专利名称：一种dpyd基因多态性检测特异性引物和液相芯片的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种DPYD基因多态性检测特异性引物和液相芯片。
背景技术：
氟尿嘧啶(5-Fu)是各种肿瘤治疗中应用最为广泛的抗肿瘤药物之一。体内80%以上的5-Fu在肝脏内经由二氢嘧啶脱氢酶(DPD)分解代谢。二氢嘧啶脱氢酶基因(DPYD基因)所编码的二氢嘧啶脱氢酶(DB)酶)是氟化嘧啶类抗肿瘤药物代谢的主要限速酶，其活性存在显著的个体差异，并因此影响药物的疗效和毒副作用，有研究表明，DPYD基因的多态性与其编码的酶活显著相关。本发明目标检测的DPYD基因突变位点，如表所示
序号DPYD位点突变的内容简写
SEQ ID NO. 29的第55位核苷酸，发生G — A突变G55A
~2SEQ ID NO. 30的第141位核苷酸，发生G — A突变G141A
~SEQ ID NO. 31的第134位核苷酸，发生G — T突变G134TSEQ ID NO. 29-SEQ ID NO. 31 的组成如下SEQ ID NO. 29CACCAAGGTCCTTCATTAGCTCAATCTCAAAATTCACTACATCATACGGCAGCCGGAACTGAGGAATTTCAGAAGTACTGAAAAGAAAGGAGAAAGAAAAACAGGCATCAGTAGAAAAATGACCAATCTTTGACCAATCTTAAAAAAAGGTAACATGTCTTTATGGATTAGTAGAAAATAAATATCTCTTCCAAGGATATTTATATATCACACAAGATATGCATGAGGACA。SEQ ID NO. 30TCCCTAGACACACATTTGTTTGTTGATAATATTTATATGTTTATATCTTCCCATTTTTCTCTTCTCTGAGCTAACATGCTTCCTTATTTGTGTGTTTTCCTTTTAGAAACTGCCAAGTTTTGGACCTTATCTGGAACAGCGCAAGAAAATCATAGCAGAAAACAAGATTAGACTGAAAGAACAAAATGTAGCTTTTTCACCACTTAAGAGAAACTGTTTTATCCCCAAAAGGCCTATTCCTACCATCAAGGTAAAAATTATGCCAACoSEQ ID NO. 31 GGGGACATTGTTGACCTTTGTGGTCAGTGACATCAATACCCTCTATTTCTGTTTGCAGGCTATACAGTTTGATCCAGAAACCCACCTGCCCACCATAACCGACACTTGTACAGGCTGTACTCTGTGTCTCAGTGTTTGCCCTATTGTCGACTGCATCAAAATGGTTTCCAGGACAACACCTTATGAACCAAAGAGAGGCGTACCCTTATCTGTGAATCCGGTGTGTTAAGGTGATTTGTGAAACAGTTGCTGTGAACTTTCATGTCACCTACATATGCTGATCTTTTAAAATCATGATCCTTGTGTTCAGCTCTTTCC。目前，对DPYD基因多态性进行检测、分析的方法主要有直接测序法和实时荧光定量PCR技术，直接测序法灵敏度只有20%-25%,操作复杂，时效性差，不能满足实际应用的需要，尤其是对于异质性的肿瘤体细胞突变，低灵敏度将导致大量的漏检；而实时荧光定量PCR技术，其灵敏度达到1% _2%，检测效率高，时效性强，但其高居不下的假阳性率也为实际应用所诟病。再次，以上这些方法都存在着检测通量的局限性，每次只能检测一种突变类型，不能满足实际应用的需要。
发明内容
本发明的目的之一是提供DPYD基因多态性检测液相芯片，该液相芯片可用于并行或单项检测DPYD基因三种常见基因型G55A、G141A和G134T的野生型和突变型。实现上述目的的技术方案如下。 一种DPYD基因多态性检测液相芯片，包括有(A).针对DPYD基因不同多态性位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因多态性位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为针对G55A位点的SEQ ID NO. 7及SEQ ID NO. 8 ;针对G141A位点的SEQ ID NO. 9 及 SEQ ID NO. 10 ;和 / 或针对 G134T 位点的 SEQ ID NO. 11 及 SEQ ID NO. 12 ；所述 tag 序列选自 SEQ ID NO. I SEQ ID NO. 6 ；(B).有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO. 13 SEQ ID NO. 18，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；(C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。优选地，所述扩增引物为针对G55A位点的SEQ ID NO. 19及SEQ ID NO. 20 ;针对G141A 位点的 SEQ ID NO. 21 及 SEQ ID NO. 22 ;和 / 或针对 G134T 位点的 SEQ ID NO. 23 及SEQ IDN0. 24。优选地，所述ASPE弓丨物为针对G55A位点的由SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 7组成的序列及由SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 8组成的序列；针对G141A位点的由SEQ ID NO. 3和SEQ IDN0. 9组成的序列及由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 10组成的序列；和/或针对G134T位点的由SEQID NO. 5和SEQ ID NO. 11组成的序列及由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 12组成的序列。本发明的另一目的是提供用于DPYD基因多态性检测的特异性引物。实现上述目的的技术方案如下用于DPYD基因多态性检测的特异性引物，包括有针对G55A位点的SEQ ID NO. 7及 SEQID NO. 8 ;针对 G141A 位点的 SEQ ID NO. 9 及 SEQ ID NO. 10 ;和 / 或针对 G134T 位点的 SEQ IDNO. 11 及 SEQ ID NO. 12。本发明的主要优点在于I.本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达100%，且检测所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。所制备的DPYD基因多态性检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、anti-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个SNP位点的并行检测。
