2SO4^O. 2% Tween 20、2. 8mM dNIPs 和 1.6M 甜菜碱。
4.一种根据权利要求1所述山羊传染性胸膜肺炎肺炎的快速检测试剂盒的制备方法， 其特征在于按下述工艺方法制备a、制备2X LAMP反应液① 配置Tris-HCl 配置浓度为12. 11% Tris，并用HCl调节pH8. 8，备用O配置含有终浓度为22. 2mM的KCl、17. 8mM的MgSO4,22. 2mM的(NH4) 2S04和1. 78M的甜菜碱的混合溶液，并加入0. 22% Tween 20和4. 4%的Tris-HCl，备用；③将②中配置的溶液与25mM dNTPs按照体积比为9 1的比例混合；b、制备引物混合物①针对山羊支原体山羊肺炎亚种标准株F38H2基因的一段高度保守的区域设计引物；②混合引物中FIP =BIP :F3 :B3为8 :8 :1 :1，按照如上体积比例混勻；C、制备标准阳性模板①将山羊支原体山羊肺炎亚种标准株F38接种于改良KM2液体试管培养基，置37°C培养箱培养，待颜色发生变化，由红色变为黄色后进行扩大培养接种于30ml液体培养基中，置37°C培养箱中进行培养，待颜色发生变化，由红色变为黄色后收集菌体；②将培养物置4°C离心机12000rpm离心30min，弃上清，用PH7. 2PBS缓冲液以同样条件离洗3次；③提取F38基因组DNA，此为标准阳性模板。
全文摘要
一种山羊传染性胸膜肺炎的快速检测试剂盒及其制备方法，建立在分子生物学基础上，包括2×LAMP反应液、引物混合物、BstDNA聚合酶、显色剂、标准阳性模板以及ddH2O，所述引物混合物包括上游内部引物FIP、下游内部引物BIP、上游外部引物F3、下游外部引物B3，各引物的配比为FIP∶BIP∶F3∶B3=8∶8∶1∶1。本发明的试剂盒具有敏感性高、特异性强、反应迅速、操作简单等特点，不需要特殊的仪器设备，解决了山羊传染性胸膜肺炎病原分离时间长、工作量大及检测方法繁琐操作复杂等缺陷。可以用于检测临床样本是感染山羊肺炎支原体山羊肺炎亚种，以及山羊传染性胸膜肺炎的早期诊断和分子流行病学调查。
文档编号C12Q1/04GK102277439SQ20111024856
公开日2011年12月14日 申请日期2011年8月26日 优先权日2011年8月26日
发明者储岳峰, 张念章, 贺英, 赵萍, 逯忠新, 高鹏程 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所