2.本发明通过发明人长期积累的设计经验和大量的实验操作，从众多的特异性引物中选取了最优的组合。本发明设计的ASPE引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标检测的突变位点，准确区分各种型别的基因型；在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，检测特异性好，交叉反应率低于3% ;除了能够检测单个位点突变情况，也能够同时并行检测多个突变位点的多态性情况，检测效果一致。3.本发明的检测方法步骤简单，三种多态性位点检测可通过一步多重PCR即可完成三个含有SNP位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备 微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
具体实施例方式实施例I DPYD基因多态性检测液相芯片，主要包括有一、ASPE 引物针对DPYD基因三种常见基因型G55A、G141A和G134T的野生型和突变型，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“ tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE弓丨物序列如下表所示表I DPYD基因的ASPE弓丨物序列(tag序列+特异性引物序列)
权利要求
1.一种DPYD基因多态性检测液相芯片，其特征是，包括有 (A).针对DPYD基因不同多态性位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因多态性位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为针对G55A位点的SEQ ID NO. 7及SEQ ID NO. 8 ;针对G141A位点的SEQ ID NO. 9 及 SEQ ID NO. 10 ;和 / 或针对 G134T 位点的 SEQ ID NO. 11 及 SEQ ID NO. 12 ；所述 tag 序列选自 SEQ ID NO. I SEQ ID NO. 6 ； (B).有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO. 13 SEQ ID NO. 18，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对； (C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。
2.根据权利要求I所述的DPYD基因多态性检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物为针对 G55A 位点的 SEQ ID NO. 19 及 SEQ ID NO. 20 ;针对 G141A 位点的 SEQ ID NO. 21 及 SEQIDNO. 22 ;和 / 或针对 G134T 位点的 SEQ ID NO. 23 及 SEQ ID NO. 24。
3.根据权利要求I所述的DPYD基因多态性检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物为针对G55A位点的由SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 7组成的序列及由SEQ ID NO. 2和SEQID NO. 8组成的序列；针对G141A位点的由SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 9组成的序列及由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 10组成的序列；和/或针对G134T位点的由SEQ ID NO. 5和SEQID NO. 11组成的序列及由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 12组成的序列。
4.根据权利要求I所述的DPYD基因多态性检测液相芯片，其特征是， (A).所述ASPE引物为针对G55A位点的由SEQID NO. I和SEQ ID NO. 7组成的序列及由SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 8组成的序列；针对G141A位点的由SEQ ID NO. 3和SEQID NO. 9组成的序列及由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 10组成的序列；和针对G134T位点的由SEQ IDNO. 5和SEQ ID NO. 11组成的序列及由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 12组成的序列； (B).有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO. 13 SEQ ID NO. 18，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对； (C).所述扩增引物为:针对G55A位点的SEQID NO. 19及SEQ ID NO. 20 ;针对G141A位点的 SEQ ID NO. 21 及 SEQ ID NO. 22 ;和针对G134T位点的 SEQ ID NO. 23及 SEQ ID NO. 24。
5.根据权利要求1-4任一项所述的DPYD基因多态性检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂为5-10个T。
6.一种用于DPYD基因多态性检测的特异性引物，其特征是，所述特异性引物序列为针对 G55A 位点的 SEQ ID NO. 7 及 SEQ ID NO. 8 ;针对 G141A 位点的 SEQ ID NO. 9 及 SEQ IDNO. 10 ;和 / 或针对 G134T 位点的 SEQ ID NO. 11 R SEQ ID NO. 12。
全文摘要
本发明公开了一种DPYD基因检测特异性引物和液相芯片，该液相芯片主要包括有每种由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成的ASPE引物，所述特异性引物序列为针对G55A位点的SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8；针对G141A位点的SEQ IDNO.9及SEQ ID NO.10；和/或针对G134T位点的SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12；有anti-tag序列包被的微球；扩增引物。本发明所提供的检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％，实现多个突变位点的野生型和突变型并行检测。
文档编号C12N15/11GK102952866SQ201110251209
公开日2013年3月6日 申请日期2011年8月29日 优先权日2011年8月29日
发明者许嘉森, 吴诗扬 申请人:广州益善生物技术有限公司